Ureasa

ureas (EC 3.5.1.5), funcionalmente, pertenecen a la superfamilia de las amidohidrolasas y las fosfotriesterasas. Las ureas se encuentran en numerosas bacterias, hongos, algas, plantas y algunos invertebrados, así como en los suelos, como enzimas del suelo. Son metaloenzimas que contienen níquel de alto peso molecular.

Estas enzimas catalizan la hidrólisis de la urea en dióxido de carbono y amoníaco:

(NH)₂)₂CO + H₂O Esfuerzo→ CO₂ + 2NH₃

La hidrólisis de la urea se produce en dos etapas. En la primera etapa se producen amoníaco y ácido carbámico. El carbamato se hidroliza espontánea y rápidamente a amoníaco y ácido carbónico. La actividad de la ureasa aumenta el pH de su entorno a medida que se produce amoníaco, que es básico.

Historia

Su actividad fue identificada por primera vez en 1876 por Frédéric Alphonse Musculus como un fermento soluble. En 1926, James B. Sumner demostró que la ureasa es una proteína al examinar su forma cristalizada. El trabajo de Sumner fue la primera demostración de que una proteína puede funcionar como una enzima y finalmente llevó al reconocimiento de que la mayoría de las enzimas son, de hecho, proteínas. La ureasa fue la primera enzima cristalizada. Por este trabajo, Sumner recibió el premio Nobel de química en 1946. La estructura cristalina de la ureasa fue resuelta por primera vez por P. A. Karplus en 1995.

Estructura

Un estudio de 1984 que se centró en la ureasa del frijol jack descubrió que el sitio activo contiene un par de centros de níquel. La activación in vitro también se ha logrado con manganeso y cobalto en lugar de níquel. Las sales de plomo son inhibidoras.

El peso molecular es 480 kDa o 545 kDa para la ureasa de frijol jack (masa calculada a partir de la secuencia de aminoácidos). 840 aminoácidos por molécula, de los cuales 90 son residuos de cisteína.

El pH óptimo es 7,4 y la temperatura óptima es 60 °C. Los sustratos incluyen urea e hidroxiurea.

Las ureasas bacterianas se componen de tres subunidades distintas, una catalítica grande (α 60–76 kDa) y dos pequeñas (β 8–21 kDa, γ 6–14 kDa) que se forman comúnmente (αβγ)₃ estequiometría de trímeros con una estructura simétrica de 2 veces (observe que la imagen de arriba da la estructura de la unidad asimétrica, un tercio del verdadero ensamblaje biológico), son enzimas ricas en cisteína, lo que da como resultado masas molares de enzimas entre 190 y 300 kDa.

Una ureasa excepcional se obtiene de Helicobacter sp.. Estas se componen de dos subunidades, α(26–31 kDa)-β(61–66 kDa). Estas subunidades forman un complejo dodecamérico supramolecular (αβ)₁₂. de subunidades α-β repetidas, cada par de subunidades acopladas tiene un sitio activo, para un total de 12 sitios activos. Desempeña una función esencial para la supervivencia, neutralizando el ácido gástrico al permitir que la urea entre en el periplasma a través de un canal de urea activado por protones. La presencia de ureasa se utiliza en el diagnóstico de especies de Helicobacter.

Todas las ureasas bacterianas son únicamente citoplasmáticas, excepto las de Helicobacter pylori, que junto con su actividad citoplasmática, tiene actividad externa con las células huésped. Por el contrario, todas las ureasas vegetales son citoplasmáticas.

Las ureas fúngicas y vegetales se componen de subunidades idénticas (~90 kDa cada una), generalmente ensambladas como trímeros y hexámeros. Por ejemplo, la ureasa de frijol jack tiene dos subunidades estructurales y una catalítica. La subunidad α contiene el sitio activo, está compuesta por 840 aminoácidos por molécula (90 cisteínas), su masa molecular sin iones Ni(II) asciende a 90,77 kDa. La masa del hexámero con los 12 iones de níquel es de 545,34 kDa. Otros ejemplos de estructuras homohexaméricas de ureasas vegetales son las enzimas de semillas de soja, guandú y algodón.

Es importante tener en cuenta que, aunque se componen de diferentes tipos de subunidades, las ureasas de diferentes fuentes que se extienden desde bacterias hasta plantas y hongos exhiben una alta homología de secuencias de aminoácidos. La cadena de ureasa de una sola planta es equivalente a una organización γ-β-α fusionada. La Helicobacter "α" es equivalente a una fusión de las subunidades γ-β bacterianas normales, mientras que su "β" La subunidad es equivalente a la α bacteriana normal. La organización de tres cadenas es probablemente ancestral.

Actividad

El k_cat/K_m de la ureasa en el procesamiento de la urea es 10¹⁴ veces mayor que la velocidad de la reacción de eliminación no catalizada de la urea. Hay muchas razones para esta observación en la naturaleza. La proximidad de la urea a los grupos activos en el sitio activo junto con la orientación correcta de la urea permiten que la hidrólisis ocurra rápidamente. La urea sola es muy estable debido a las formas de resonancia que puede adoptar. Se entiende que la estabilidad de la urea se debe a su energía de resonancia, que se ha estimado en 30-40 kcal/mol. Esto se debe a que todas las formas de resonancia zwitteriónica donan electrones al carbono del carbonilo, lo que lo hace menos electrófilo y lo hace menos reactivo al ataque nucleofílico.

Sitio activo

El sitio activo de las ureasas se encuentra en las subunidades α (alfa). Es un centro de níquel dimérico bis-μ-hidroxo, con una distancia interatómica de ~3.5 Å. > El par Ni(II) está débilmente acoplado antiferromagnéticamente. Estudios de espectroscopía de absorción de rayos X (XAS) de Canavalia ensiformis (judía), Klebsiella aerogenes y Sporosarcina pasteurii (anteriormente conocida como Bacillus pasteurii) confirman 5–6 iones de níquel coordinados con ligando exclusivamente O/N, incluidos dos ligandos de imidazol por níquel. Se propone sustrato de urea para desplazar ligandos acuosos.

Las moléculas de agua ubicadas hacia la apertura del sitio activo forman un grupo tetraédrico que llena el sitio de la cavidad a través de enlaces de hidrógeno. Se propone que algunos residuos de aminoácidos formen colgajos móviles del sitio, que abren paso al sustrato. Los residuos de cisteína son comunes en la región del colgajo de las enzimas, que se ha determinado que no son esenciales en la catálisis, aunque participan en el posicionamiento apropiado de otros residuos clave en el sitio activo. En la ureasa de Sporosarcina pasteurii, el colgajo se encontró en la conformación abierta, mientras que su conformación cerrada aparentemente es necesaria para la reacción.

Cuando se comparan, las subunidades α de la ureasa de Helicobacter pylori y otras ureasas bacterianas se alinean con las ureasas del frijol.

No se ha observado la unión de la urea al sitio activo de la ureasa.

Mecanismos propuestos

Blakeley/Zerner

Blakely y Zerner propusieron un mecanismo para la catálisis de esta reacción por la ureasa. Comienza con un ataque nucleofílico por parte del oxígeno carbonílico de la molécula de urea sobre el Ni (Ni-1) de 5 coordenadas. Un ligando de agua débilmente coordinado se desplaza en su lugar. Un par solitario de electrones de uno de los átomos de nitrógeno en la molécula de urea crea un doble enlace con el carbono central, y el NH₂⁻ resultante del sustrato coordinado interactúa con un grupo cercano cargado positivamente. Blakeley y Zerner propusieron que este grupo cercano fuera un ion carboxilato, aunque los carboxilatos desprotonados tienen carga negativa.

Una base desprotona un ligando de hidróxido en las seis coordenadas Ni. Posteriormente, el carbono carbonílico es atacado por el oxígeno electronegativo. Un par de electrones del doble enlace nitrógeno-carbono regresa al nitrógeno y neutraliza la carga en él, mientras que el carbono ahora de 4 coordenadas asume una orientación tetraédrica intermedia.

La descomposición de este intermedio es luego ayudada por un grupo sulfhidrilo de una cisteína ubicada cerca del sitio activo. Un hidrógeno se une a uno de los átomos de nitrógeno, rompiendo su enlace con el carbono y liberando un NH₃ molécula. Simultáneamente, se rompe el enlace entre el oxígeno y el níquel de 6 coordenadas. Esto deja un ion carbamato coordinado con el Ni de 5 coordenadas, que luego es desplazado por una molécula de agua, regenerando la enzima.

El carbamato producido luego se degrada espontáneamente para producir otro amoníaco y ácido carbónico.

Hausinger/Karplus

El mecanismo propuesto por Hausinger y Karplus intenta revisar algunos de los problemas aparentes en la vía de Blakely y Zerner y se centra en las posiciones de las cadenas laterales que forman el bolsillo de unión de la urea. De las estructuras cristalinas de K. aerogenes ureasa, se argumentó que la base general utilizada en el mecanismo de Blakely, His³²⁰, estaba demasiado lejos del agua unida a Ni2 para desprotonarse y formar el resto de hidróxido atacante.. Además, no se identificó el ligando ácido general requerido para protonar el nitrógeno de urea. Hausinger y Karplus sugieren un esquema de protonación inversa, donde una forma protonada del ligando His³²⁰ desempeña el papel del ácido general y el agua unida a Ni2 ya está en estado desprotonado. El mecanismo sigue el mismo camino, con la base general omitida (ya que ya no es necesaria) y el His³²⁰ donando su protón para formar la molécula de amoníaco, que luego se libera de la enzima. Si bien la mayoría de los ligandos His³²⁰ y el agua unida no estarán en sus formas activas (protonadas y desprotonadas, respectivamente), se calculó que aproximadamente el 0,3 % de la enzima ureasa total estaría activa en cualquier momento. tiempo. Si bien, lógicamente, esto implicaría que la enzima no es muy eficiente, contrariamente al conocimiento establecido, el uso del esquema de protonación inversa proporciona una ventaja en el aumento de la reactividad de la forma activa, compensando la desventaja. La ubicación del ligando His³²⁰ como un componente esencial en el mecanismo también tiene en cuenta la región del colgajo móvil de la enzima. Como este ligando de histidina es parte del colgajo móvil, la unión del sustrato de urea para la catálisis cierra este colgajo sobre el sitio activo y con la adición del patrón de enlaces de hidrógeno a la urea de otros ligandos en el bolsillo, habla de la selectividad de la ureasa. enzima para la urea.

Ciurli/Mangani

El mecanismo propuesto por Ciurli y Mangani es uno de los puntos de vista más recientes y actualmente aceptados del mecanismo de la ureasa y se basa principalmente en las diferentes funciones de los dos iones de níquel en el sitio activo. Uno de los cuales se une y activa la urea, el otro ion níquel se une y activa la molécula de agua nucleófila. Con respecto a esta propuesta, la urea ingresa a la cavidad del sitio activo cuando la 'aleta' móvil (que permite la entrada de urea al sitio activo) está abierta. La estabilidad de la unión de la urea al sitio activo se logra a través de una red de enlaces de hidrógeno, orientando el sustrato hacia la cavidad catalítica. La urea se une al níquel de cinco coordenadas (Ni1) con el átomo de oxígeno del carbonilo. Se acerca al níquel de seis coordenadas (Ni2) con uno de sus grupos amino y, posteriormente, une los dos centros de níquel. La unión del átomo de oxígeno del carbonilo de la urea al Ni1 se estabiliza a través del estado de protonación de His^α222 N. Además, el cambio conformacional del estado abierto al cerrado del colgajo móvil genera un reordenamiento del grupo carbonilo Ala^α222 de tal manera que su átomo de oxígeno apunta a Ni2. Ala^α170 y Ala^α366 ahora están orientados de manera que sus grupos carbonilo actúan como aceptores de enlaces de hidrógeno hacia el grupo NH₂ de la urea, ayudando así a su unión a Ni2. La urea es un ligando quelante muy pobre debido al bajo carácter de base de Lewis de sus grupos NH₂. Sin embargo, los oxígenos de carbonilo de Ala^α170 y Ala^α366 mejoran la basicidad de los grupos NH₂ y permiten la unión a Ni2. Por lo tanto, en este mecanismo propuesto, el posicionamiento de la urea en el sitio activo es inducido por las características estructurales de los residuos del sitio activo que se posicionan para actuar como donantes de enlaces de hidrógeno en las proximidades de Ni1 y como aceptores en las proximidades de Ni2. La principal diferencia estructural entre el mecanismo Ciurli/Mangani y los otros dos es que incorpora una urea puente de nitrógeno y oxígeno que es atacada por un hidróxido puente.

Acción en la patogenia

Las ureasas bacterianas suelen ser el modo de patogenia de muchas afecciones médicas. Se asocian con encefalopatía hepática/coma hepático, cálculos infecciosos y ulceración péptica.

Piedras de infección

Los cálculos urinarios inducidos por infección son una mezcla de estruvita (MgNH₄PO₄•6H₂O) y carbonato de apatita [Ca₁₀(PO₄)6•CO₃]. Estos iones polivalentes son solubles pero se vuelven insolubles cuando se produce amoníaco a partir de la ureasa microbiana durante la hidrólisis de la urea, ya que esto aumenta el pH del ambiente circundante de aproximadamente 6,5 a 9. La alcalinización resultante da como resultado la cristalización de la piedra. En humanos, la ureasa microbiana, Proteus mirabilis, es la más común en los cálculos urinarios inducidos por infección.

Ureasa en encefalopatía hepática/coma hepático

Los estudios han demostrado que Helicobacter pylori junto con la cirrosis hepática causan encefalopatía hepática y coma hepático. Helicobacter pylori libera ureasas microbianas en el estómago. La ureasa hidroliza la urea para producir amoníaco y ácido carbónico. A medida que las bacterias se localizan en el estómago, el amoníaco producido es fácilmente absorbido por el sistema circulatorio desde la luz gástrica. Esto da como resultado niveles elevados de amoníaco en la sangre, una condición conocida como hiperamonemia; erradicación de Helicobacter pylori muestran marcadas disminuciones en los niveles de amoníaco.

Ureasa en úlceras pépticas

Helicobacter pylori es también la causa de las úlceras pépticas con su manifestación en el 55-68% de los casos reportados. Esto se confirmó por la disminución del sangrado de la úlcera y la recurrencia de la úlcera después de la erradicación del patógeno. En el estómago hay un aumento en el pH del revestimiento de la mucosa como resultado de la hidrólisis de la urea, lo que impide el movimiento de iones de hidrógeno entre las glándulas gástricas y la luz gástrica. Además, las altas concentraciones de amoníaco tienen un efecto sobre las uniones estrechas intercelulares que aumentan la permeabilidad y también alteran la membrana mucosa gástrica del estómago.

Ocurrencia y aplicaciones en la agricultura

La urea se encuentra de forma natural en el medio ambiente y también se introduce artificialmente, lo que representa más de la mitad de todos los fertilizantes nitrogenados sintéticos que se utilizan en todo el mundo. Se cree que el uso intensivo de urea promueve la eutrofización, a pesar de la observación de que la urea se transforma rápidamente en ureasas microbianas y, por lo tanto, generalmente no persiste. La actividad de la ureasa ambiental a menudo se mide como un indicador de la salud de las comunidades microbianas. En ausencia de plantas, la actividad de la ureasa en el suelo generalmente se atribuye a los microorganismos heterótrofos, aunque se ha demostrado que algunas bacterias oxidantes de amonio quimioautótrofas son capaces de crecer en la urea como única fuente de carbono, nitrógeno y energía.

Inhibición en fertilizantes

La inhibición de la ureasa es un objetivo importante en la agricultura porque la rápida descomposición de los fertilizantes a base de urea es un desperdicio y perjudicial para el medio ambiente. El fosforodiamidato de fenilo y la triamida N-(n-butil)tiofosfórica son dos de estos inhibidores.

Biomineralización

Al promover la formación de carbonato de calcio, las ureas son potencialmente útiles para los procesos inspirados en la biomineralización. En particular, la formación de carbonato de calcio inducida microbiológicamente se puede utilizar para fabricar bioconcreto.

Acción no enzimática

Además de actuar como una enzima, algunas ureas (especialmente las vegetales) tienen efectos adicionales que persisten incluso cuando la función catalítica está desactivada. Estos incluyen entomotoxicidad, inhibición de hongos, neurotoxicidad en mamíferos, promoción de endocitosis y producción de eicosanoides inflamatorios en mamíferos e inducción de quimiotaxis en bacterias. Estas actividades pueden ser parte de un mecanismo de defensa.

La toxicidad por insectos de la ureasa se observó originalmente en la canatoxina, una isoforma ortóloga de la ureasa del frijol jack. La digestión del péptido identificó una porción de 10 kDa que es la más responsable de este efecto, denominada jaburetox. Una porción análoga de la ureasa de soja se denomina soyuretox. Sin embargo, los estudios en insectos muestran que toda la proteína es tóxica sin necesidad de digestión. Sin embargo, el "uretox" los péptidos, al estar más concentrados en toxicidad, se muestran prometedores como bioplaguicidas.

Como prueba diagnóstica

Muchos patógenos gastrointestinales o del tracto urinario producen ureasa, lo que permite que la detección de ureasa se utilice como diagnóstico para detectar la presencia de patógenos.

Los patógenos con ureasa positiva incluyen:

• Proteus mirabilis y Proteus vulgaris
• Ureaplasma urealyticum, un pariente de Micoplasma Spp.
• Nocardia
• Corynebacterium urealyticum
• Cryptococcus spp., un hongo oportunista
• Helicobacter pylori
• Ciertas bacterias Enteric incluyendo Proteus Spp., Klebsiella Spp., Morganella, Providencia, y posiblemente Serratia Spp.
• Brucella
• Staphylococcus saprophyticus
• Staphylococcus aureus

Ligandos

Inhibidores

Se conoce una amplia gama de inhibidores de la ureasa de diferentes familias estructurales. La inhibición de la ureasa no solo es de interés para la agricultura, sino también para la medicina como patógenos como H. pylori producen ureasa como mecanismo de supervivencia. Las clases estructurales conocidas de inhibidores incluyen:

• Analogues of urea, the strongest being thioureas like 1-(4-chlorophenyl)-3-palmitoylthiourea.
• Phosphoramidates, el más comúnmente utilizado en la agricultura (ver arriba).
• Hidroquinona y quinones. En la medicina, lo más interesante son los quinolones, ya una clase de antibióticos ampliamente utilizados.
• Algunos metabolitos de plantas también son inhibidores de la uuresa, un ejemplo de alicina. Estos tienen potencial tanto como aditivos de fertilizantes ecológicos como medicamentos naturales.

Extracción

Aislado por primera vez como un cristal en 1926 por Sumner, usando solvatación con acetona y centrifugación. La bioquímica moderna ha aumentado su demanda de ureasa. La harina de frijol Jack, las semillas de sandía y las semillas de guisantes han demostrado ser fuentes útiles de ureasa.