Complejo previo a la replicación
Un complejo previo a la replicación (pre-RC) es un complejo proteico que se forma en el origen de la replicación durante el paso de iniciación de la replicación del ADN. Se requiere la formación del pre-RC para que se produzca la replicación del ADN. La replicación completa y fiel del genoma garantiza que cada célula hija portará la misma información genética que la célula madre. En consecuencia, la formación del pre-RC es una parte muy importante del ciclo celular.
Componentes
A medida que los organismos evolucionaron y se volvieron cada vez más complejos, también lo hicieron sus organismos anteriores a la RC. A continuación se presenta un resumen de los componentes del pre-RC entre los diferentes ámbitos de la vida.
En las bacterias, el componente principal del pre-RC es el ADN. El pre-RC está completo cuando DnaA ocupa todos sus sitios de unión dentro del origen de replicación bacteriano (oriC). Los sitios particulares en el oriC a los que se une el ADN determinan si la célula tiene un bORC (complejo de reconocimiento de origen bacteriano) o un pre-RC.
El pre-RC arqueal es muy diferente del pre-RC bacteriano y puede servir como un modelo simplificado del pre-RC eucariota. Está compuesto por una proteína del complejo de reconocimiento de origen único (ORC), Cdc6/ORC1, y un homohexámero de la proteína de mantenimiento del minicromosoma (MCM). Sulfolobus islandicus también utiliza un homólogo Cdt1 para reconocer uno de sus orígenes de replicación.
El pre-RC eucariota es el pre-RC más complejo y altamente regulado. En la mayoría de los eucariotas está compuesto por seis proteínas ORC (ORC1-6), Cdc6, Cdt1 y un heterohexámero de las seis proteínas MCM (MCM2-7). Podría decirse que el heterohexámero MCM surgió a través de eventos de duplicación del gen MCM y la posterior evolución divergente. La pre-RC de Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) es notablemente diferente a la de otros eucariotas; Cdc6 es reemplazada por la proteína homóloga Cdc18. Sap1 también está incluido en S. pombe pre-RC porque es necesario para el enlace Cdc18. El pre-RC de Xenopus laevis (X. laevis) también tiene una proteína adicional, MCM9, que ayuda a cargar el heterohexámero MCM en el origen de replicación. Se ha resuelto la estructura del ORC, MCM, así como el complejo intermedio ORC-Cdc6-Cdt1-Mcm2-7 (OCCM).
Reconocimiento del origen de replicación
El reconocimiento del origen de la replicación es un primer paso crítico en la formación del pre-RC. En diferentes ámbitos de la vida este proceso se lleva a cabo de manera diferente.
En los procariotas, el reconocimiento del origen se logra mediante el ADN. DnaA se une firmemente a una secuencia consenso de 9 pares de bases en oriC; 5' – TTATCCCACA – 3'. Hay 5 secuencias de 9 pb (R1-R5) y 4 secuencias no consensuadas (I1-I4) dentro de oriC a las que DnaA se une con afinidad diferencial. El ADNA se une a R4, R1 y R2 con alta afinidad y a R5, I1, I2, I3 y R3 con menor afinidad. In vivo, se ha observado que la unión del ADNA a los sitios de reconocimiento se produce en el orden: R1, R2 y luego R4, lo que forma el bORC. Posteriormente, los otros sitios de reconocimiento de 9 pb de menor afinidad se unen al DnaA, que forma el pre-RC.
Las arqueas tienen entre 1 y 3 orígenes de replicación. Los orígenes son generalmente zonas ricas en AT que varían según las especies de arqueas. La singular proteína ORC de las arqueas reconoce los tractos ricos en AT y se une al ADN de forma dependiente de ATP.
Los eucariotas suelen tener múltiples orígenes de replicación; al menos uno por cromosoma. Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es el único eucariota conocido con una secuencia de iniciación definida TTTTTATG/ATTTA/T. Esta secuencia de iniciación es reconocida por ORC1-5. No se sabe que ORC6 se una al ADN en S. cerevisiae. Secuencias de iniciación en S. pombe y los eucariotas superiores no están bien definidos. Sin embargo, las secuencias de iniciación generalmente son ricas en AT o exhiben una topología de ADN curvada o doblada. Se sabe que la proteína ORC4 se une a la porción rica en AT del origen de replicación en S. pombe usando motivos de gancho AT. El mecanismo de reconocimiento del origen en eucariotas superiores no se comprende bien, pero se cree que las proteínas ORC1-6 dependen de una topología inusual del ADN para su unión.
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La Asamblea del complejo de pre-replicación sólo ocurre durante la fase M tardía y la fase G1 temprana del ciclo celular cuando la actividad kinase dependiente de ciclones (CDK) es baja. Este momento y otros mecanismos regulatorios aseguran que la replicación del ADN sólo se producirá una vez por ciclo celular. La Asamblea del pre-RC se basa en el reconocimiento de origen previo, ya sea por DnaA en prokaryotes o por ORC en arqueas y eucariotas.
El pre-RC de procariotas se completa cuando DNAA ocupa todos los sitios de unión posibles dentro del ORIC. DNAA solo puede unirse a los sitios de baja afinidad en el orico una vez que el FIS de la proteína se elimina del orico. La eliminación de FIS, la proteína IHF (factor huésped integrado) se une a un sitio entre R1 y R2, lo que permite que ADNA se una a los sitios de baja afinidad en el orico. Esto completa el pre-RC.
El pre-RC de archaea requiere la unión ORC del origen. Después de esto, Cdc6 y el complejo homohexameric MCM se unen de manera secuencial.
Los Eukaryotes tienen el pre-RC más complejo. Después de que el ORC1-6 atan el origen de la replicación, Cdc6 es reclutado. Cdc6 recluta el factor de licencia Cdt1 y MCM2-7. Cdt1 binding and ATP hydrolysis by the ORC and Cdc6 load MCM2-7 into DNA. Hay un exceso estoquiométrico de las proteínas MCM sobre las proteínas ORC y Cdc6, indicando que puede haber múltiples heterohexameros MCM ligados a cada origen de la replicación.
Inicio de replicación
Una vez formado el pre-RC, debe activarse y ensamblarse el replisoma para que se produzca la replicación del ADN.
En los procariotas, el ADNA hidroliza el ATP para desenrollar el ADN en el oriC. Esta región desnaturalizada es accesible para la helicasa DnaB y el cargador de helicasa DnaC. Las proteínas de unión monocatenarias estabilizan la burbuja de replicación recién formada e interactúan con la DnaG primasa. DnaG recluta la ADN polimerasa III replicativa y comienza la replicación.
En eucariotas, el heterohexámero de MCM es fosforilado por CDC7 y CDK, que desplaza a Cdc6 y recluta a MCM10. MCM10 coopera con MCM2-7 en el reclutamiento de Cdc45. Luego, Cdc45 recluta componentes clave del replisoma; la ADN polimerasa replicativa α y su primasa. Entonces puede comenzar la replicación del ADN.
Prevención del reensamblaje complejo previo a la replicación
Durante cada ciclo celular, es importante que el genoma sea completamente replicado una y única vez. La formación del complejo de pre-replicación durante la fase M tardía y G1 temprano es necesaria para la replicación del genoma, pero después de que el genoma haya sido replicado el pre-RC no debe formarse nuevamente hasta el próximo ciclo celular.
En procariotas, varios estudios han demostrado que el pre-RC es un complejo que sólo está presente durante una fracción del ciclo celular. Una vez que se produce una división celular, el pre-RC debe volver al bORC para garantizar que solo se produzca una ronda de replicación del ADN durante la división. En E. coli, hay 11 sitios GATC en el oriC que sufren hemimetilación durante la replicación del ADN. La proteína SeqA se une a estos sitios impidiendo la remetilación y bloqueando la unión de DnaA a sitios de baja afinidad durante aproximadamente un tercio del ciclo celular. Sin embargo, SeqA no impide que DnaA se una a los sitios R1, R2 y R4. Por lo tanto, el bORC se reinicia y está preparado para sufrir otra conversión al pre-RC.
En S. cerevisiae, las CDK previenen la formación del complejo de replicación durante las fases tardías G1, S y G2 al excluir MCM2-7 y Cdt1 del núcleo, dirigirse a Cdc6 para su degradación por parte del proteosoma y disociar ORC1-6 de la cromatina. mediante fosforilación. La prevención de la nueva replicación en S. pombe es ligeramente diferente; Cdt1 es degradado por el proteosoma en lugar de simplemente ser excluido del núcleo. La regulación proteolítica de Cdt1 es compartida por eucariotas superiores, incluidos Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster y X. laevis y mamíferos. Los metazoos tienen un cuarto mecanismo para impedir la nueva replicación; durante S y G2, la geminina se une a Cdt1 e inhibe que Cdt1 cargue MCM2-7 en el origen de replicación.
Síndrome de Meier-Gorlin
Se sabe que los defectos en los componentes del complejo de replicación eucariota causan el síndrome de Meier-Gorlin, que se caracteriza por enanismo, rótulas ausentes o hipoplásicas, orejas pequeñas, crecimiento pre y postnatal deficiente y microcefalia. Las mutaciones conocidas se encuentran en los genes ORC1, ORC4, ORC6, CDT1 y CDC6. El fenotipo de la enfermedad probablemente se origina en una capacidad reducida de las células para proliferar, lo que conduce a un número de células y a un fallo general del crecimiento.