Microscopía de superresolución

La microscopía de superresolución es una serie de técnicas en microscopía óptica que permiten que dichas imágenes tengan resoluciones superiores a las impuestas por el límite de difracción, que se debe a la difracción de la luz. Las técnicas de imágenes de superresolución se basan en el campo cercano (microscopía de túnel de fotones, así como aquellas que utilizan Pendry Superlens y microscopía óptica de barrido de campo cercano) o en el campo lejano. Entre las técnicas que se basan en estas últimas se encuentran aquellas que mejoran la resolución solo modestamente (hasta aproximadamente un factor de dos) más allá del límite de difracción, como la microscopía confocal con agujero de alfiler cerrado o con la ayuda de métodos computacionales como la deconvolución o el píxel basado en detector. reasignación (por ejemplo, volver a escanear microscopía, reasignación de píxeles), el microscopio 4Pi y tecnologías de microscopía de iluminación estructurada como SIM y SMI.

Hay dos grupos principales de métodos para la microscopía de superresolución en el campo lejano que pueden mejorar la resolución en un factor mucho mayor:

1. Superresolución determinista: los emisores más utilizados en microscopía biológica, los fluoróforos, muestran una respuesta no lineal a la excitación, que puede aprovecharse para mejorar la resolución. Dichos métodos incluyen STED, GSD, RESOLFT y SSIM.
2. Superresolución estocástica: la complejidad química de muchas fuentes de luz molecular les otorga un comportamiento temporal complejo, que se puede utilizar para hacer que varios fluoróforos cercanos emitan luz en momentos separados y, por lo tanto, se puedan resolver en el tiempo. Estos métodos incluyen imágenes de fluctuación óptica de superresolución (SOFI) y todos los métodos de localización de una sola molécula (SMLM), como SPDM, SPDMphymod, PALM, FPALM, STORM y dSTORM.

El 8 de octubre de 2014, se otorgó el Premio Nobel de Química a Eric Betzig, WE Moerner y Stefan Hell por "el desarrollo de la microscopía de fluorescencia superresuelta", que lleva "la microscopía óptica a la nanodimensión". La comunidad de investigación biomédica está adoptando cada vez más las diferentes modalidades de microscopía de superresolución, y estas técnicas se están convirtiendo en herramientas indispensables para comprender la función biológica a nivel molecular.

Historia

En 1978, se desarrollaron las primeras ideas teóricas para romper el límite de Abbe, que requería el uso de un microscopio 4Pi como un microscopio de fluorescencia de escaneo láser confocal donde la luz se enfoca desde todos los lados hacia un foco común que se usa para escanear el objeto. por excitación 'punto por punto' combinada con detección 'punto por punto'. Sin embargo, la publicación de 1978 había sacado una conclusión física incorrecta (es decir, un punto de luz puntual) y había pasado por alto por completo el aumento de la resolución axial como el beneficio real de agregar el otro lado del ángulo sólido.

Parte de la siguiente información se obtuvo (con permiso) de la revisión de un blog de química sobre técnicas de microscopía de subdifracción.

En 1986, Okhonin patentó un microscopio óptico de súper resolución basado en emisión estimulada.

Técnicas de superresolución

Microscopía de túnel de fotones (PTM)

Mejora local / ANSOM / nanoantenas ópticas

Microscopía de mapeo aleatorio óptico de campo cercano (NORM)

La microscopía de mapeo aleatorio óptico de campo cercano (NORM) es un método de adquisición óptica de campo cercano por un microscopio de campo lejano a través de la observación del movimiento browniano de las nanopartículas en un líquido de inmersión.

NORM utiliza el escaneo de la superficie del objeto mediante nanopartículas que se mueven estocásticamente. A través del microscopio, las nanopartículas parecen puntos redondos simétricos. El ancho del punto es equivalente a la función de dispersión de puntos (~ 250 nm) y está definido por la resolución del microscopio. Las coordenadas laterales de la partícula dada se pueden evaluar con una precisión mucho mayor que la resolución del microscopio. Al recopilar la información de muchos cuadros, se puede trazar un mapa de la distribución de intensidad de campo cercano en todo el campo de visión del microscopio. En comparación con NSOM y ANSOM, este método no requiere ningún equipo especial para el posicionamiento de la punta y tiene un gran campo de visión y profundidad de enfoque. Debido a la gran cantidad de "sensores" de escaneo, se puede lograr la adquisición de imágenes en un tiempo más corto.

4Pi

Un microscopio 4Pi es un microscopio de fluorescencia de barrido láser con una resolución axial mejorada. El valor típico de 500 a 700 nm se puede mejorar a 100 a 150 nm, lo que corresponde a un punto focal casi esférico con un volumen de 5 a 7 veces menor que el de la microscopía confocal estándar.

La mejora en la resolución se logra mediante el uso de dos lentes de objetivo opuestos, ambos enfocados en la misma ubicación geométrica. Además, la diferencia en la longitud del camino óptico a través de cada una de las dos lentes objetivo se minimiza cuidadosamente. Por esto, las moléculas que residen en el área focal común de ambos objetivos pueden iluminarse coherentemente desde ambos lados, y la luz reflejada o emitida puede recogerse coherentemente, es decir, es posible la superposición coherente de la luz emitida en el detector. El ángulo sólido que se utiliza para la iluminación y la detección aumenta y se acerca al caso ideal, donde la muestra se ilumina y detecta desde todos los lados simultáneamente.

Hasta ahora, la mejor calidad en un microscopio 4Pi se ha alcanzado junto con la microscopía STED en células fijas y la microscopía RESOLFT con proteínas conmutables en células vivas.

Microscopía de iluminación estructurada (SIM)

La microscopía de iluminación estructurada (SIM) mejora la resolución espacial al recopilar información del espacio de frecuencia fuera de la región observable. Este proceso se realiza en el espacio recíproco: la transformada de Fourier (FT) de una imagen SI contiene información adicional superpuesta de diferentes áreas del espacio recíproco; con varios fotogramas en los que la iluminación cambia en alguna fase, es posible separar y reconstruir computacionalmente la imagen FT, que tiene mucha más información de resolución. El FT inverso devuelve la imagen reconstruida a una imagen de súper resolución.

La microscopía SIM podría reemplazar potencialmente a la microscopía electrónica como herramienta para algunos diagnósticos médicos. Estos incluyen el diagnóstico de trastornos renales, cáncer de riñón y enfermedades de la sangre.

Aunque el término "microscopía de iluminación estructurada" fue acuñado por otros en años posteriores, Guerra (1995) publicó por primera vez resultados en los que la luz modelada por una rejilla de paso de 50 nm iluminaba una segunda rejilla de paso de 50 nm, con las rejillas giradas con respecto a cada uno. otro por la cantidad angular necesaria para lograr la ampliación. Aunque la longitud de onda de iluminación fue de 650 nm, la rejilla de 50 nm se resolvió fácilmente. Esto mostró una mejora de casi 5 veces sobre el límite de resolución de Abbe de 232 nm que debería haber sido el más pequeño obtenido para la apertura numérica y la longitud de onda utilizadas. En un desarrollo posterior de este trabajo, Guerra demostró que la topografía lateral súper resuelta se logra mediante el cambio de fase del campo evanescente. Varias patentes estadounidensesfueron entregados a Guerra individualmente, o con colegas, y asignados a Polaroid Corporation. Las licencias para esta tecnología fueron adquiridas por Dyer Energy Systems, Calimetrics Inc. y Nanoptek Corp. para el uso de esta técnica de súper resolución en microscopía y almacenamiento de datos ópticos.

• Imágenes de núcleos celulares y etapas mitóticas registradas con 3D-SIM.
• Microscopía confocal de comparación – 3D-SIM
• Núcleo celular en profase desde varios ángulos
• Dos núcleos de células de ratón en profase.
• célula de ratón en telofase

Iluminación modulada espacialmente (SMI)

Una implementación de la iluminación estructurada se conoce como iluminación modulada espacialmente (SMI). Al igual que la iluminación estructurada estándar, la técnica SMI modifica la función de dispersión de puntos (PSF) de un microscopio de manera adecuada. En este caso, sin embargo, "la resolución óptica en sí no se mejora"; en cambio, la iluminación estructurada se utiliza para maximizar la precisión de las mediciones de distancia de objetos fluorescentes, para "permitir mediciones de tamaño en dimensiones moleculares de unas pocas decenas de nanómetros".

El microscopio Vertico SMI logra una iluminación estructurada mediante el uso de uno o dos rayos láser de interferencia opuestos a lo largo del eje. Luego, el objeto que se está fotografiando se mueve en pasos de alta precisión a través del campo de ondas, o el propio campo de ondas se mueve en relación con el objeto mediante cambios de fase. Esto da como resultado un tamaño axial y una resolución de distancia mejorados.

SMI se puede combinar con otras tecnologías de superresolución, por ejemplo, con 3D LIMON o LSI-TIRF como un interferómetro de reflexión interna total con iluminación estructurada lateralmente (este último instrumento y técnica es esencialmente un microscopio de efecto túnel de fotones con desplazamiento de fase, que emplea un interferómetro interno total). microscopio óptico de reflexión con campo evanescente desfasado (Guerra, 1996)). Esta técnica SMI permite adquirir imágenes ópticas de luz de distribuciones de autofluoróforos en secciones de tejido ocular humano con una resolución óptica sin precedentes. El uso de tres longitudes de onda de excitación diferentes (488, 568 y 647 nm) permite recopilar información espectral sobre la señal de autofluorescencia. Esto se ha utilizado para examinar el tejido del ojo humano afectado por la degeneración macular.

Técnicas funcionales deterministas

La microscopía REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions (RESOLFT) es una microscopía óptica con una resolución muy alta que puede visualizar detalles en muestras que no se pueden visualizar con microscopía convencional o confocal. Dentro de RESOLFT se generalizan los principios de la microscopía STED y la microscopía GSD. Además, existen técnicas con otros conceptos además de RESOLFT o SSIM. Por ejemplo, la microscopía de fluorescencia que utiliza la propiedad óptica de la puerta AND del centro vacante de nitrógeno, o la superresolución mediante la emisión estimulada de radiación térmica (SETR), que utiliza las superlinealidades intrínsecas de la radiación de cuerpo negro y amplía el concepto de super -Resolución más allá de la microscopía.

Agotamiento de emisiones estimuladas (STED)

La microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED) utiliza dos pulsos láser, el pulso de excitación para la excitación de los fluoróforos a su estado fluorescente y el pulso STED para la desexcitación de los fluoróforos mediante emisión estimulada.En la práctica, el pulso de láser de excitación se aplica primero y luego sigue un pulso STED (también se usa STED sin pulsos usando láseres de onda continua). Además, el pulso STED se modifica de tal manera que presenta un punto de intensidad cero que coincide con el punto focal de excitación. Debido a la dependencia no lineal de la tasa de emisión estimulada de la intensidad del haz STED, todos los fluoróforos alrededor del punto de excitación focal estarán en su estado desactivado (el estado fundamental de los fluoróforos). Al escanear este punto focal, se recupera la imagen. El ancho total a la mitad del máximo (FWHM) de la función de dispersión de puntos (PSF) del punto focal de excitación teóricamente puede comprimirse a un ancho arbitrario elevando la intensidad del pulso STED, de acuerdo con la ecuación (1). (1)donde ∆r es la resolución lateral, ∆ es el FWHM del PSF limitado por difracción, Imax es la intensidad máxima del láser STED y _es el umbral de intensidad necesario para lograr el agotamiento de la emisión saturada.

La principal desventaja de STED, que ha impedido su uso generalizado, es que la maquinaria es complicada. Por un lado, la velocidad de adquisición de imágenes es relativamente lenta para campos de visión grandes debido a la necesidad de escanear la muestra para recuperar una imagen. En cambio, puede ser muy rápido para campos de visión más pequeños: se han mostrado grabaciones de hasta 80 fotogramas por segundo. Debido a un gran valor de I _s asociado con STED, existe la necesidad de un pulso de excitación de alta intensidad, que puede dañar la muestra.

Agotamiento del estado fundamental (GSD)

La microscopía de agotamiento del estado fundamental (microscopía GSD) utiliza el estado triplete de un fluoróforo como estado desactivado y el estado singlete como estado activado, por lo que se utiliza un láser de excitación para conducir los fluoróforos en la periferia de la molécula en estado singlete al estado estado triplete. Esto es muy parecido a STED, donde el estado desactivado es el estado fundamental de los fluoróforos, razón por la cual la ecuación (1) también se aplica en este caso. El valor es más pequeño que en STED, lo que hace posible la obtención de imágenes de superresolución con una intensidad de láser mucho menor. Sin embargo, en comparación con STED, los fluoróforos utilizados en GSD son generalmente menos fotoestables; y la saturación del estado triplete puede ser más difícil de realizar.

Microscopía de iluminación estructurada saturada (SSIM)

La microscopía de iluminación estructurada saturada (SSIM) explota la dependencia no lineal de la tasa de emisión de fluoróforos en la intensidad del láser de excitación. Al aplicar un patrón de iluminación sinusoidal con una intensidad máxima cercana a la necesaria para saturar los fluoróforos en su estado fluorescente, se recuperan las franjas de Moiré. Las franjas contienen información espacial de alto orden que puede extraerse mediante técnicas computacionales. Una vez que se extrae la información, se recupera una imagen de súper resolución.

SSIM requiere cambiar el patrón de iluminación varias veces, limitando efectivamente la resolución temporal de la técnica. Además, existe la necesidad de fluoróforos muy fotoestables, debido a las condiciones de saturación, que provocan daños por radiación en la muestra y restringen las posibles aplicaciones para las que se puede utilizar SSIM.

Los ejemplos de esta microscopía se muestran en la sección Microscopía de iluminación estructurada (SIM): imágenes de núcleos celulares y etapas mitóticas registradas con microscopía 3D-SIM.

Técnicas funcionales estocásticas

Microscopía de localización

La microscopía de localización de una sola molécula (SMLM) resume todas las técnicas microscópicas que logran una superresolución al aislar emisores y ajustar sus imágenes con la función de dispersión de puntos (PSF). Normalmente, el ancho de la función de dispersión de puntos (~ 250 nm) limita la resolución. Sin embargo, dado un emisor aislado, se puede determinar su ubicación con una precisión limitada únicamente por su intensidad de acuerdo con la ecuación (2). (2)donde Δloc es la precisión de localización, Δ es el FWHM (ancho completo a la mitad del máximo) del PSF y N es el número de fotones recolectados.

Este proceso de ajuste solo se puede realizar de manera confiable para emisores aislados (ver Desconvolución), y las muestras biológicas interesantes están tan densamente etiquetadas con emisores que el ajuste es imposible cuando todos los emisores están activos al mismo tiempo. Las técnicas SMLM resuelven este dilema activando solo un subconjunto escaso de emisores al mismo tiempo, localizando estos pocos emisores con mucha precisión, desactivándolos y activando otro subconjunto.

Teniendo en cuenta la pixelación del fondo y de la cámara, y utilizando la aproximación gaussiana para la función de dispersión de puntos (disco de Airy) de un microscopio típico, Thompson et al. proponen la resolución teórica. y ajustado por Mortensen et al.:dónde* σ es la desviación estándar gaussiana de las ubicaciones centrales de la misma molécula si se mide varias veces (por ejemplo, cuadros de un video). (unidad m)* σ _PSF es la desviación estándar gaussiana de la función de dispersión de puntos, cuyo FWHM sigue la ecuación de Ernst Abbe d = λ/(2 NA). (unidad m)* a es el tamaño de cada píxel de la imagen. (unidad m)* N _sig es el conteo de fotones del PSF total sobre todos los píxeles de interés. (sin unidad)* N _bg el recuento medio de fotones de fondo por píxel (los recuentos oscuros ya se han eliminado), que se aproxima al cuadrado de la desviación estándar gaussiana del ruido de fondo de la distribución de Poisson de cada píxel a lo largo del tiempo o la desviación estándar de todos los píxeles con ruido de fondo solamente, σ _bg. Cuanto mayor sea σ _bg, mejor será la aproximación (por ejemplo, buena para σ _bg >10, excelente para σ _bg >1000). (sin unidad)* La resolución FWHM es ~2,355 veces la desviación estándar gaussiana.

Generalmente, la microscopía de localización se realiza con fluoróforos. Los fluoróforos adecuados (p. ej., para STORM) residen en un estado oscuro no fluorescente durante la mayor parte del tiempo y se activan estocásticamente, normalmente con un láser de excitación de baja intensidad. Un láser de lectura estimula la fluorescencia y blanquea o cambia los fluoróforos de nuevo a un estado oscuro, normalmente en 10 a 100 ms. En la acumulación de puntos para obtener imágenes en topografía a nanoescala (PAINT), los fluoróforos no son fluorescentes antes de unirse y son fluorescentes después. Los fotones emitidos durante la fase fluorescente se recogen con una cámara y la imagen resultante del fluoróforo (que es distorsionada por el PSF) se puede ajustar con una precisión muy alta, incluso del orden de unos pocos Angstroms.La repetición del proceso varios miles de veces garantiza que todos los fluoróforos puedan pasar por el estado brillante y se registren. Luego, una computadora reconstruye una imagen súper resuelta.

Las características deseables de los fluoróforos utilizados para estos métodos, con el fin de maximizar la resolución, son que deben ser brillantes. Es decir, deberían tener un alto coeficiente de extinción y un alto rendimiento cuántico. También deben poseer una alta relación de contraste (relación entre el número de fotones emitidos en el estado de luz y el número de fotones emitidos en el estado de oscuridad). Además, es deseable una muestra densamente etiquetada, de acuerdo con los criterios de Nyquist.

La multitud de métodos de microscopía de localización difieren principalmente en el tipo de fluoróforos utilizados.

Microscopía de distancia de precisión espectral (SPDM)

Una sola fuente diminuta de luz se puede ubicar mucho mejor de lo que normalmente permite la resolución de un microscopio: aunque la luz producirá un punto borroso, se pueden usar algoritmos informáticos para calcular con precisión el centro del punto borroso, teniendo en cuenta la la función de dispersión del punto del microscopio, las propiedades de ruido del detector, etc. Sin embargo, este enfoque no funciona cuando hay demasiadas fuentes cerca unas de otras: entonces todas las fuentes se confunden.

La microscopía de distancia de precisión espectral (SPDM) es una familia de técnicas de localización en microscopía de fluorescencia que soluciona el problema de que haya muchas fuentes midiendo solo unas pocas fuentes a la vez, de modo que cada fuente esté "ópticamente aislada" de las demás (es decir,, separadas por más de la resolución del microscopio, típicamente ~200-250 nm), si las partículas que se examinan tienen firmas espectrales diferentes, de modo que es posible observar la luz de unas pocas moléculas a la vez utilizando las fuentes de luz adecuadas y filtros Esto logra una resolución óptica efectiva varias veces mejor que la resolución óptica convencional que está representada por la mitad del ancho del máximo principal de la función de imagen de punto efectivo.

La resolución estructural alcanzable usando SPDM se puede expresar en términos de la distancia medible más pequeña entre dos partículas puntiformes de diferentes características espectrales ("resolución topológica"). El modelado ha demostrado que, en condiciones adecuadas de precisión de localización, densidad de partículas, etc., la "resolución topológica" corresponde a una "frecuencia espacial" que, en términos de la definición clásica, equivale a una resolución óptica muy mejorada. Las moléculas también se pueden distinguir de formas aún más sutiles basadas en el tiempo de vida fluorescente y otras técnicas.

Una aplicación importante es en la investigación del genoma (estudio de la organización funcional del genoma). Otra área importante de uso es la investigación de la estructura de las membranas.

SPDMphymod

La microscopía de localización para muchos tintes fluorescentes estándar como GFP, tintes Alexa y moléculas de fluoresceína es posible si están presentes ciertas condiciones fotofísicas. Con esta tecnología de fluoróforos físicamente modificables (SPDMphymod), una sola longitud de onda láser de intensidad adecuada es suficiente para la nanoimagen en contraste con otras tecnologías de microscopía de localización que necesitan dos longitudes de onda láser cuando se utilizan moléculas de fluorescencia fotoactivables/fotoconmutables especiales. Otro ejemplo del uso de SPDMphymod es el análisis de partículas del virus del mosaico del tabaco (TMV) o el estudio de la interacción virus-célula.

Con base en las transiciones de estado de singlete-triplete, es crucial para SPDMphymod que este proceso esté en curso y que produzca el efecto de que una sola molécula pase primero a un estado oscuro reversible de vida muy prolongada (con una vida media de varios segundos) de que vuelve a un estado fluorescente que emite muchos fotones durante varios milisegundos antes de volver a un estado oscuro irreversible de larga duración. La microscopía SPDMphymod utiliza moléculas fluorescentes que emiten la misma frecuencia de luz espectral pero con diferentes firmas espectrales basadas en las características de destello. Al combinar dos mil imágenes de la misma celda, es posible, utilizando mediciones de precisión óptica láser, registrar imágenes de localización con una resolución óptica significativamente mejorada.

Los tintes fluorescentes estándar que ya se han utilizado con éxito con la tecnología SPDMphymod son GFP, RFP, YFP, Alexa 488, Alexa 568, Alexa 647, Cy2, Cy3, Atto 488 y fluoresceína.

Localización óptica criogénica en 3D (COLD)

La localización óptica criogénica en 3D (COLD) es un método que permite localizar múltiples sitios fluorescentes dentro de una sola biomolécula de tamaño pequeño a mediano con una resolución de escala Angstrom. La precisión de localización en este enfoque se mejora porque la fotoquímica más lenta a bajas temperaturas conduce a una mayor cantidad de fotones que se pueden emitir desde cada fluoróforo antes del fotoblanqueo.Como resultado, la microscopía de localización estocástica criogénica logra la resolución submolecular requerida para resolver las posiciones 3D de varios fluoróforos unidos a una proteína pequeña. Mediante el empleo de algoritmos conocidos de microscopía electrónica, las proyecciones 2D de los fluoróforos se reconstruyen en una configuración 3D. COLD lleva la microscopía de fluorescencia a su límite fundamental, dependiendo del tamaño de la etiqueta. El método también se puede combinar con otras técnicas de biología estructural, como la cristalografía de rayos X, la espectroscopia de resonancia magnética y la microscopía electrónica, para proporcionar valiosa información complementaria y especificidad.

Microscopía de localización activada por unión (BALM)

La microscopía de localización activada por unión (BALM) es un concepto general para la microscopía de localización de una sola molécula (SMLM): imágenes súper resueltas de tintes de unión al ADN basados ​​en la modificación de las propiedades del ADN y un tinte.Mediante un ajuste cuidadoso del entorno químico, que conduce a la fusión local y reversible del ADN y al control de la hibridación sobre la señal de fluorescencia, se pueden introducir moléculas de colorante que se unen al ADN. Los tintes de ADN intercalados y de unión a surcos menores se pueden usar para registrar y aislar ópticamente solo unas pocas señales de tinte de unión a ADN a la vez. El BALM asistido por fluctuación de la estructura del ADN (fBALM) se ha utilizado para diferencias a nanoescala en la arquitectura nuclear, con una resolución estructural anticipada de aproximadamente 50 nm. Imagen de la nanoestructura de la cromatina con microscopía de localización activada por unión basada en las fluctuaciones de la estructura del ADN. Recientemente, la mejora significativa del rendimiento cuántico de fluorescencia de NIAD-4 al unirse a un amiloide se aprovechó para obtener imágenes BALM de fibrillas y oligómeros de amiloide.

TORMENTA, PALMA y FPALM

La microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), la microscopía de localización fotoactivada (PALM) y la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) son técnicas de imagen de súper resolución que utilizan la activación secuencial y la localización resuelta en el tiempo de fluoróforos fotoconmutables para crear imágenes de alta resolución. Durante la obtención de imágenes, solo un subconjunto de fluoróforos que se puede resolver ópticamente se activa a un estado fluorescente en un momento dado, de modo que la posición de cada fluoróforo se puede determinar con alta precisión encontrando las posiciones del centroide de las imágenes de una sola molécula de un fluoróforo en particular. Posteriormente, se desactiva un subconjunto de fluoróforos y se activa y captura la imagen de otro subconjunto.

Estos tres métodos se publicaron de forma independiente durante un breve período de tiempo y sus principios son idénticos. STORM se describió originalmente usando colorantes Cy5 y Cy3 unidos a ácidos nucleicos o proteínas, mientras que PALM y FPALM se describieron usando proteínas fluorescentes fotoconmutables. En principio, se puede usar cualquier fluoróforo fotoconmutable, y STORM se ha demostrado con una variedad de sondas y estrategias de marcaje diferentes. Mediante el uso de fotoconmutación estocástica de fluoróforos individuales, como Cy5, STORM se puede realizar con una sola fuente de excitación de láser rojo. El láser rojo cambia el fluoróforo Cy5 a un estado oscuro mediante la formación de un aducto y, posteriormente, devuelve la molécula al estado fluorescente. También se han utilizado muchos otros tintes con STORM.

Además de los fluoróforos individuales, se pueden usar con STORM pares de colorantes que constan de un fluoróforo activador (como Alexa 405, Cy2 o Cy3) y un colorante informador fotoconmutable (como Cy5, Alexa 647, Cy5.5 o Cy7).. En este esquema, el fluoróforo activador, cuando se excita cerca de su máximo de absorción, sirve para reactivar el colorante fotoconmutable al estado fluorescente. Se han realizado imágenes multicolores utilizando diferentes longitudes de onda de activación para distinguir los pares de colorantes, según el fluoróforo activador utilizado, o utilizando fluoróforos fotoconmutables espectralmente distintos, con o sin fluoróforos activadores. También se pueden usar proteínas fluorescentes fotoconmutables.Se ha logrado un marcado altamente específico de estructuras biológicas con sondas fotoconmutables con tinción de anticuerpos, conjugación directa de proteínas y codificación genética.

STORM también se ha extendido a imágenes tridimensionales utilizando astigmatismo óptico, en el que la forma elíptica de la función de dispersión de puntos codifica las posiciones x, y y z para muestras de hasta varios micrómetros de espesor, y se ha demostrado en células vivas. Hasta la fecha, la resolución espacial lograda por esta técnica es de ~20 nm en las dimensiones laterales y ~50 nm en la dimensión axial; y la resolución temporal es tan rápida como 0,1–0,33 s.

Acumulación de puntos para imágenes en topografía a nanoescala (PAINT)

La acumulación de puntos para obtener imágenes en topografía a nanoescala (PAINT) es un método de localización de una sola molécula que logra una fluorescencia estocástica de una sola molécula mediante adsorción/absorción molecular y fotoblanqueo/desorción.El primer colorante utilizado fue el rojo Nilo, que no es fluorescente en solución acuosa pero es fluorescente cuando se inserta en un entorno hidrofóbico, como micelas o paredes de células vivas. Por lo tanto, la concentración del tinte se mantiene pequeña, a nivel nanomolar, de modo que la tasa de sorción de la molécula en el área limitada por difracción está en la región de milisegundos. La unión estocástica de moléculas de un solo colorante (sondas) a un objetivo inmovilizado puede resolverse espacial y temporalmente con un microscopio de fluorescencia de campo amplio típico. Cada tinte se fotoblanquea para devolver el campo a un estado oscuro, de modo que el siguiente tinte pueda unirse y observarse. La ventaja de este método, en comparación con otros métodos estocásticos, es que además de obtener la imagen súper resuelta del objetivo fijo, puede medir la cinética de unión dinámica de las moléculas de la sonda en difusión,

Combinando la técnica de superresolución 3D (p. ej., la función de dispersión de puntos de doble hélice desarrollada en el grupo de Moerner), colorantes fotoactivados, intermitencia activa dependiente de la potencia y acumulación de puntos para obtener imágenes en topografía a nanoescala, SPRAIPAINT (SPRAI=Superresolución de Power- Intermitencia activa dependiente) puede superresolver paredes de células vivas. PAINT funciona manteniendo un equilibrio entre las tasas de adsorción/absorción del tinte y fotoblanqueo/desorción. Este saldo se puede estimar con principios estadísticos. La tasa de adsorción o absorción de un soluto diluido en una superficie o interfaz en una solución gaseosa o líquida se puede calcular utilizando las leyes de difusión de Fick. La tasa de fotoblanqueo/desorción se puede medir para una condición de solución y una densidad de potencia de iluminación dadas.

DNA-PAINT se ha ampliado aún más para usar tintes regulares, donde la unión y desunión dinámicas de una sonda de ADN marcada con tinte a un origami de ADN fijo se usa para lograr imágenes estocásticas de una sola molécula. DNA-PAINT ya no se limita a colorantes sensibles al medio ambiente y puede medir tanto la cinética de adsorción como la de desorción de las sondas al objetivo. El método utiliza el efecto de desenfoque de la cámara de los tintes en movimiento. Cuando un tinte regular se difunde en la solución, su imagen en una cámara CCD típica se ve borrosa debido a su velocidad relativamente rápida y al tiempo de exposición de la cámara relativamente largo, lo que contribuye al fondo de fluorescencia. Sin embargo, cuando se une a un objetivo fijo, el tinte deja de moverse; y se puede lograr una entrada clara en la función de dispersión de puntos.

El término para este método es mbPAINT ("mb" significa desenfoque de movimiento). Cuando se utiliza un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para obtener imágenes, la profundidad de excitación se limita a ~ 100 nm desde el sustrato, lo que reduce aún más el fondo de fluorescencia de los tintes borrosos cerca del sustrato y el fondo en la solución a granel. Se pueden usar tintes muy brillantes para mbPAINT, que proporciona resoluciones espaciales típicas de un solo cuadro de ~ 20 nm y resoluciones temporales cinéticas de una sola molécula de ~ 20 ms bajo intensidades de fotoexcitación relativamente suaves, lo que es útil para estudiar la separación molecular de proteínas individuales.

La resolución temporal se ha mejorado aún más (20 veces) utilizando una máscara de fase rotacional colocada en el plano de Fourier durante la adquisición de datos y resolviendo la función de dispersión de puntos distorsionada que contiene información temporal. El método se denominó microscopía de resolución supertemporal (STReM).

Microscopía de localización sin etiquetas

Se puede lograr una resolución óptica de estructuras celulares en el rango de aproximadamente 50 nm, incluso en células sin etiqueta, usando microscopía de localización SPDM.

Mediante el uso de dos longitudes de onda de láser diferentes, SPDM revela objetos celulares que no son detectables en condiciones de imágenes de campo amplio de fluorescencia convencionales, además de mejorar sustancialmente la resolución de las estructuras autofluorescentes.

Como control, las posiciones de los objetos detectados en la imagen de localización coinciden con las de la imagen de campo claro.

La microscopía de superresolución sin etiquetas también se ha demostrado utilizando las fluctuaciones de una señal de dispersión Raman mejorada en la superficie en una metasuperficie plasmónica altamente uniforme.

Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM)

dSTORM utiliza la fotoconmutación de un solo fluoróforo. En dSTORM, los fluoróforos están incrustados en un sistema tampón de reducción y oxidación (ROXS) y se excita la fluorescencia. A veces, estocásticamente, el fluoróforo entrará en un triplete o en algún otro estado oscuro que sea sensible al estado de oxidación del tampón, a partir del cual se pueden hacer fluorescentes, de modo que se puedan registrar las posiciones de una sola molécula. El desarrollo del método dSTORM ocurrió en 3 laboratorios independientes aproximadamente al mismo tiempo y también se denominó "microscopía de fotoblanqueo reversible" (RPM), "microscopía de agotamiento del estado fundamental seguida de retorno de molécula individual" (GSDIM), así como el ahora generalmente aceptado apodo dSTORM.

Software para microscopía de localización

La microscopía de localización depende en gran medida del software que puede ajustar con precisión la función de dispersión de puntos (PSF) a millones de imágenes de fluoróforos activos en unos pocos minutos. Dado que los métodos de análisis clásicos y las suites de software que se utilizan en las ciencias naturales son demasiado lentos para resolver computacionalmente estos problemas, y a menudo requieren horas de cómputo para procesar datos medidos en minutos, se han desarrollado programas de software especializados. Muchos de estos paquetes de software de localización son de código abierto; se enumeran en SMLM Software Benchmark. Una vez que se han determinado las posiciones de las moléculas, es necesario mostrar las ubicaciones y se han desarrollado varios algoritmos para la visualización.

Imágenes de fluctuación óptica de superresolución (SOFI)

Es posible eludir la necesidad de ajuste de PSF inherente a la microscopía de localización de una sola molécula (SMLM) calculando directamente la autocorrelación temporal de los píxeles. Esta técnica se denomina imagen de fluctuación óptica de superresolución (SOFI) y se ha demostrado que es más precisa que SMLM cuando la densidad de fluoróforos activos simultáneamente es muy alta.

Microscopía de localización omnipresente (OLM)

La microscopía de localización omnipresente (OLM) es una extensión de las técnicas de microscopía de molécula única (SMLM) que permite obtener imágenes de molécula única de alta densidad con una fuente de luz incoherente (como una lámpara de arco de mercurio) y una configuración de microscopio de epifluorescencia convencional. Una breve ráfaga de excitación azul profundo (con un láser de 350-380 nm, en lugar de un láser de 405 nm) permite una reactivación prolongada de las moléculas, para una resolución de 90 nm en las muestras de prueba. Finalmente, las imágenes STED y SMLM correlativas se pueden realizar en la misma muestra biológica utilizando un medio de imagen simple, que puede proporcionar una base para una resolución mejorada adicional. Estos hallazgos pueden democratizar las imágenes de superresolución y ayudar a cualquier científico a generar imágenes de una sola molécula de alta densidad, incluso con un presupuesto limitado.

Combinación de técnicas

Microscopía de nanodimensionamiento microscópico de luz 3D (LIMON)

Las imágenes de microscopía Light Microscopical Nanosizing (3D LIMON), utilizando el microscopio Vertico SMI, son posibles gracias a la combinación de SMI y SPDM, mediante la cual se aplica primero el proceso SMI y luego el SPDM.

El proceso SMI determina el centro de las partículas y su dispersión en la dirección del eje del microscopio. Mientras que el centro de las partículas/moléculas se puede determinar con una precisión de 1 a 2 nm, la dispersión alrededor de este punto se puede determinar hasta un diámetro axial de aproximadamente 30 a 40 nm.

Posteriormente, la posición lateral de la partícula/molécula individual se determina utilizando SPDM, logrando una precisión de unos pocos nanómetros.

Como aplicación biológica en el modo de color dual 3D, se lograron los arreglos espaciales de los grupos Her2/neu y Her3. Las posiciones en las tres direcciones de los grupos de proteínas se pudieron determinar con una precisión de aproximadamente 25 nm.

Microscopía óptica y electrónica correlativa integrada

La combinación de un microscopio de súper resolución con un microscopio electrónico permite la visualización de información contextual, con el etiquetado proporcionado por marcadores de fluorescencia. Esto supera el problema del fondo negro que le queda al investigador cuando usa solo un microscopio óptico. En un sistema integrado, la muestra se mide con ambos microscopios simultáneamente.

Mejora de técnicas mediante redes neuronales

Recientemente, debido a los avances en la computación de inteligencia artificial, las redes neuronales de aprendizaje profundo (GAN, por sus siglas en inglés) se han utilizado para mejorar la superresolución de imágenes fotográficas de microscopio óptico, de 40x a 100x, de 20x con un microscopio óptico a 1500x, comparable a un microscopio electrónico de barrido, a través de una lente neural, y con tomografía por emisión de positrones y microscopía de fluorescencia.