Transfección

La transfección es el proceso de introducir deliberadamente ácidos nucleicos desnudos o purificados en células eucariotas. También puede referirse a otros métodos y tipos de células, aunque a menudo se prefieren otros términos: "transformación" se utiliza normalmente para describir la transferencia de ADN no viral en bacterias y células eucariotas no animales, incluidas las células vegetales. En células animales, transfección es el término preferido ya que transformación también se usa para referirse a la progresión a un estado canceroso (carcinogénesis) en estas células. La transducción se utiliza a menudo para describir la transferencia de genes mediada por virus a células eucariotas.

La palabra transfección es un portmanteau de trans- y infección. El material genético (como las construcciones de ADN plasmido supercoilado o siRNA), puede ser transfectado. La transfección de las células animales normalmente implica abrir poros transitorios o "agujeros" en la membrana celular para permitir la absorción de material. La transfección se puede llevar a cabo utilizando fosfato de calcio (es decir, fosfato tricalcium), por electroporación, por esquezamiento celular, o mezclando un lípido cationico con el material para producir liposomas que se fusionan con la membrana celular y depositan su carga dentro.

La transfección puede provocar morfologías y anomalías inesperadas en las células diana.

Terminología

El significado del término ha evolucionado. El significado original de transfección era "infección por transformación", es decir, introducción de material genético, ADN o ARN, de un virus o bacteriófago que infecta procariotas en las células, lo que da como resultado una infección. Para el trabajo con células bacterianas y arqueales, la transfección conserva su significado original como un caso especial de transformación. Debido a que el término transformación tenía otro sentido en la biología celular animal (un cambio genético que permite la propagación a largo plazo en cultivo, o la adquisición de propiedades típicas de las células cancerosas), el término transfección adquirió, para las células animales, su significado actual de cambio en la célula. propiedades causadas por la introducción del ADN.

Métodos

Existen varios métodos para introducir ADN extraño en una célula eucariota: algunos se basan en tratamientos físicos (electroporación, compresión celular, nanopartículas, magnetofección); otros dependen de materiales químicos o partículas biológicas (virus) que se utilizan como portadores. Existen muchos métodos diferentes de administración de genes desarrollados para varios tipos de células y tejidos, desde bacterianos hasta mamíferos. Generalmente, los métodos se pueden dividir en tres categorías: físicos, químicos y biológicos.

Los métodos físicos incluyen electroporación, microinyección, pistola genética, impalefección, presión hidrostática, infusión continua y sonicación. Los productos químicos incluyen métodos como la lipofección, que es un proceso de transfección de ADN mediado por lípidos que utiliza vectores liposómicos. También puede incluir el uso de portadores de genes poliméricos (poliplexes). La transfección biológica suele estar mediada por virus y utiliza la capacidad de un virus para inyectar su ADN dentro de una célula huésped. Un gen destinado a ser administrado está empaquetado en una partícula viral con replicación deficiente. Los virus utilizados hasta la fecha incluyen retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados y virus del herpes simple.

Métodos físicos

Los métodos físicos son conceptualmente los más simples y utilizan algunos medios físicos para forzar el ingreso del material transfectado al núcleo de la célula objetivo. El método físico más utilizado es la electroporación, en la que breves impulsos eléctricos alteran la membrana celular, permitiendo que los ácidos nucleicos transfectados entren en la célula. Otros métodos físicos utilizan diferentes medios para perforar agujeros en la membrana celular: la sonoporación utiliza ultrasonido de alta intensidad (atribuido principalmente a la cavitación de burbujas de gas que interactúan con las membranas celulares cercanas), la transfección óptica utiliza un láser altamente enfocado para formar un diámetro de ~1 μm. agujero.

Varios métodos utilizan herramientas que fuerzan el ácido nucleico hacia la célula, a saber: microinyección de ácido nucleico con una aguja fina; entrega de partículas biolísticas, en la que el ácido nucleico se une a partículas de metales pesados (generalmente oro) y se impulsa hacia el interior de las células a alta velocidad; y magnetofección, donde los ácidos nucleicos se unen a partículas magnéticas de óxido de hierro y son impulsados hacia las células objetivo mediante imanes.

La administración hidrodinámica es un método utilizado en ratones y ratas, en el que los ácidos nucleicos se pueden administrar al hígado inyectando un volumen relativamente grande en la sangre en menos de 10 segundos; Casi todo el ADN se expresa en el hígado mediante este procedimiento.

Métodos químicos

La transfección de base química se puede dividir en varios tipos: ciclodextrina, polímeros, liposomas o nanopartículas (con o sin funcionalización química o viral. Ver más abajo).

• Uno de los métodos más baratos utiliza fosfato de calcio, originalmente descubierto por F. L. Graham y A. J. van der Eb en 1973 (ver también). La solución salina amortiguada (HeBS) que contiene iones de fosfato se combina con una solución de cloruro de calcio que contiene el ADN para ser transfectado. Cuando los dos se combinan, se formará un precipitado fino del calcio cargado positivamente y el fosfato cargado negativamente, obligando al ADN a ser transfectado en su superficie. La suspensión del precipitado se añade a las células para ser transfectadas (normalmente una cultura celular cultivada en un monocapa). Por un proceso no completamente entendido, las células absorben parte del precipitado, y con él, el ADN. Este proceso ha sido un método preferido para identificar muchos oncogenes.
• Otro método es el uso de polímeros cationicos como DEAE-dextran o polietilenomina (PEI). El ADN cargado negativamente se une a la policación y el complejo es absorbido por la célula a través de la endocitosis.
• Lipofection (o transfección liposomasa) es una técnica utilizada para inyectar material genético en una célula por medio de liposomas, que son vesículas que pueden fusionarse fácilmente con la membrana celular ya que ambos están hechos de una bicapa fosfolípido. La lipofectión generalmente utiliza un lípido (cánico) cargado positivamente (lilosomas u mezclas catónicos) para formar un agregado con el material genético cargado negativamente (aniónico). Esta tecnología de transfecciones realiza las mismas tareas que otros procedimientos bioquímicos utilizando polímeros, DEAE-dextran, fosfato de calcio y electroporación. La eficiencia de la lipofección se puede mejorar mediante el tratamiento de las células transfectadas con un shock de calor suave.
• Fugene es una serie de reactivos patentados de transfecciones no liposomal ampliamente utilizados capaces de transfectar directamente una amplia variedad de células con alta eficiencia y baja toxicidad.
• Dendrimer es una clase de moléculas altamente ramificadas basadas en varios bloques de construcción y sintetizadas a través de un método convergente o divergente. Estos dendrimers unen los ácidos nucleicos para formar dendriplexes que luego penetran las células.

Métodos virales

El ADN también se puede introducir en las células utilizando virus como portador. En tales casos, la técnica se llama transducción y se dice que las células están transducidas. Los vectores adenovirales pueden ser útiles para los métodos de transfección viral porque pueden transferir genes a una amplia variedad de células humanas y tienen altas tasas de transferencia. Los vectores lentivirales también son útiles debido a su capacidad para transducir células que actualmente no están experimentando mitosis.

La fusión de protoplastos es una técnica en la que las células bacterianas transformadas se tratan con lisozima para eliminar la pared celular. Después de esto, se utilizan agentes fusogénicos (p. ej., virus Sendai, PEG, electroporación) para fusionar el protoplasto que porta el gen de interés con la célula receptora diana. Una desventaja importante de este método es que los componentes bacterianos también se introducen de manera no específica en la célula diana.

Transfección estable y transitoria

La transfección estable y transitoria difieren en sus efectos a largo plazo en una célula; una célula transfectada de forma estable expresará continuamente el ADN transfectado y lo transmitirá a las células hijas, mientras que una célula transfectada de forma transitoria expresará el ADN transfectado durante un corto período de tiempo y no lo transmitirá a las células hijas.

Para algunas aplicaciones de la transfección, es suficiente si el material genético transfectado sólo se expresa de manera transitoria. Dado que el ADN introducido en el proceso de transfección generalmente no está integrado en el genoma nuclear, el ADN extranjero se diluirá a través de la mitosis o degradado. Las líneas celulares que expresan el virus Epstein-Barr (EBV) del antígeno nuclear 1 (EBNA1) o el antígeno SV40 de gran T permiten la amplificación episómica de los plasmides que contienen los orígenes virales de EBV (293E) o SV40 (293T) de la replicación, reduciendo enormemente la tasa de dilución.

Si se desea que el gen transfectado realmente permanezca en el genoma de la célula y sus células hijas, debe ocurrir una transfección estable. Para lograr esto, se cotransfecta un gen marcador, lo que le da a la célula alguna ventaja seleccionable, como la resistencia a una determinada toxina. Algunas (muy pocas) de las células transfectadas habrán integrado, por casualidad, el material genético extraño en su genoma. Si luego se añade la toxina al cultivo celular, sólo aquellas pocas células con el gen marcador integrado en sus genomas podrán proliferar, mientras que otras células morirán. Después de aplicar este estrés selectivo (presión de selección) durante algún tiempo, sólo quedan las células con una transfección estable y pueden seguir cultivándose.

Los agentes comunes para seleccionar la transfección estable son:

• Genética, o G418, neutralizada por el producto del gen de resistencia a la neomicina
• Puromycin
• Zeocin
• Hygromycin B
• Blasticidin S

Transfección de ARN

El ARN también se puede transfectar en células para expresar transitoriamente su proteína codificada o para estudiar la cinética de descomposición del ARN. La transfección de ARN se utiliza a menudo en células primarias que no se dividen.

Los ARNip también se pueden transfectar para lograr el silenciamiento del ARN (es decir, la pérdida de ARN y proteína del gen objetivo). Esto se ha convertido en una aplicación importante en la investigación para lograr "derribo" de proteínas de interés (por ejemplo, endotelina-1) con aplicaciones potenciales en terapia génica. La limitación del enfoque de silenciamiento es la toxicidad de la transfección para las células y las posibles reacciones "fuera del objetivo" efectos sobre la expresión de otros genes/proteínas.

El ARN puede purificarse a partir de células después de la lisis o sintetizarse a partir de nucleótidos libres, ya sea químicamente o enzimáticamente utilizando una ARN polimerasa para transcribir una plantilla de ADN. Al igual que el ADN, el ARN se puede administrar a las células mediante diversos medios, entre ellos la microinyección, la electroporación y la transfección mediada por lípidos. Si el ARN codifica una proteína, las células transfectadas pueden traducir el ARN en la proteína codificada. Si el ARN es un ARN regulador (como un miARN), el ARN puede causar otros cambios en la célula (como la caída mediada por ARNi).

Encapsular la molécula de ARN en nanopartículas de lípidos fue un gran avance para producir vacunas de ARN viables, resolviendo una serie de barreras técnicas clave en la introducción de la molécula de ARN en la célula humana.

Las moléculas de ARN de menos de aproximadamente 25 nt (nucleótidos) evaden en gran medida la detección por parte del sistema inmunológico innato, que es activado por moléculas de ARN más largas. La mayoría de las células del cuerpo expresan proteínas del sistema inmunológico innato y, al exponerse a largas moléculas de ARN exógenas, estas proteínas inician cascadas de señalización que provocan inflamación. Esta inflamación hipersensibiliza la célula expuesta y las células cercanas a una exposición posterior. Como resultado, si bien una célula puede transfectarse repetidamente con ARN corto con pocos efectos no específicos, la transfección repetida de células incluso con una pequeña cantidad de ARN largo puede causar la muerte celular a menos que se tomen medidas para suprimir o evadir el sistema inmunológico innato (ver "Transfección de ARN largo" a continuación).

La transfección de ARN corto se utiliza habitualmente en la investigación biológica para anular la expresión de una proteína de interés (utilizando ARNip) o para expresar o bloquear la actividad de un miARN (utilizando ARN corto que actúa independientemente de la estructura celular). s maquinaria de ARNi y, por lo tanto, no se denomina ARNip). Si bien también se pueden utilizar vectores basados en ADN (virus, plásmidos) que codifican una molécula de ARN corta, la transfección con ARN corto no corre el riesgo de modificar el ADN de la célula, característica que ha llevado al desarrollo de ARN cortos como una nueva clase de fármacos macromoleculares.

La transfección de ARN largo es el proceso de introducir deliberadamente moléculas de ARN de más de 25 nt en células vivas. Se hace una distinción entre transfección de ARN corto y largo porque las moléculas de ARN largas exógenas provocan una respuesta inmune innata en las células que puede causar una variedad de efectos no específicos que incluyen bloqueo de la traducción, detención del ciclo celular y apoptosis.

ARN largo endógeno versus exógeno

El sistema inmunológico innato ha evolucionado para proteger contra las infecciones mediante la detección de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y la activación de un conjunto complejo de respuestas conocidas colectivamente como "inflamación". Muchas células expresan receptores de reconocimiento de patrones (PRR) específicos para ARN exógeno, incluido el receptor tipo peaje 3,7,8 (TLR3, TLR7, TLR8), la ARN helicasa RIG1 (RARRES3), la proteína quinasa R (PKR, también conocida como EIF2AK2), miembros de la familia de proteínas oligoadenilato sintetasa (OAS1, OAS2, OAS3), y otras. Todas estas proteínas pueden unirse específicamente a moléculas de ARN exógenas y desencadenar una respuesta inmune. Las características químicas, estructurales o de otro tipo específicas de las moléculas largas de ARN que se requieren para el reconocimiento de los PRR siguen siendo en gran medida desconocidas a pesar de los intensos estudios. En un momento dado, una célula típica de un mamífero puede contener varios cientos de miles de ARNm y otras moléculas largas de ARN reguladoras. Cómo distinguen las células el ARN largo exógeno de la gran cantidad de ARN largo endógeno es una cuestión abierta importante en la biología celular. Varios informes sugieren que la fosforilación del extremo 5' de una molécula de ARN larga puede influir en su inmunogenicidad y, específicamente, que el ARN 5'-trifosfato, que puede producirse durante una infección viral, es más inmunogénico que el ARN 5'-trifosfato. -ARN difosfato, ARN 5'-monofosfato o ARN que no contiene 5' fosfato. Sin embargo, el ARN largo transcrito in vitro (ivT) que contiene una cápsula de 7-metilguanosina (presente en el ARNm de eucariotas) también es altamente inmunogénico a pesar de no tener una cápsula 5' fosfato, lo que sugiere que otras características además de la 5'-fosforilación pueden influir en la inmunogenicidad de una molécula de ARN.

El ARNm eucariota contiene nucleótidos químicamente modificados, como N6-metiladenosina, 5-metilcitidina y nucleótidos 2'-O-metilados. Aunque sólo una cantidad muy pequeña de estos nucleótidos modificados está presente en una molécula de ARNm típica, pueden ayudar a evitar que el ARNm active el sistema inmunológico innato al alterar la estructura secundaria que se parecería al ARN bicatenario (ARNds), un tipo de ARN que se cree que estar presente en las células sólo durante la infección viral. La inmunogenicidad del ARN largo se ha utilizado para estudiar la inmunidad tanto innata como adaptativa.

Transfección repetida de ARN largo

Inhibir solo tres proteínas, interferón-β, STAT2 y EIF2AK2, es suficiente para rescatar a los fibroblastos humanos de la muerte celular causada por la transfección frecuente con ARN largo que codifica proteínas. La inhibición de la señalización del interferón altera el circuito de retroalimentación positiva que normalmente hipersensibiliza las células expuestas al ARN largo exógeno. Los investigadores han utilizado recientemente esta técnica para expresar proteínas de reprogramación en fibroblastos humanos primarios.