Vector (molecular)

En la clonación molecular, un vector es cualquier partícula (p. ej., plásmidos, cósmidos, fagos lambda) utilizada como vehículo para transportar artificialmente una secuencia nucleica extraña, generalmente ADN, a otra célula, donde puede replicarse y/o expresarse. Un vector que contiene ADN extraño se denomina ADN recombinante. Los cuatro tipos principales de vectores son plásmidos, vectores virales, cósmidos y cromosomas artificiales. De estos, los vectores más utilizados son los plásmidos. Comunes a todos los vectores modificados tienen un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple y un marcador seleccionable.

El vector en sí generalmente lleva una secuencia de ADN que consta de un inserto (en este caso, el transgén) y una secuencia más grande que sirve como "columna vertebral" del vector. El propósito de un vector que transfiere información genética a otra célula es típicamente aislar, multiplicar o expresar el inserto en la célula diana. Todos los vectores pueden usarse para la clonación y, por lo tanto, son vectores de clonación, pero también hay vectores diseñados especialmente para la clonación, mientras que otros pueden diseñarse específicamente para otros fines, como la transcripción y la expresión de proteínas. Los vectores diseñados específicamente para la expresión del transgén en la célula diana se denominan vectores de expresión y, por lo general, tienen una secuencia promotora que dirige la expresión del transgén. Los vectores más simples llamados vectores de transcripción solo pueden transcribirse pero no traducirse: pueden replicarse en una célula objetivo pero no expresarse, a diferencia de los vectores de expresión. Los vectores de transcripción se utilizan para amplificar su inserción.

La manipulación del ADN se realiza normalmente sobre vectores de E. coli, que contienen elementos necesarios para su mantenimiento en E. coli. Sin embargo, los vectores también pueden tener elementos que les permitan mantenerse en otro organismo, como levaduras, células vegetales o de mamíferos, y estos vectores se denominan vectores lanzadera. Dichos vectores tienen elementos bacterianos o virales que pueden transferirse al organismo huésped no bacteriano; sin embargo, también se han desarrollado otros vectores denominados vectores intragénicos para evitar la transferencia de cualquier material genético de una especie exótica.

La inserción de un vector en la célula diana suele denominarse transformación para células bacterianas, transfección para células eucariotas, aunque la inserción de un vector viral a menudo se denomina transducción.

Características

Plásmidos

Los plásmidos son secuencias de ADN extracromosómicas y generalmente circulares de doble cadena que son capaces de replicarse utilizando la maquinaria de replicación de la célula huésped. Los vectores de plásmidos consisten minimalistamente en un origen de replicación que permite la replicación semiindependiente del plásmido en el huésped. Los plásmidos se encuentran ampliamente en muchas bacterias, por ejemplo, en Escherichia coli, pero también se pueden encontrar en algunos eucariotas, por ejemplo, en levaduras como Saccharomyces cerevisiae. Los plásmidos bacterianos pueden ser conjugativos/transmisibles y no conjugativos:

• conjugativo: media la transferencia de ADN a través de la conjugación y, por lo tanto, se propaga rápidamente entre las células bacterianas de una población; por ejemplo, plásmido F, muchos plásmidos R y algunos col.
• no conjugativo: no median el ADN a través de la conjugación, por ejemplo, muchos plásmidos R y col.

Los plásmidos con características especialmente construidas se usan comúnmente en el laboratorio con fines de clonación. Estos plásmidos generalmente no son conjugativos pero pueden tener muchas más características, en particular un "sitio de clonación múltiple" en el que múltiples sitios de escisión de enzimas de restricción permiten la inserción de un inserto transgénico. Las bacterias que contienen los plásmidos pueden generar millones de copias del vector dentro de la bacteria en cuestión de horas, y los vectores amplificados pueden extraerse de la bacteria para su posterior manipulación. Los plásmidos pueden usarse específicamente como vectores de transcripción y dichos plásmidos pueden carecer de secuencias cruciales para la expresión de proteínas. Los plásmidos utilizados para la expresión de proteínas, llamados vectores de expresión, incluirían elementos para la traducción de proteínas, como un sitio de unión al ribosoma, codones de inicio y finalización.

Vectores virales

Los vectores virales son generalmente virus modificados genéticamente que llevan ADN o ARN viral modificado que se ha convertido en no infeccioso, pero aún contienen promotores virales y también el transgén, lo que permite la traducción del transgén a través de un promotor viral. Sin embargo, debido a que los vectores virales frecuentemente carecen de secuencias infecciosas, requieren virus auxiliares o líneas de empaquetamiento para la transfección a gran escala. Los vectores virales a menudo se diseñan para la incorporación permanente del inserto en el genoma del huésped y, por lo tanto, dejan marcadores genéticos distintos en el genoma del huésped después de incorporar el transgén. Por ejemplo, los retrovirus dejan un patrón de integración retroviral característico después de la inserción que es detectable e indica que el vector viral se ha incorporado al genoma del huésped.

Cromosomas artificiales

Los cromosomas artificiales son cromosomas fabricados en el contexto de los cromosomas artificiales de levadura (YAC), los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) o los cromosomas artificiales humanos (HAC). Un cromosoma artificial puede transportar un fragmento de ADN mucho más grande que otros vectores. Los YAC y BAC pueden transportar un fragmento de ADN de hasta 300 000 nucleótidos de longitud. Tres necesidades estructurales de un cromosoma artificial incluyen un origen de replicación, un centrómero y secuencias finales teloméricas.

Transcripción

La transcripción del gen clonado es un componente necesario del vector cuando se requiere la expresión del gen: un gen puede amplificarse a través de la transcripción para generar múltiples copias de ARNm, la plantilla en la que se puede producir la proteína a través de la traducción. Un mayor número de mRNA expresaría una mayor cantidad de proteína, y cuántas copias de mRNA se generan depende del promotor utilizado en el vector. La expresión puede ser constitutiva, lo que significa que la proteína se produce constantemente en el fondo, o puede ser inducible, por lo que la proteína se expresa solo bajo ciertas condiciones, por ejemplo, cuando se agrega un inductor químico. Estos dos tipos diferentes de expresión dependen de los tipos de promotor y operador utilizados.

Los promotores virales a menudo se usan para la expresión constitutiva en plásmidos y en vectores virales porque normalmente fuerzan la transcripción constante en muchas líneas y tipos celulares de manera confiable. La expresión inducible depende de promotores que respondan a las condiciones de inducción: por ejemplo, el promotor del virus del tumor mamario murino solo inicia la transcripción después de la aplicación de dexametasona y el promotor del choque térmico de Drosophila solo la inicia después de altas temperaturas.

Algunos vectores están diseñados solo para la transcripción, por ejemplo, para la producción de ARNm in vitro. Estos vectores se denominan vectores de transcripción. Pueden carecer de las secuencias necesarias para la poliadenilación y la terminación, por lo que no pueden usarse para la producción de proteínas.

Expresión

Los vectores de expresión producen proteínas a través de la transcripción del inserto del vector seguido de la traducción del ARNm producido, por lo que requieren más componentes que los vectores más simples de solo transcripción. La expresión en un organismo huésped diferente requeriría elementos diferentes, aunque comparten requisitos similares, por ejemplo, un promotor para el inicio de la transcripción, un sitio de unión ribosomal para el inicio de la traducción y señales de terminación.

Vector de expresión de procariotas

• Promotor: los promotores inducibles comúnmente usados ​​son promotores derivados del operón lac y el promotor T7. Otros promotores potentes utilizados incluyen el promotor Trp y el promotor Tac, que son un híbrido de los promotores Trp y Lac Operon.
• Sitio de unión al ribosoma (RBS): sigue al promotor y promueve la traducción eficiente de la proteína de interés.
• Sitio de iniciación de la traducción: secuencia Shine-Dalgarno encerrada en el RBS, 8 pares de bases aguas arriba del codón de inicio AUG.

Vector de expresión de eucariotas

Los vectores de expresión eucariotas requieren secuencias que codifiquen para:

• Cola de poliadenilación: crea una cola de poliadenilación al final del pre-ARNm transcrito que protege el ARNm de las exonucleasas y asegura la terminación transcripcional y traduccional: estabiliza la producción de ARNm.
• Longitud mínima de UTR: los UTR contienen características específicas que pueden impedir la transcripción o la traducción y, por lo tanto, los UTR más cortos o ninguno se codifican en vectores de expresión óptimos.
• Secuencia de Kozak: los vectores deben codificar una secuencia de Kozak en el ARNm, que ensambla el ribosoma para la traducción del ARNm.

Características

Los vectores modernos construidos artificialmente contienen componentes esenciales que se encuentran en todos los vectores y pueden contener otras características adicionales que se encuentran solo en algunos vectores:

• Origen de replicación: Necesario para la replicación y mantenimiento del vector en la célula huésped.
• Promotor: los promotores se utilizan para impulsar la transcripción del transgén del vector, así como de otros genes en el vector, como el gen de resistencia a los antibióticos. Algunos vectores de clonación no necesitan tener un promotor para el inserto clonado, pero es un componente esencial de los vectores de expresión para que el producto clonado pueda expresarse.
• Sitio de clonación: este puede ser un sitio de clonación múltiple u otras características que permitan la inserción de ADN extraño en el vector a través de la ligadura.
• Marcadores genéticos: los marcadores genéticos para vectores virales permiten confirmar que el vector se ha integrado con el ADN genómico del huésped.
• Resistencia a los antibióticos: los vectores con marcos de lectura abiertos de resistencia a los antibióticos permiten la supervivencia de las células que han absorbido el vector en medios de crecimiento que contienen antibióticos a través de la selección de antibióticos.
• Epítopo: algunos vectores pueden contener una secuencia para un epítopo específico que se puede incorporar a la proteína expresada. Permite la identificación de anticuerpos de las células que expresan la proteína diana.
• Genes informadores: algunos vectores pueden contener un gen informador que permite la identificación del plásmido que contiene la secuencia de ADN insertada. Un ejemplo es lacZ-α que codifica el fragmento N-terminal de la β-galactosidasa, una enzima que digiere la galactosa. Un sitio de clonación múltiple se encuentra dentro de lacZ-α, y un inserto ligado con éxito en el vector interrumpirá la secuencia del gen, dando como resultado una β-galactosidasa inactiva. Las células que contienen el vector con un inserto pueden identificarse mediante selección azul/blanca cultivando células en medios que contienen un análogo de galactosa (X-gal). Las células que expresan β-galactosidasa (por lo tanto, no contienen un inserto) aparecen como colonias azules. Las colonias blancas se seleccionarían como aquellas que pueden contener un inserto. Otros indicadores de uso común incluyen la proteína fluorescente verde y la luciferasa.
• Secuencia dirigida: los vectores de expresión pueden incluir la codificación de una secuencia dirigida en la proteína terminada que dirige la proteína expresada a un orgánulo específico en la célula o una ubicación específica, como el espacio periplásmico de las bacterias.
• Etiquetas de purificación de proteínas: algunos vectores de expresión incluyen proteínas o secuencias peptídicas que permiten una purificación más sencilla de la proteína expresada. Los ejemplos incluyen etiqueta de polihistidina, glutatión-S-transferasa y proteína de unión a maltosa. Algunas de estas etiquetas también pueden permitir una mayor solubilidad de la proteína objetivo. La proteína diana se fusiona con la etiqueta de proteína, pero un sitio de escisión de proteasa situado en la región del conector polipeptídico entre la proteína y la etiqueta permite que la etiqueta se elimine más tarde.