Espectroscopia Raman

Diagrama de nivel energético que muestra los estados involucrados en espectros Raman.

espectroscopia Raman () (llamada así por el físico indio C. V. Raman) es una técnica espectroscópica que se utiliza normalmente para determinar los modos de vibración de las moléculas, aunque también se pueden observar modos de rotación y otros modos de sistemas de baja frecuencia. La espectroscopia Raman se usa comúnmente en química para proporcionar una huella digital estructural mediante la cual se pueden identificar las moléculas.

La espectroscopia Raman se basa en la dispersión inelástica de fotones, conocida como dispersión Raman. Se usa una fuente de luz monocromática, generalmente de un láser en el rango visible, infrarrojo cercano o ultravioleta cercano, aunque también se pueden usar rayos X. La luz láser interactúa con vibraciones moleculares, fonones u otras excitaciones en el sistema, lo que hace que la energía de los fotones láser se desplace hacia arriba o hacia abajo. El cambio de energía da información sobre los modos de vibración en el sistema. La espectroscopia infrarroja normalmente produce información similar pero complementaria.

Normalmente, una muestra se ilumina con un rayo láser. La radiación electromagnética del punto iluminado se recoge con una lente y se envía a través de un monocromador. La radiación dispersa elástica en la longitud de onda correspondiente a la línea láser (dispersión de Rayleigh) se filtra mediante un filtro de muesca, un filtro de paso de borde o un filtro de paso de banda, mientras que el resto de la luz recolectada se dispersa en un detector.

La dispersión Raman espontánea suele ser muy débil; Como resultado, durante muchos años, la principal dificultad para recopilar espectros Raman fue separar la débil luz dispersada de forma inelástica de la intensa luz láser dispersada de Rayleigh (denominada "rechazo del láser"). Históricamente, los espectrómetros Raman usaban rejillas holográficas y múltiples etapas de dispersión para lograr un alto grado de rechazo del láser. En el pasado, los fotomultiplicadores eran los detectores elegidos para configuraciones Raman dispersivas, lo que generaba largos tiempos de adquisición. Sin embargo, la instrumentación moderna emplea casi universalmente filtros de muesca o de borde para el rechazo del láser. Los espectrógrafos dispersivos de una sola etapa (transmisores axiales (AT) o monocromadores Czerny-Turner (CT)) combinados con detectores CCD son los más comunes, aunque los espectrómetros de transformada de Fourier (FT) también son comunes para usar con láseres NIR.

El nombre "espectroscopia Raman" normalmente se refiere a Raman vibratorio que utiliza longitudes de onda láser que no son absorbidas por la muestra. Hay muchas otras variaciones de la espectroscopia Raman, que incluyen Raman mejorado en la superficie, Raman de resonancia, Raman mejorado en la punta, Raman polarizado, Raman estimulado, Raman de transmisión, Raman desplazado espacialmente e hiper Raman.

Teoría

La magnitud del efecto Raman se correlaciona con la polarizabilidad de los electrones en una molécula. Es una forma de dispersión de luz inelástica, donde un fotón excita la muestra. Esta excitación pone a la molécula en un estado de energía virtual por un corto tiempo antes de que se emita el fotón. La dispersión inelástica significa que la energía del fotón emitido es menor o mayor que la energía del fotón incidente. Después del evento de dispersión, la muestra se encuentra en un estado de rotación o vibración diferente.

Para que la energía total del sistema permanezca constante después de que la molécula se mueva a un nuevo estado rovibrónico (rotacional-vibracional-electrónico), el fotón disperso cambia a una energía diferente y, por lo tanto, a una frecuencia diferente. Esta diferencia de energía es igual a la que existe entre los estados rovibrónicos inicial y final de la molécula. Si el estado final tiene una energía más alta que el estado inicial, el fotón disperso se desplazará a una frecuencia más baja (energía más baja) para que la energía total permanezca igual. Este cambio de frecuencia se denomina cambio de Stokes o cambio descendente. Si el estado final tiene una energía más baja, el fotón disperso se desplazará a una frecuencia más alta, lo que se denomina desplazamiento anti-Stokes o desplazamiento ascendente.

Para que una molécula muestre un efecto Raman, debe haber un cambio en su polarizabilidad dipolo eléctrico-dipolo eléctrico con respecto a la coordenada vibratoria correspondiente al estado rovibrónico. La intensidad de la dispersión Raman es proporcional a este cambio de polarizabilidad. Por lo tanto, el espectro Raman (intensidad de dispersión en función de los cambios de frecuencia) depende de los estados rovibrónicos de la molécula.

El efecto Raman se basa en la interacción entre la nube de electrones de una muestra y el campo eléctrico externo de la luz monocromática, que puede crear un momento dipolar inducido dentro de la molécula en función de su polarizabilidad. Debido a que la luz láser no excita la molécula, no puede haber una transición real entre los niveles de energía. El efecto Raman no debe confundirse con la emisión (fluorescencia o fosforescencia), en la que una molécula en un estado electrónico excitado emite un fotón y vuelve al estado electrónico básico, en muchos casos a un estado vibratorio excitado en la superficie de energía potencial del estado electrónico básico.. La dispersión Raman también contrasta con la absorción infrarroja (IR), donde la energía del fotón absorbido coincide con la diferencia de energía entre los estados rovibrónicos inicial y final. La dependencia de Raman de la derivada de polarizabilidad dipolo eléctrico-dipolo eléctrico también difiere de la espectroscopia IR, que depende de la derivada del momento dipolar eléctrico, el tensor polar atómico (APT). Esta característica contrastante permite que las transiciones rovibrónicas que podrían no estar activas en IR se analicen mediante espectroscopia Raman, como lo ejemplifica la regla de exclusión mutua en moléculas centrosimétricas. Las transiciones que tienen grandes intensidades Raman a menudo tienen intensidades IR débiles y viceversa. Si un enlace está fuertemente polarizado, un pequeño cambio en su longitud, como el que ocurre durante una vibración, tiene solo un pequeño efecto resultante sobre la polarización. Las vibraciones que involucran enlaces polares (por ejemplo, C-O N-O O-H) son, por lo tanto, dispersores Raman comparativamente débiles. Tales enlaces polarizados, sin embargo, llevan sus cargas eléctricas durante el movimiento vibratorio (a menos que sean neutralizados por factores de simetría), y esto da como resultado un cambio de momento dipolar neto mayor durante la vibración, produciendo una fuerte banda de absorción IR. Por el contrario, los enlaces relativamente neutros (por ejemplo, C-C C-H C=C) sufren grandes cambios en la polarizabilidad durante una vibración. Sin embargo, el momento dipolar no se ve afectado de manera similar, de modo que, si bien las vibraciones que involucran predominantemente este tipo de enlace son fuertes dispersores Raman, son débiles en el IR. Una tercera técnica de espectroscopia vibratoria, la dispersión de neutrones incoherentes inelásticos (IINS), se puede utilizar para determinar las frecuencias de las vibraciones en moléculas altamente simétricas que pueden ser tanto IR como Raman inactivas. Las reglas de selección de IINS, o transiciones permitidas, difieren de las de IR y Raman, por lo que las tres técnicas son complementarias. Todos dan la misma frecuencia para una transición vibratoria dada, pero las intensidades relativas proporcionan información diferente debido a los diferentes tipos de interacción entre la molécula y las partículas entrantes, fotones para IR y Raman y neutrones para IINS.

Historia

Aunque Adolf Smekal predijo la dispersión inelástica de la luz en 1923, no se observó en la práctica hasta 1928. El efecto Raman recibió su nombre de uno de sus descubridores, el científico indio C. V. Raman, que observó el efecto en líquidos orgánicos. en 1928 junto con K. S. Krishnan, e independientemente por Grigory Landsberg y Leonid Mandelstam en cristales inorgánicos. Raman ganó el Premio Nobel de Física en 1930 por este descubrimiento. La primera observación de espectros Raman en gases fue en 1929 por Franco Rasetti.

La teoría pionera sistemática del efecto Raman fue desarrollada por el físico checoslovaco George Placzek entre 1930 y 1934. El arco de mercurio se convirtió en la principal fuente de luz, primero con detección fotográfica y luego con detección espectrofotométrica.

En los años posteriores a su descubrimiento, la espectroscopia Raman se utilizó para proporcionar el primer catálogo de frecuencias vibratorias moleculares. Por lo general, la muestra se mantuvo en un tubo largo y se iluminó a lo largo de su longitud con un haz de luz monocromática filtrada generada por una lámpara de descarga de gas. Los fotones que fueron dispersados por la muestra fueron recolectados a través de un plano óptico al final del tubo. Para maximizar la sensibilidad, la muestra estaba muy concentrada (1 M o más) y se utilizaron volúmenes relativamente grandes (5 ml o más).

Cambio raman

Los cambios Raman generalmente se informan en números de onda, que tienen unidades de longitud inversa, ya que este valor está directamente relacionado con la energía. Para convertir entre longitud de onda espectral y números de onda de desplazamiento en el espectro Raman, se puede utilizar la siguiente fórmula:

${displaystyle Delta {tilde {nu}=left({frac {1}{lambda ¿Por qué?$

donde Δν̃ es el cambio Raman expresado en número de onda, λ₀ es la longitud de onda de excitación y λ₁ es la longitud de onda del espectro Raman. Por lo general, la unidad elegida para expresar el número de onda en los espectros Raman es la inversa de los centímetros (cm⁻¹). Dado que la longitud de onda a menudo se expresa en unidades de nanómetros (nm), la fórmula anterior puede escalar para esta conversión de unidades explícitamente, dando

${displaystyle {fnMicrosoft Sans Serif} {fnMicrosoft Sans Serif} {fnMicrosoft Sans Serif} {} {f} {fnm}} {fnm} {fnMicroc {1} {fnMicros} {fnMicros} {fnMicrosoft} {fnMicrosoft}} {f}}}} {f}}fnMicros}}}fnMientras {f} {f} {fnMicrom} {f} {fnMientras {fnMientras {fnMicros}fnMientras}fnMinMientras {fnMientras} {fnun} {fnun} {fnun} {fnun} {fnun}fnun}fn}fnun} {fnKfn}fnun} {f} {fn$

Instrumentación

Un temprano espectro Raman de benceno publicado por Raman y Krishnan.

Esquema de una posible configuración dispersiva de espectroscopia Raman.

La espectroscopia Raman moderna casi siempre implica el uso de láseres como fuentes de luz de excitación. Debido a que los láseres no estuvieron disponibles hasta más de tres décadas después del descubrimiento del efecto, Raman y Krishnan usaron una lámpara de mercurio y placas fotográficas para registrar los espectros. Los primeros espectros tardaban horas o incluso días en adquirirse debido a las débiles fuentes de luz, la escasa sensibilidad de los detectores y las débiles secciones transversales de dispersión Raman de la mayoría de los materiales. Se usaron varios filtros de colores y soluciones químicas para seleccionar ciertas regiones de longitud de onda para excitación y detección, pero los espectros fotográficos aún estaban dominados por una amplia línea central correspondiente a la dispersión de Rayleigh de la fuente de excitación.

Los avances tecnológicos han hecho que la espectroscopia Raman sea mucho más sensible, especialmente desde la década de 1980. Los detectores modernos más comunes ahora son dispositivos de carga acoplada (CCD). Las matrices de fotodiodos y los tubos fotomultiplicadores eran comunes antes de la adopción de los CCD. La llegada de láseres confiables, estables y económicos con anchos de banda estrechos también ha tenido un impacto.

Láseres

La espectroscopia Raman requiere una fuente de luz como un láser. La resolución del espectro depende del ancho de banda de la fuente láser utilizada. Por lo general, los láseres de longitud de onda más corta proporcionan una dispersión Raman más fuerte debido al aumento de ν⁴ en las secciones transversales de dispersión Raman, pero pueden surgir problemas con la degradación de la muestra o la fluorescencia.

Los láseres de onda continua son los más comunes para la espectroscopia Raman normal, pero también se pueden usar láseres pulsados. Estos a menudo tienen anchos de banda más amplios que sus contrapartes CW, pero son muy útiles para otras formas de espectroscopia Raman, como transitoria, resuelta en el tiempo y Raman de resonancia.

Detectores

La luz dispersada Raman generalmente se recolecta y se dispersa mediante un espectrógrafo o se usa con un interferómetro para la detección mediante métodos de transformada de Fourier (FT). En muchos casos, los espectrómetros FT-IR disponibles comercialmente pueden modificarse para convertirse en espectrómetros FT-Raman.

Detectores para Raman dispersivo

En la mayoría de los casos, los espectrómetros Raman modernos utilizan detectores de matriz como los CCD. Existen varios tipos de CCD que están optimizados para diferentes rangos de longitud de onda. Los CCD intensificados se pueden utilizar para señales muy débiles y/o láseres pulsados. El rango espectral depende del tamaño del CCD y la longitud focal del espectrógrafo utilizado.

Alguna vez fue común usar monocromadores acoplados a tubos fotomultiplicadores. En este caso, sería necesario mover el monocromador para escanear a través de un rango espectral.

Detectores para FT-Raman

FT-Raman casi siempre se usa con láseres NIR y se deben usar detectores apropiados dependiendo de la longitud de onda excitante. Los detectores de germanio o arseniuro de indio y galio (InGaAs) se utilizan comúnmente.

Filtros

Por lo general, es necesario separar la luz dispersada Raman de la señal Rayleigh y la señal láser reflejada para recopilar espectros Raman de alta calidad mediante un filtro de rechazo láser. Los filtros ópticos de muesca o de paso largo se utilizan típicamente para este propósito. Antes de la llegada de los filtros holográficos, era común usar un monocromador de triple rejilla en modo sustractivo para aislar la señal deseada. Esto todavía se puede usar para registrar cambios Raman muy pequeños, ya que los filtros holográficos suelen reflejar algunas de las bandas de baja frecuencia además de la luz láser sin cambios. Sin embargo, los filtros de hologramas de volumen son cada vez más comunes y permiten observar cambios tan bajos como 5 cm⁻¹.

Aplicaciones

La espectroscopia Raman se utiliza en química para identificar moléculas y estudiar los enlaces químicos y los enlaces intramoleculares. Dado que las frecuencias vibratorias son específicas de los enlaces químicos y la simetría de una molécula (la región de la huella dactilar de las moléculas orgánicas se encuentra en el rango de número de onda de 500 a 1500 cm⁻¹), Raman proporciona una huella dactilar para identificar moléculas. Por ejemplo, se utilizaron espectros Raman e IR para determinar las frecuencias vibratorias de SiO, Si₂O₂ y Si₃O ₃ sobre la base de análisis de coordenadas normales. Raman también se utiliza para estudiar la adición de un sustrato a una enzima.

En la física del estado sólido, la espectroscopia Raman se usa para caracterizar materiales, medir la temperatura y encontrar la orientación cristalográfica de una muestra. Al igual que con las moléculas individuales, un material sólido se puede identificar por modos característicos de fonones. La información sobre la población de un modo de fonón viene dada por la relación entre la intensidad de Stokes y anti-Stokes de la señal Raman espontánea. La espectroscopia Raman también se puede utilizar para observar otras excitaciones de baja frecuencia de un sólido, como plasmones, magnones y excitaciones de huecos superconductores. La detección de temperatura distribuida (DTS) utiliza la retrodispersión con desplazamiento Raman de los pulsos láser para determinar la temperatura a lo largo de las fibras ópticas. La orientación de un cristal anisotrópico se puede encontrar a partir de la polarización de la luz dispersada por Raman con respecto al cristal y la polarización de la luz láser, si se conoce el grupo de puntos de la estructura cristalina.

En nanotecnología, se puede usar un microscopio Raman para analizar nanocables a fin de comprender mejor sus estructuras, y el modo de respiración radial de los nanotubos de carbono se usa comúnmente para evaluar su diámetro.

Las fibras activas Raman, como la aramida y el carbono, tienen modos de vibración que muestran un cambio en la frecuencia Raman con el estrés aplicado. Las fibras de polipropileno exhiben cambios similares.

En la química del estado sólido y la industria biofarmacéutica, la espectroscopia Raman se puede utilizar no solo para identificar ingredientes farmacéuticos activos (API), sino también para identificar sus formas polimórficas, si existen más de una. Por ejemplo, el fármaco Cayston (aztreonam), comercializado por Gilead Sciences para la fibrosis quística, se puede identificar y caracterizar mediante espectroscopia IR y Raman. El uso de la forma polimórfica correcta en las formulaciones biofarmacéuticas es fundamental, ya que las diferentes formas tienen diferentes propiedades físicas, como la solubilidad y el punto de fusión.

La espectroscopia Raman tiene una amplia variedad de aplicaciones en biología y medicina. Ha ayudado a confirmar la existencia de fonones de baja frecuencia en proteínas y ADN, promoviendo estudios de movimiento colectivo de baja frecuencia en proteínas y ADN y sus funciones biológicas. Se están desarrollando moléculas indicadoras de Raman con restos de olefina o alquino para obtener imágenes de tejidos con anticuerpos marcados con SERS. La espectroscopia Raman también se ha utilizado como una técnica no invasiva para la caracterización bioquímica in situ y en tiempo real de las heridas. El análisis multivariante de los espectros Raman ha permitido el desarrollo de una medida cuantitativa del progreso de la cicatrización de heridas. La espectroscopia Raman compensada espacialmente (SORS), que es menos sensible a las capas superficiales que el Raman convencional, se puede utilizar para descubrir medicamentos falsificados sin abrir su embalaje y para estudiar tejido biológico de forma no invasiva. Una de las principales razones por las que la espectroscopia Raman es tan útil en aplicaciones biológicas es que sus resultados a menudo no se enfrentan a la interferencia de las moléculas de agua, debido al hecho de que tienen momentos dipolares permanentes y, como resultado, la dispersión Raman no se puede detectar. Esta es una gran ventaja, específicamente en aplicaciones biológicas. La espectroscopia Raman también tiene un amplio uso para estudiar biominerales. Por último, los analizadores de gases Raman tienen muchas aplicaciones prácticas, incluida la monitorización en tiempo real de mezclas de gases anestésicos y respiratorios durante la cirugía.

La espectroscopia Raman se ha utilizado en varios proyectos de investigación como un medio para detectar explosivos desde una distancia segura utilizando rayos láser.

La espectroscopia Raman se está desarrollando aún más para que pueda usarse en el entorno clínico. Raman4Clinic es una organización europea que está trabajando en la incorporación de técnicas de espectroscopia Raman en el campo médico. Actualmente están trabajando en diferentes proyectos, uno de ellos es el seguimiento del cáncer utilizando fluidos corporales como orina y muestras de sangre que son de fácil acceso. Esta técnica sería menos estresante para los pacientes que tener que tomar constantemente biopsias que no siempre están exentas de riesgos.

Arte y patrimonio cultural

La espectroscopia Raman es una forma eficiente y no destructiva de investigar obras de arte y artefactos del patrimonio cultural, en parte porque es un proceso no invasivo que se puede aplicar in situ. Se puede utilizar para analizar los productos de corrosión en las superficies de los artefactos (estatuas, cerámica, etc.), lo que puede brindar información sobre los ambientes corrosivos experimentados por los artefactos. Los espectros resultantes también se pueden comparar con los espectros de superficies que se limpian o se corroen intencionalmente, lo que puede ayudar a determinar la autenticidad de artefactos históricos valiosos.

Es capaz de identificar pigmentos individuales en pinturas y sus productos de degradación, lo que puede proporcionar información sobre el método de trabajo de un artista además de ayudar en la autenticación de las pinturas. También da información sobre el estado original de la pintura en los casos en que los pigmentos se hayan degradado con el tiempo. Más allá de la identificación de los pigmentos, se ha demostrado que las amplias imágenes microespectroscópicas Raman brindan acceso a una plétora de compuestos traza en el azul egipcio de principios de la Edad Media, que permiten reconstruir la "biografía" individual. de un colorante, incluyendo información sobre el tipo y procedencia de las materias primas, la síntesis y aplicación del pigmento, y el envejecimiento de la capa pictórica.

Además de pinturas y artefactos, la espectroscopia Raman se puede utilizar para investigar la composición química de documentos históricos (como el Libro de Kells), lo que puede brindar información sobre las condiciones sociales y económicas cuando se crearon. También ofrece una forma no invasiva de determinar el mejor método de preservación o conservación de tales artefactos del patrimonio cultural, al proporcionar información sobre las causas detrás del deterioro.

La base de datos espectral IRUG (Infrared and Raman Users Group) es una base de datos en línea rigurosamente revisada por pares de espectros de referencia IR y Raman para materiales del patrimonio cultural, como obras de arte, arquitectura y artefactos arqueológicos. La base de datos está abierta al público en general e incluye espectros interactivos para más de cien tipos diferentes de pigmentos y pinturas.

Microespectroscopia

La imagen de Raman Hyperspectral puede proporcionar mapas de distribución de compuestos químicos y propiedades materiales: Ejemplo de un remanente de clinker no hidratado en un mortero de cemento del siglo XIX (nomenclatura del químico de cemento: C ≙ CaO, A ≙ Al₂O₃, S ≙ SiO₂, F ≙ Fe₂O₃).

La espectroscopia Raman ofrece varias ventajas para el análisis microscópico. Dado que se trata de una técnica de dispersión de la luz, no es necesario fijar ni seccionar las muestras. Los espectros Raman se pueden recopilar a partir de un volumen muy pequeño (< 1 µm de diámetro, < 10 µm de profundidad); estos espectros permiten la identificación de las especies presentes en ese volumen. El agua generalmente no interfiere con el análisis espectral Raman. Por lo tanto, la espectroscopia Raman es adecuada para el examen microscópico de minerales, materiales como polímeros y cerámicas, células, proteínas y trazas forenses. Un microscopio Raman comienza con un microscopio óptico estándar y agrega un láser de excitación, un monocromador o policromador y un detector sensible (como un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) o un tubo fotomultiplicador (PMT)). FT-Raman también se ha utilizado con microscopios, generalmente en combinación con excitación láser de infrarrojo cercano (NIR). Se deben usar microscopios ultravioleta y óptica mejorada UV cuando se usa una fuente de láser UV para la microespectroscopia Raman.

En imágenes directas (también denominadas imágenes globales o iluminación de campo amplio), se examina todo el campo de visión en busca de dispersión de luz integrada en un pequeño rango de números de onda (desplazamientos Raman). Por ejemplo, podría usarse una característica de número de onda para el colesterol para registrar la distribución del colesterol dentro de un cultivo celular. Esta técnica se está utilizando para la caracterización de dispositivos a gran escala, mapeo de diferentes compuestos y estudio de dinámicas. Ya se ha utilizado para la caracterización de capas de grafeno, tintes con agregado de J dentro de nanotubos de carbono y muchos otros materiales 2D como MoS2 y WSe2. Dado que el haz de excitación se dispersa por todo el campo de visión, esas mediciones se pueden realizar sin dañar la muestra.

El enfoque más común es la imágenes hiperespectrales o imágenes químicas, en las que se adquieren miles de espectros Raman de todo el campo de visión mediante, por ejemplo, exploración de trama de un rayo láser enfocado a través de una muestra. Los datos se pueden utilizar para generar imágenes que muestren la ubicación y la cantidad de diferentes componentes. Tener la información espectroscópica completa disponible en cada punto de medición tiene la ventaja de que se pueden mapear varios componentes al mismo tiempo, incluidas formas químicamente similares e incluso polimórficas, que no se pueden distinguir mediante la detección de un solo número de onda. Además, las propiedades del material, como la tensión y la tensión, la orientación del cristal, la cristalinidad y la incorporación de iones extraños en las redes cristalinas (p. ej., dopaje, series de soluciones sólidas) se pueden determinar a partir de mapas hiperespectrales. Tomando el ejemplo del cultivo celular, una imagen hiperespectral podría mostrar la distribución del colesterol, así como proteínas, ácidos nucleicos y ácidos grasos. Se pueden utilizar técnicas sofisticadas de procesamiento de señales e imágenes para ignorar la presencia de agua, medios de cultivo, tampones y otras interferencias.

Debido a que un microscopio Raman es un sistema de difracción limitada, su resolución espacial depende de la longitud de onda de la luz, la apertura numérica del elemento de enfoque y, en el caso de la microscopía confocal, del diámetro de la apertura confocal. Cuando se opera en el rango visible a infrarrojo cercano, un microscopio Raman puede lograr resoluciones laterales de aprox. 1 µm hasta 250 nm, según la longitud de onda y el tipo de lente del objetivo (por ejemplo, lentes de inmersión en aire vs. o en aceite). La resolución de profundidad (si no está limitada por la profundidad de penetración óptica de la muestra) puede oscilar entre 1 y 6 µm con la apertura del orificio confocal más pequeño hasta decenas de micrómetros cuando se opera sin un orificio confocal. Dependiendo de la muestra, la alta densidad de potencia del láser debido al enfoque microscópico puede tener el beneficio de un fotoblanqueo mejorado de moléculas que emiten fluorescencia de interferencia. Sin embargo, la longitud de onda del láser y la potencia del láser deben seleccionarse cuidadosamente para cada tipo de muestra para evitar su degradación.

Las aplicaciones de las imágenes Raman van desde la ciencia de los materiales hasta los estudios biológicos. Para cada tipo de muestra, los parámetros de medición deben optimizarse individualmente. Por esa razón, los microscopios Raman modernos a menudo están equipados con varios láseres que ofrecen diferentes longitudes de onda, un conjunto de lentes objetivo y filtros de densidad neutra para ajustar la potencia del láser que llega a la muestra. La selección de la longitud de onda del láser depende principalmente de las propiedades ópticas de la muestra y del objetivo de la investigación. Por ejemplo, la microscopía Raman de muestras biológicas y médicas a menudo se realiza mediante excitación de rojo a infrarrojo cercano (por ejemplo, 785 nm o 1064 nm de longitud de onda). Debido a las absorbancias típicamente bajas de las muestras biológicas en este rango espectral, se reduce el riesgo de dañar la muestra y la emisión de autofluorescencia, y se pueden lograr altas profundidades de penetración en los tejidos. Sin embargo, la intensidad de la dispersión Raman en longitudes de onda largas es baja (debido a la dependencia ω⁴ de la intensidad de la dispersión Raman), lo que lleva a tiempos de adquisición prolongados. Por otro lado, las imágenes de resonancia Raman de algas unicelulares a 532 nm (verde) pueden sondear específicamente la distribución de carotenoides dentro de una célula mediante el uso de una potencia láser baja de ~5 µW y un tiempo de adquisición de solo 100 ms.

La dispersión Raman, específicamente la espectroscopia Raman mejorada con la punta, produce imágenes hiperespectrales de alta resolución de moléculas individuales, átomos y ADN.

Dependencia de la polarización de la dispersión Raman

La dispersión Raman es sensible a la polarización y puede proporcionar información detallada sobre la simetría de los modos activos Raman. Mientras que la espectroscopia Raman convencional identifica la composición química, los efectos de polarización en los espectros Raman pueden revelar información sobre la orientación de las moléculas en monocristales y materiales anisotrópicos, p. láminas plásticas tensadas, así como la simetría de los modos vibratorios.

La espectroscopia Raman dependiente de la polarización utiliza excitación láser polarizada (plana) de un polarizador. La luz dispersada Raman recolectada pasa a través de un segundo polarizador (llamado analizador) antes de ingresar al detector. El analizador se orienta paralelo o perpendicular a la polarización del láser. Los espectros adquiridos con el analizador configurado tanto en forma perpendicular como paralela al plano de excitación se pueden utilizar para calcular la relación de despolarización. Por lo general, también se coloca un codificador de polarización entre el analizador y el detector. Es conveniente en la espectroscopia Raman polarizada describir las direcciones de propagación y polarización utilizando la notación de Porto, descrita y nombrada en honor al físico brasileño Sergio Pereira da Silva Porto.

Para soluciones isotrópicas, la dispersión Raman de cada modo retiene la polarización del láser o se despolariza parcial o totalmente. Si el modo de vibración involucrado en el proceso de dispersión Raman es totalmente simétrico, entonces la polarización de la dispersión Raman será la misma que la del rayo láser entrante. En el caso de que el modo vibratorio no sea totalmente simétrico, la polarización se perderá (codificado) parcial o totalmente, lo que se denomina despolarización. Por lo tanto, la espectroscopia Raman polarizada puede proporcionar información detallada sobre las etiquetas de simetría de los modos de vibración.

En estado sólido, la espectroscopia Raman polarizada puede ser útil en el estudio de muestras orientadas, como monocristales. La polarizabilidad de un modo de vibración no es igual a lo largo y ancho del enlace. Por lo tanto, la intensidad de la dispersión Raman será diferente cuando la polarización del láser sea a lo largo y ortogonal a un eje de enlace particular. Este efecto puede proporcionar información sobre la orientación de las moléculas con un solo cristal o material. La información espectral que surge de este análisis se usa a menudo para comprender la orientación macromolecular en redes cristalinas, cristales líquidos o muestras de polímeros.

Caracterización de la simetría de un modo vibracional

La técnica de polarización es útil para comprender las conexiones entre la simetría molecular, la actividad Raman y los picos en los espectros Raman correspondientes. La luz polarizada en una dirección solo da acceso a algunos modos activos de Raman, pero rotar la polarización da acceso a otros modos. Cada modo se separa según su simetría.

La simetría de un modo vibratorio se deduce de la relación de despolarización ρ, que es la proporción de la dispersión del Raman con polarización ortogonal al láser del incidente y la dispersión del Raman con la misma polarización que el láser del incidente: ${displaystyle rho ={frac {I_{r} {I_{u}}}$ Aquí. ${displaystyle Yo...$ es la intensidad de dispersión de Raman cuando el analizador se gira 90 grados con respecto al eje de polarización de la luz del incidente, y ${displaystyle I_{u}$ la intensidad de dispersión de Raman cuando el analizador está alineado con la polarización del láser del incidente. Cuando la luz polarizada interactúa con una molécula, distorsiona la molécula que induce un efecto igual y opuesto en la onda plana, causando que sea rota por la diferencia entre la orientación de la molécula y el ángulo de polarización de la onda de luz. Si ${textstyle rho geq {frac {3}{4}}$, entonces las vibraciones en esa frecuencia son depolarized; significando que no son totalmente simétricos.

Variantes

Se han desarrollado al menos 25 variaciones de la espectroscopia Raman. El propósito habitual es mejorar la sensibilidad (por ejemplo, Raman mejorado en superficie), mejorar la resolución espacial (microscopía Raman) o adquirir información muy específica (Raman de resonancia).

Espectroscopia Raman espontánea (o de campo lejano)

Imagen correlativa del Raman: Comparación de imágenes topográficas (AFM, top) y Raman de GaSe. La barra de escala es de 5 μm.

Términos como espectroscopia Raman espontánea o espectroscopia Raman normal resumen las técnicas de espectroscopia Raman basadas en la dispersión Raman mediante el uso de óptica de campo lejano normal como se describe anteriormente. Existen variantes de la espectroscopia Raman normal con respecto a las geometrías de detección de excitación, la combinación con otras técnicas, el uso de ópticas especiales (polarizantes) y la elección específica de longitudes de onda de excitación para mejorar la resonancia.

• Imágenes correlativas de Raman – La microscopía de Raman se puede combinar con métodos de imagen complementarios, como la microscopía de fuerza atómica (Raman-AFM) y la microscopía electrónica de escaneo (Raman-SEM) para comparar los mapas de distribución de Raman con imágenes topográficos o morfológicas (o superpuestas) y correlacionar espectros de Raman con información física o química complementaria (por ejemplo, obtenida por SEM-EDX).
• Resonancia espectroscopia Raman – La longitud de onda de excitación se corresponde con una transición electrónica de la molécula o el cristal, de modo que los modos vibratorios asociados con el estado electrónico excitado se mejoran considerablemente. Esto es útil para estudiar moléculas grandes como polipéptidos, que podrían mostrar cientos de bandas en espectros "convencionales" Raman. También es útil para asociar modos normales con sus cambios de frecuencia observados.
• Espectroscopía Raman resuelta en ángulo – No sólo se registran los resultados estándar de Raman, sino también el ángulo con respecto al láser del incidente. Si se conoce la orientación de la muestra, también se puede obtener información detallada sobre la relación de dispersión fonónica de una sola prueba.
• Pinzas ópticas espectroscopia de Raman (OTRS) – Se utiliza para estudiar partículas individuales, e incluso procesos bioquímicos en células individuales atrapadas por pinzas ópticas.
• Espectroscopia de Raman (SORS) – El Raman dispersándose bajo una superficie oscura se recupera de una resta escalada de dos espectros tomados en dos puntos de compensación espacial.
• Actividad óptica Raman (ROA) – Mide la actividad óptica vibracional por medio de una pequeña diferencia en la intensidad del Raman dispersando de las moléculas chiral en la luz de incidente polarizada derecha e izquierda o, equivalentemente, un pequeño componente circularizado en la luz dispersa.
• Transmission Raman – Permite la extracción de un volumen significativo de un material turbido, como polvos, cápsulas, tejido vivo, etc. It was largely ignored following investigations in the late 1960s (Schrader and Bergmann, 1967) but was rediscovered in 2006 as a means of rapid assay of pharmaceutical dosage forms. Hay aplicaciones médicas de diagnóstico especialmente en la detección del cáncer.
• Sustratos de microcavidad – Un método que mejora el límite de detección de espectros convencionales Raman usando micro-Raman en una micro-cavidad recubierta con reflexiva Au o Ag. La micro-cavidad tiene un radio de varios micrometros y mejora toda la señal Raman proporcionando múltiples excitaciones de la muestra y combina los fotones Raman de antemano hacia la óptica de la colección en la geometría de Raman.
• Control remoto Raman. En el standoff Raman, la muestra se mide a una distancia del espectrómetro Raman, generalmente utilizando un telescopio para la recogida de luz. La espectroscopía remota del Raman se propuso en la década de 1960 y se desarrolló inicialmente para la medición de gases atmosféricos. La técnica fue ampliada en 1992 por Angel et al. para la detección de Raman de compuestos inorgánicos y orgánicos peligrosos.
• Rayos X Raman dispersando – Mide transiciones electrónicas en lugar de vibraciones.

Espectroscopía Raman mejorada (o de campo cercano)

La mejora de la dispersión Raman se logra mediante la mejora del campo eléctrico local mediante efectos ópticos de campo cercano (por ejemplo, plasmones de superficie localizados).

• Espectroscopía Raman mejorada (SERS) – Normalmente en un coloides de plata o oro o un sustrato que contenga plata o oro. Los plasmones superficiales de plata y oro están emocionados por el láser, lo que da lugar a un aumento en los campos eléctricos que rodean el metal. Dado que las intensidades de Raman son proporcionales al campo eléctrico, hay un gran aumento en la señal medida (hasta 10)¹¹). Este efecto fue observado originalmente por Martin Fleischmann, pero la explicación predominante fue propuesta por Van Duyne en 1977. Lombardi y Birke dieron una teoría completa del efecto.
• Resonancia mejorada de la superficie espectroscopia de Raman (SERRS) – Una combinación de SERS y la resonancia de la espectroscopia Raman que utiliza la proximidad a una superficie para aumentar la intensidad de Raman, y la longitud de onda de excitación coincide con la absorción máxima de la molécula analizada.
• Tip-enhanced Raman spectroscopy (TERS) – Usa una punta metálica (generalmente plateada / dorada AFM o STM) para mejorar las señales de Raman de moléculas situadas en sus alrededores. La resolución espacial es aproximadamente el tamaño del ápice de punta (20–30 nm). TERS ha demostrado tener sensibilidad al nivel de molécula única y tiene cierta promesa de aplicaciones de bioanálisis y secuenciación de ADN. TERS fue utilizado para imaginar los modos normales vibratorios de moléculas individuales.
• Polariton de plasmón de superficie mejorada dispersión de Raman (SPPERS) – Este enfoque explota puntas cópicas metálicas apertureless para la excitación de campo cercano de moléculas. Esta técnica difiere del enfoque TERS debido a su capacidad inherente de suprimir el campo de fondo. De hecho, cuando una fuente de láser apropiada impida en la base del cono, un modo TM0 (modo polaritonico) se puede crear localmente, a saber, lejos del punto de excitación (apex de la punta). El modo puede propagarse a lo largo de la punta sin producir ningún campo de radiación hasta el ápice de la punta donde interactúa con la molécula. De esta manera, el plano focal está separado del plano de excitación por una distancia dada por la longitud de la punta, y ningún fondo juega ningún papel en la excitación Raman de la molécula.

Espectroscopía Raman no lineal

Las mejoras de la señal Raman se logran a través de efectos ópticos no lineales, que generalmente se logran al mezclar dos o más longitudes de onda emitidas por láseres pulsados espacial y temporalmente sincronizados.

• Hyper Raman – Un efecto no lineal en el que los modos vibratorios interactúan con la segunda armónica del haz de excitación. Esto requiere un poder muy alto, pero permite la observación de modos vibratorios que normalmente son " silenciosos". Con frecuencia se basa en la mejora del tipo SERS para aumentar la sensibilidad.
• Estimulado espectroscopia de Raman (SRS) – Una técnica de probe de bomba, donde un pulso espacialmente coincidente, de dos colores (con polarización ya sea paralela o perpendicular) transfiere a la población de tierra a un estado rovibracionalmente excitado. Si la diferencia de energía corresponde a una transición Raman permitida, la luz dispersa corresponderá a la pérdida o ganancia en el haz de la bomba.
• Espectroscopia inversa del Raman – Un sinónimo de espectroscopia de pérdida de Raman estimulada.
• Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) – Dos rayos láser se utilizan para generar un rayo de frecuencia anti-Stokes coherente, que se puede mejorar por resonancia.

Espectroscopia Raman dirigida morfológicamente

La espectroscopia Raman dirigida morfológicamente (MDRS) combina imágenes de partículas automatizadas y microespectroscopia Raman en una única plataforma integrada para proporcionar el tamaño, la forma y la identificación química de las partículas. Las imágenes de partículas automatizadas determinan el tamaño de las partículas y las distribuciones de formas de los componentes dentro de una muestra combinada a partir de imágenes de partículas individuales. La información recopilada a partir de imágenes de partículas automatizadas se utiliza luego para dirigir el análisis espectroscópico Raman. El proceso analítico espectroscópico Raman se realiza en un subconjunto de partículas seleccionado al azar, lo que permite la identificación química de los múltiples componentes de la muestra. Se pueden generar imágenes de decenas de miles de partículas en cuestión de minutos utilizando el método MDRS, lo que hace que el proceso sea ideal para el análisis forense y la investigación de productos farmacéuticos falsificados y las adjudicaciones posteriores.