Electroporación

Cuvettes for in-vitro electroporation. Son de plástico con electrodos de aluminio y tapa azul. Tienen un máximo de 400 μl.

La electroporación, o electropermeabilización, es una técnica de microbiología en la que se aplica un campo eléctrico a las células para aumentar la permeabilidad de la membrana celular, lo que permite que sustancias químicas, fármacos, conjuntos de electrodos o ADN para ser introducido en la célula (también llamado electrotransferencia). En microbiología, el proceso de electroporación se usa a menudo para transformar bacterias, levaduras o protoplastos de plantas mediante la introducción de nuevo ADN codificante. Si las bacterias y los plásmidos se mezclan, los plásmidos se pueden transferir a las bacterias después de la electroporación, aunque dependiendo de lo que se transfiera, también se pueden usar péptidos de penetración celular o CellSqueeze. La electroporación funciona pasando miles de voltios (~8 kV/cm) a través de células suspendidas en una cubeta de electroporación. Posteriormente, las células deben manipularse con cuidado hasta que hayan tenido la oportunidad de dividirse, produciendo nuevas células que contienen plásmidos reproducidos. Este proceso es aproximadamente diez veces más eficaz para aumentar la permeabilidad de la membrana celular que la transformación química.

La electroporación también es muy eficaz para la introducción de genes extraños en células de cultivo de tejidos, especialmente células de mamíferos. Por ejemplo, se utiliza en el proceso de producción de ratones knockout, así como en el tratamiento de tumores, la terapia génica y la terapia basada en células. El proceso de introducción de ADN extraño en células eucariotas se conoce como transfección. La electroporación es muy eficaz para transfectar células en suspensión utilizando cubetas de electroporación. La electroporación ha demostrado ser eficaz para su uso en tejidos in vivo, para aplicaciones in utero y transfección in ovo. Las células adherentes también se pueden transfectar mediante electroporación, lo que proporciona a los investigadores una alternativa a la tripsinización de sus células antes de la transfección. Sin embargo, una desventaja de la electroporación es que, después del proceso, la expresión génica de más de 7000 genes puede verse afectada. Esto puede causar problemas en estudios en los que se debe controlar la expresión génica para garantizar resultados exactos y precisos.

Aunque la electroporación a granel tiene muchos beneficios sobre los métodos de administración física, como las microinyecciones y las pistolas genéticas, todavía tiene limitaciones, incluida la viabilidad celular baja. Se ha estudiado la miniaturización de la electroporación, lo que lleva a la microelectroporación y la nanotransfección de tejido utilizando técnicas basadas en la electroporación a través de nanocanales para entregar la carga a las células de manera mínimamente invasiva.

La electroporación también se ha utilizado como mecanismo para desencadenar la fusión celular. La fusión celular inducida artificialmente se puede utilizar para investigar y tratar diferentes enfermedades, como la diabetes, regenerar axones del sistema nervioso central y producir células con las propiedades deseadas, como en las vacunas celulares para la inmunoterapia contra el cáncer. Sin embargo, la primera y más conocida aplicación de la fusión celular es la producción de anticuerpos monoclonales en la tecnología de hibridomas, donde las líneas celulares híbridas (hibridomas) se forman fusionando linfocitos B productores de anticuerpos específicos con una línea celular de mieloma (cáncer de linfocitos B).

Práctica de laboratorio

La electroporación se realiza con electroporadores, aparatos especialmente diseñados que crean un campo electrostático en una solución celular. La suspensión de células se pipetea en una cubeta de vidrio o plástico que tiene dos electrodos de aluminio en sus lados. Para la electroporación bacteriana, normalmente se usa una suspensión de alrededor de 50 microlitros. Antes de la electroporación, esta suspensión de bacterias se mezcla con el plásmido a transformar. La mezcla se pipetea en la cubeta, se ajustan el voltaje y la capacitancia, y la cubeta se inserta en el electroporador. El proceso requiere contacto directo entre los electrodos y la suspensión. Inmediatamente después de la electroporación, se agrega un mililitro de medio líquido a las bacterias (en la cubeta o en un tubo Eppendorf) y el tubo se incuba a la temperatura óptima de las bacterias durante una hora o más para permitir la recuperación de las células. y expresión del plásmido, seguido de cultivo bacteriano en placas de agar.

El éxito de la electroporación depende en gran medida de la pureza de la solución de plásmido, especialmente de su contenido de sal. Las soluciones con altas concentraciones de sal pueden causar una descarga eléctrica (conocida como formación de arco), que a menudo reduce la viabilidad de las bacterias. Para una investigación más detallada del proceso, se debe prestar más atención a la impedancia de salida del dispositivo porador y la impedancia de entrada de la suspensión de células (por ejemplo, contenido de sal).

Dado que la membrana celular no puede pasar corriente (excepto en los canales iónicos), actúa como un condensador eléctrico. Someter las membranas a un campo eléctrico de alto voltaje da como resultado su descomposición temporal, lo que da como resultado poros que son lo suficientemente grandes como para permitir que las macromoléculas (como el ADN) entren o salgan de la célula.

Además, la electroporación se puede utilizar para aumentar la permeabilidad de las células durante las inyecciones y cirugías en el útero. En particular, la electroporación permite una transfección más eficiente de ADN, ARN, shARN y todos los ácidos nucleicos en las células de ratones y ratas. El éxito de la electroporación in vivo depende en gran medida del voltaje, la repetición, los pulsos y la duración. Los sistemas nerviosos centrales en desarrollo son más eficaces para la electroporación in vivo debido a la visibilidad de los ventrículos para las inyecciones de ácidos nucleicos, así como a la mayor permeabilidad de las células en división. La electroporación de embriones inyectados en el útero se realiza a través de la pared del útero, a menudo con electrodos tipo fórceps para limitar el daño al embrión.

Estudios in vitro y en animales

in vivo se describió por primera vez en 1991 y hoy en día hay muchos estudios preclínicos de electrotransferencia de genes. El método se utiliza para entregar una gran variedad de genes terapéuticos para el tratamiento potencial de varias enfermedades, tales como: trastornos en el sistema inmunológico, tumores, trastornos metabólicos, enfermedades monogenéticas, enfermedades cardiovasculares, analgesia….

Con respecto a la electroporación irreversible, el primer tratamiento exitoso de tumores cutáneos malignos implantados en ratones fue completado en 2007 por un grupo de científicos que lograron la ablación completa del tumor en 12 de 13 ratones. Lo lograron enviando 80 pulsos de 100 microsegundos a 0,3 Hz con una magnitud de campo eléctrico de 2500 V/cm para tratar los tumores cutáneos. Actualmente, varias empresas, incluidas AngioDynamics, Inc. y VoltMed, Inc., continúan desarrollando e implementando tecnologías basadas en electroporación irreversible dentro de entornos clínicos.

El primer grupo que analizó la electroporación para aplicaciones médicas fue dirigido por Lluis M Mir en el Instituto Gustave Roussy. En este caso, estudiaron el uso de electroporación reversible junto con macromoléculas impermeables. La primera investigación que analizó cómo se podrían usar los pulsos de nanosegundos en las células humanas fue realizada por investigadores de la Escuela de Medicina de Virginia del Este y la Universidad de Old Dominion, y se publicó en 2003.

Aplicaciones médicas

La primera aplicación médica de la electroporación se usó para introducir medicamentos contra el cáncer poco permeables en los nódulos tumorales. Pronto también la electrotransferencia de genes cobró especial interés por su bajo coste, facilidad de realización y seguridad. Es decir, los vectores virales pueden tener serias limitaciones en términos de inmunogenicidad y patogenicidad cuando se usan para la transferencia de ADN.

Se encontró un voltaje más alto de electroporación en cerdos para destruir irreversiblemente las células objetivo dentro de un rango estrecho sin afectar a las células vecinas y, por lo tanto, representa un nuevo tratamiento prometedor para el cáncer, las enfermedades cardíacas y otras enfermedades que requieren la eliminación de tejido. Desde entonces, la electroporación irreversible (IRE) ha demostrado ser eficaz en el tratamiento del cáncer humano, y los cirujanos de Johns Hopkins y otras instituciones ahora utilizan la tecnología para tratar el cáncer de páncreas que antes se pensaba que era irresecable.

También se informó el primer ensayo clínico de fase I de electrotransferencia de genes en pacientes con melanoma metastásico. Se realizó el suministro mediado por electroporación de un gen codificante de plásmido para la interleucina-12 (pIL-12) y se controlaron la seguridad, la tolerabilidad y el efecto terapéutico. El estudio concluyó que la electrotransferencia de genes con pIL-12 es segura y bien tolerada. Además, también se observó una respuesta parcial o completa en metástasis a distancia no tratadas, lo que sugiere el efecto del tratamiento sistémico. En base a estos resultados, ya están planeando pasar al estudio clínico de Fase II. Actualmente hay varios estudios clínicos en curso de electrotransferencia de genes en los que se supervisa la seguridad, la tolerabilidad y la eficacia de la inmunización con vacuna de ADN, que se administra mediante pulsos eléctricos.

Aunque el método no es sistémico, sino estrictamente local, sigue siendo la estrategia no viral más eficiente para la administración de genes.

N-NEUMÁTICO

Una técnica reciente llamada electroporación irreversible no térmica (N-TIRE) ha demostrado su eficacia en el tratamiento de muchos tipos diferentes de tumores y otros tejidos no deseados. Este procedimiento se realiza utilizando pequeños electrodos (aproximadamente 1 mm de diámetro), colocados dentro o alrededor del tejido objetivo para aplicar ráfagas de electricidad cortas y repetitivas a un voltaje y una frecuencia predeterminados. Estas ráfagas de electricidad aumentan el potencial transmembrana en reposo (TMP), de modo que se forman nanoporos en la membrana plasmática. Cuando la electricidad aplicada al tejido está por encima del umbral del campo eléctrico del tejido objetivo, las células se vuelven permanentemente permeables a partir de la formación de nanoporos. Como resultado, las células no pueden reparar el daño y mueren debido a la pérdida de homeostasis. N-TIRE es exclusivo de otras técnicas de ablación de tumores en el sentido de que no genera daño térmico en el tejido que lo rodea.

Electroporación reversible

Por el contrario, la electroporación reversible ocurre cuando la electricidad aplicada con los electrodos está por debajo del umbral del campo eléctrico del tejido objetivo. Debido a que la electricidad aplicada está por debajo de las celdas' umbral, permite que las células reparen su bicapa de fosfolípidos y continúen con sus funciones celulares normales. La electroporación reversible generalmente se realiza con tratamientos que implican introducir un fármaco o un gen (u otra molécula que normalmente no es permeable a la membrana celular) en la célula. No todos los tejidos tienen el mismo umbral de campo eléctrico; por lo tanto, es necesario realizar cálculos cuidadosos antes de un tratamiento para garantizar la seguridad y la eficacia.

Una de las principales ventajas de usar N-TIRE es que, cuando se hace correctamente según cálculos cuidadosos, solo afecta el tejido objetivo. Las proteínas, la matriz extracelular y las estructuras críticas, como los vasos sanguíneos y los nervios, no se ven afectadas y quedan saludables con este tratamiento. Esto permite una recuperación más rápida y facilita un reemplazo más rápido de las células tumorales muertas con células sanas.

Antes de realizar el procedimiento, los científicos deben calcular cuidadosamente lo que se debe hacer exactamente y tratar a cada paciente caso por caso. Para hacer esto, la tecnología de imágenes, como tomografías computarizadas y resonancias magnéticas, se usa comúnmente para crear una imagen 3D del tumor. A partir de esta información, pueden aproximar el volumen del tumor y decidir el mejor curso de acción, incluido el sitio de inserción de los electrodos, el ángulo en el que se insertan, el voltaje necesario y más, utilizando tecnología de software. A menudo, se usará una máquina de tomografía computarizada para ayudar con la colocación de electrodos durante el procedimiento, particularmente cuando los electrodos se usan para tratar tumores en el cerebro.

Todo el procedimiento es muy rápido, normalmente tarda unos cinco minutos. La tasa de éxito de estos procedimientos es alta y es muy prometedora para futuros tratamientos en humanos. Una desventaja del uso de N-TIRE es que la electricidad emitida por los electrodos puede estimular la contracción de las células musculares, lo que podría tener consecuencias letales según la situación. Por lo tanto, se debe usar un agente paralizante al realizar el procedimiento. Los agentes paralizantes que se han usado en tales investigaciones son exitosos; sin embargo, siempre existe algún riesgo, aunque sea leve, cuando se utilizan anestésicos.

H-FUEGO

Se ha desarrollado una técnica más reciente llamada electroporación irreversible de alta frecuencia (H-FIRE). Esta técnica utiliza electrodos para aplicar ráfagas bipolares de electricidad a alta frecuencia, a diferencia de las ráfagas unipolares de electricidad a baja frecuencia. Este tipo de procedimiento tiene el mismo éxito en la ablación de tumores que N-TIRE. Sin embargo, tiene una clara ventaja, H-FIRE no causa contracción muscular en el paciente y, por lo tanto, no hay necesidad de un agente paralizante. Además, se ha demostrado que H-FIRE produce ablaciones más predecibles debido a la menor diferencia en las propiedades eléctricas de los tejidos a frecuencias más altas.

Administración de fármacos y genes

La electroporación también se puede utilizar para ayudar a administrar fármacos o genes en la célula mediante la aplicación de pulsos eléctricos cortos e intensos que permeabilizan transitoriamente la membrana celular, lo que permite el transporte de moléculas que de otro modo no se transportarían a través de una membrana celular. Este procedimiento se denomina electroquimioterapia cuando las moléculas a transportar son agentes quimioterapéuticos o electrotransferencia génica cuando la molécula a transportar es ADN. Los científicos del Karolinska Institutet y la Universidad de Oxford utilizan la electroporación de exosomas para administrar siRNA, oligonucleótidos antisentido, agentes quimioterapéuticos y proteínas específicamente a las neuronas después de inyectarlos sistémicamente (en la sangre). Debido a que estos exosomas pueden cruzar la barrera hematoencefálica, este protocolo podría resolver el problema de la mala administración de medicamentos al sistema nervioso central y potencialmente tratar la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y el cáncer cerebral. entre otras condiciones.

La transformación bacteriana es generalmente la forma más fácil de producir grandes cantidades de una proteína en particular necesaria para fines biotecnológicos o en medicina. Dado que la electrotransferencia de genes es una técnica muy simple, rápida y altamente efectiva, se convirtió en un reemplazo muy conveniente para otros procedimientos de transformación.

Investigaciones recientes han demostrado que las ondas de choque podrían usarse para pretratar la membrana celular antes de la electroporación. Se ha demostrado que esta estrategia sinérgica reduce el requisito de voltaje externo y crea poros más grandes. Además, la aplicación de ondas de choque permite que el alcance se dirija al sitio deseado de la membrana. Este procedimiento permite controlar el tamaño del poro.

Mecanismo físico

Esquemática sección transversal que muestra el arreglo teórico de los lípidos en un poro hidrofóbico (top) y un poro hidrofílico (bottom).

La electroporación permite la introducción celular de moléculas grandes altamente cargadas, como el ADN, que nunca se difundirían pasivamente a través del núcleo de la bicapa hidrofóbica. Este fenómeno indica que el mecanismo es la creación de agujeros llenos de agua a escala nm en la membrana. Los electroporos se obtuvieron imágenes ópticas en modelos de bicapa lipídica como bicapas de interfaz de gotas y vesículas unilamelares gigantes, mientras que la adición de proteínas citoesqueléticas como redes de actina a las vesículas unilamelares gigantes parece prevenir la formación de electroporos visibles. También han surgido evidencias experimentales de redes de actina en la regulación de la permeabilidad de la membrana celular. Aunque tanto la electroporación como la ruptura dieléctrica resultan de la aplicación de un campo eléctrico, los mecanismos involucrados son fundamentalmente diferentes. En la ruptura dieléctrica, el material de la barrera se ioniza, creando una vía conductora. La alteración material es, pues, de naturaleza química. Por el contrario, durante la electroporación, las moléculas de lípidos no se alteran químicamente, sino que simplemente cambian de posición, abriendo un poro que actúa como vía conductora a través de la bicapa cuando se llena de agua.

La electroporación es un fenómeno dinámico que depende del voltaje transmembrana local en cada punto de la membrana celular. En general, se acepta que para una duración y forma de pulso determinadas, existe un umbral de voltaje transmembrana específico para la manifestación del fenómeno de electroporación (de 0,5 V a 1 V). Esto conduce a la definición de un umbral de magnitud de campo eléctrico para la electroporación (E_th). Es decir, solo se someten a electroporación las celdas dentro de las áreas donde E≧E_th. Si se alcanza o supera un segundo umbral (E_ir), la electroporación comprometerá la viabilidad de las células, es decir, electroporación irreversible (IRE).

La electroporación es un proceso de varios pasos con varias fases distintas. Primero, se debe aplicar un pulso eléctrico corto. Los parámetros típicos serían 300–400 mV para < 1 ms a través de la membrana (nota: los voltajes utilizados en los experimentos con celdas suelen ser mucho mayores porque se aplican a grandes distancias a la solución a granel, por lo que el campo resultante a través de la membrana real es solo una pequeña fracción de la polarización aplicada). Tras la aplicación de este potencial, la membrana se carga como un condensador a través de la migración de iones de la solución circundante. Una vez que se alcanza el campo crítico, se produce un rápido reordenamiento localizado en la morfología de los lípidos. Se cree que la estructura resultante es un "pre-poro" ya que no es eléctricamente conductor pero conduce rápidamente a la creación de un poro conductor. La evidencia de la existencia de tales pre-poros proviene principalmente del "parpadeo" de poros, lo que sugiere una transición entre los estados conductor y aislante. Se ha sugerido que estos pre-poros son defectos hidrofóbicos pequeños (~3 Å). Si esta teoría es correcta, entonces la transición a un estado conductivo podría explicarse por un reordenamiento en el borde del poro, en el que las cabezas de lípidos se pliegan para crear una interfaz hidrofílica. Finalmente, estos poros conductores pueden sanar, volver a sellar la bicapa o expandirse, eventualmente rompiéndola. El destino resultante depende de si se superó el tamaño crítico del defecto, que a su vez depende del campo aplicado, la tensión mecánica local y la energía del borde bicapa.

Electroporación de genes

La aplicación de pulsos eléctricos de suficiente fuerza a la célula provoca un aumento en la diferencia de potencial transmembrana, lo que provoca la desestabilización de la membrana. La permeabilidad de la membrana celular aumenta y, de lo contrario, las moléculas no permeables ingresan a la célula. Aunque los mecanismos de la electrotransferencia de genes aún no se comprenden completamente, se demostró que la introducción de ADN solo ocurre en la parte de la membrana que mira hacia el cátodo y que se necesitan varios pasos para una transfección exitosa: migración electroforética de ADN hacia la célula, ADN inserción en la membrana, translocación a través de la membrana, migración de ADN hacia el núcleo, transferencia de ADN a través de la envoltura nuclear y, finalmente, expresión génica. Hay una serie de factores que pueden influir en la eficiencia de la electrotransferencia de genes, como: la temperatura, los parámetros de los pulsos eléctricos, la concentración de ADN, el tampón de electroporación utilizado, el tamaño celular y la capacidad de las células para expresar los genes transfectados. En la electrotransferencia de genes in vivo, la difusión del ADN a través de la matriz extracelular, las propiedades del tejido y la conductividad general del tejido también son cruciales.

Historia

En la década de 1960 se sabía que al aplicar un campo eléctrico externo, se podía crear un gran potencial de membrana en los dos polos de una celda. En la década de 1970 se descubrió que cuando un potencial de membrana alcanzaba un nivel crítico, la membrana se rompía y podía recuperarse. En la década de 1980, esta abertura se usaba para introducir diversos materiales/moléculas en las células.