Transformación (genética)

En biología molecular y genética, la transformación es la alteración genética de una célula que resulta de la captación e incorporación directa de material genético exógeno de su entorno a través de la(s) membrana(s) celular(es). Para que tenga lugar la transformación, la bacteria receptora debe estar en un estado de competencia, que podría ocurrir en la naturaleza como una respuesta limitada en el tiempo a condiciones ambientales como la inanición y la densidad celular, y también puede inducirse en un laboratorio.

La transformación es uno de los tres procesos que conducen a la transferencia horizontal de genes, en la que el material genético exógeno pasa de una bacteria a otra, siendo los otros dos la conjugación (transferencia de material genético entre dos células bacterianas en contacto directo) y la transducción (inyección de ADN extraño). por un virus bacteriófago en la bacteria huésped). En la transformación, el material genético pasa a través del medio intermedio y la absorción depende completamente de la bacteria receptora.

A partir de 2014, se sabía que alrededor de 80 especies de bacterias eran capaces de transformarse, divididas aproximadamente por igual entre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas; el número podría ser una sobreestimación, ya que varios de los informes están respaldados por documentos individuales.

"Transformación" también puede usarse para describir la inserción de nuevo material genético en células no bacterianas, incluidas las células animales y vegetales; sin embargo, debido a que "transformación" tiene un significado especial en relación con las células animales, lo que indica la progresión a un estado canceroso, el proceso suele denominarse "transfección".

Historia

La transformación en bacterias fue demostrada por primera vez en 1928 por el bacteriólogo británico Frederick Griffith. Griffith estaba interesado en determinar si las inyecciones de bacterias muertas por calor podrían usarse para vacunar ratones contra la neumonía. Sin embargo, descubrió que una cepa no virulenta de Streptococcus pneumoniae podía volverse virulenta después de ser expuesta a cepas virulentas muertas por calor. Griffith planteó la hipótesis de que algún "principio transformador" de la cepa muerta por calor era responsable de hacer que la cepa inofensiva se volviera virulenta. En 1944, este "principio transformador" fue identificado como genético por Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty. Aislaron ADN de una cepa virulenta de S. pneumoniaey usando solo este ADN pudieron convertir una cepa inofensiva en virulenta. Llamaron a esta absorción e incorporación de ADN por parte de las bacterias "transformación" (Véase el experimento de Avery-MacLeod-McCarty). marcadores y el descubrimiento de otros métodos de transferencia genética (conjugación en 1947 y transducción en 1953) por Joshua Lederberg que los experimentos de Avery fueron aceptados.

Originalmente se pensó que Escherichia coli, un organismo de laboratorio de uso común, era refractario a la transformación. Sin embargo, en 1970, Morton Mandel y Akiko Higa demostraron que se puede inducir a E. coli a tomar ADN del bacteriófago λ sin el uso de fagos auxiliares después del tratamiento con una solución de cloruro de calcio. Dos años después, en 1972, Stanley Norman Cohen, Annie Chang y Leslie Hsu demostraron que CaCl
₂el tratamiento también es eficaz para la transformación del ADN plasmídico. El método de transformación de Mandel e Higa fue mejorado posteriormente por Douglas Hanahan. El descubrimiento de la competencia inducida artificialmente en E. coli creó un procedimiento eficiente y conveniente para transformar bacterias que permite métodos de clonación molecular más simples en biotecnología e investigación, y ahora es un procedimiento de laboratorio de uso rutinario.

La transformación mediante electroporación se desarrolló a fines de la década de 1980, aumentando la eficiencia de la transformación in vitro y aumentando la cantidad de cepas bacterianas que se podían transformar. La transformación de células animales y vegetales también se investigó con el primer ratón transgénico que se creó mediante la inyección de un gen para una hormona de crecimiento de rata en un embrión de ratón en 1982. En 1897 se descubrió una bacteria que causaba tumores en las plantas, Agrobacterium tumefaciens, y a principios de 1970 se descubrió que el agente inductor de tumores era un plásmido de ADN llamado plásmido Ti. Al eliminar los genes en el plásmido que causó el tumor y agregar genes nuevos, los investigadores pudieron infectar plantas con A. tumefaciensy dejar que las bacterias inserten su ADN elegido en los genomas de las plantas. No todas las células vegetales son susceptibles a la infección por A. tumefaciens, por lo que se desarrollaron otros métodos, como la electroporación y la microinyección. El bombardeo de partículas fue posible gracias a la invención del sistema de suministro de partículas biolísticas (pistola de genes) por John Sanford en la década de 1980.

Definiciones

La transformación es una de las tres formas de transferencia horizontal de genes que ocurren en la naturaleza entre las bacterias, en las que el ADN que codifica un rasgo pasa de una bacteria a otra y se integra en el genoma receptor mediante recombinación homóloga; los otros dos son la transducción, realizada por medio de un bacteriófago, y la conjugación, en la que se transmite un gen por contacto directo entre bacterias. En la transformación, el material genético pasa a través del medio intermedio y la absorción depende completamente de la bacteria receptora.

La competencia se refiere a un estado temporal de poder tomar ADN exógeno del medio ambiente; se puede inducir en un laboratorio.

Parece ser un proceso antiguo heredado de un ancestro procariótico común que es una adaptación beneficiosa para promover la reparación recombinacional del daño en el ADN, especialmente el daño adquirido en condiciones de estrés. La transformación genética natural parece ser una adaptación para reparar el daño del ADN que también genera diversidad genética.

La transformación se ha estudiado en especies de bacterias Gram-negativas importantes desde el punto de vista médico, como Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae y Vibrio cholerae. También se ha estudiado en especies gramnegativas que se encuentran en el suelo, como Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter baylyi, y patógenos vegetales gramnegativos, como Ralstonia solanacearum y Xylella fastidiosa. Se ha estudiado la transformación entre bacterias Gram-positivas en especies médicamente importantes comoStreptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus y Streptococcus sanguinis y en la bacteria Gram-positiva del suelo Bacillus subtilis. También se ha informado en al menos 30 especies de Proteobacteria distribuidas en las clases alfa, beta, gamma y épsilon. Las proteobacterias mejor estudiadas con respecto a la transformación son los patógenos humanos médicamente importantes Neisseria gonorrhoeae (clase beta), Haemophilus influenzae (clase gamma) y Helicobacter pylori (clase épsilon)

"Transformación" también puede usarse para describir la inserción de nuevo material genético en células no bacterianas, incluidas las células animales y vegetales; sin embargo, debido a que "transformación" tiene un significado especial en relación con las células animales, lo que indica la progresión a un estado canceroso, el proceso suele denominarse "transfección".

Competencia natural y transformación

A partir de 2014, se sabía que alrededor de 80 especies de bacterias eran capaces de transformarse, divididas aproximadamente por igual entre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas; el número podría ser una sobreestimación, ya que varios de los informes están respaldados por documentos individuales.

Las bacterias naturalmente competentes portan conjuntos de genes que proporcionan la maquinaria proteica para llevar el ADN a través de la(s) membrana(s) celular(es). El transporte del ADN exógeno al interior de las células puede requerir proteínas que estén implicadas en el ensamblaje de los pili de tipo IV y el sistema de secreción de tipo II, así como el complejo translocasa de ADN en la membrana citoplasmática.

Debido a las diferencias en la estructura de la envoltura celular entre las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, existen algunas diferencias en los mecanismos de captación de ADN en estas células, sin embargo, la mayoría de ellas comparten características comunes que involucran proteínas relacionadas. El ADN primero se une a la superficie de las células competentes en un receptor de ADN y pasa a través de la membrana citoplasmática a través de la translocasa de ADN.Solo el ADN monocatenario puede pasar, y la otra cadena es degradada por las nucleasas en el proceso. El ADN monocatenario translocado puede luego integrarse en los cromosomas bacterianos mediante un proceso dependiente de RecA. En las células Gram negativas, debido a la presencia de una membrana extra, el ADN requiere la presencia de un canal formado por secretinas en la membrana externa. Pilin puede ser necesario para la competencia, pero su función es incierta. La captación de ADN generalmente no es específica de secuencia, aunque en algunas especies la presencia de secuencias de captación de ADN específicas puede facilitar la captación eficaz de ADN.

Transformación natural

La transformación natural es una adaptación bacteriana para la transferencia de ADN que depende de la expresión de numerosos genes bacterianos cuyos productos parecen ser los responsables de este proceso. En general, la transformación es un proceso de desarrollo complejo que requiere energía. Para que una bacteria se una, tome y recombine el ADN exógeno en su cromosoma, debe volverse competente, es decir, entrar en un estado fisiológico especial. El desarrollo de competencias en Bacillus subtilis requiere la expresión de unos 40 genes. El ADN integrado en el cromosoma huésped normalmente (pero con raras excepciones) se deriva de otra bacteria de la misma especie y, por lo tanto, es homólogo al cromosoma residente.

En B. subtilis la longitud del ADN transferido es superior a 1271 kb (más de 1 millón de bases). La longitud transferida es probablemente ADN de doble cadena y, a menudo, es más de un tercio de la longitud total del cromosoma de 4215 kb. Parece que alrededor del 7-9% de las células receptoras ocupan un cromosoma completo.

La capacidad de transformación natural parece ocurrir en una serie de procariotas y, hasta el momento, se sabe que 67 especies procariotas (en siete filos diferentes) experimentan este proceso.

La competencia para la transformación es típicamente inducida por una alta densidad celular y/o una limitación nutricional, condiciones asociadas con la fase estacionaria del crecimiento bacteriano. La transformación en Haemophilus influenzae ocurre de manera más eficiente al final del crecimiento exponencial cuando el crecimiento bacteriano se acerca a la fase estacionaria. La transformación en Streptococcus mutans, así como en muchos otros estreptococos, ocurre a una alta densidad celular y está asociada con la formación de biopelículas. La competencia en B. subtilis se induce hacia el final del crecimiento logarítmico, especialmente en condiciones de limitación de aminoácidos. De manera similar, en Micrococcus luteus (un representante de Actinomycetota menos estudiadophylum), la competencia se desarrolla durante la fase de crecimiento exponencial medio-tardío y también se desencadena por la inanición de aminoácidos.

Al liberar ADN intacto del huésped y del plásmido, se cree que ciertos bacteriófagos contribuyen a la transformación.

Transformación, como adaptación para la reparación del ADN

La competencia es inducida específicamente por condiciones que dañan el ADN. Por ejemplo, la transformación es inducida en Streptococcus pneumoniae por los agentes que dañan el ADN mitomicina C (un agente de entrecruzamiento del ADN) y la fluoroquinolona (un inhibidor de la topoisomerasa que provoca roturas de doble cadena). En B. subtilis, la transformación aumenta con la luz ultravioleta, un agente que daña el ADN. En Helicobacter pylori, la ciprofloxacina, que interactúa con la ADN girasa e introduce roturas de doble cadena, induce la expresión de genes competentes, aumentando así la frecuencia de transformación Utilizando Legionella pneumophila, Charpentier et al.probó 64 moléculas tóxicas para determinar cuáles de ellas inducen la competencia. De estos, solo seis, todos agentes que dañan el ADN, causaron una fuerte inducción. Estos agentes que dañan el ADN fueron mitomicina C (que causa enlaces cruzados entre cadenas de ADN), norfloxacina, ofloxacina y ácido nalidíxico (inhibidores de la girasa de ADN que causan roturas de doble cadena ), biciclomicina (causa roturas de cadena simple y doble ) e hidroxiurea. (induce la oxidación de la base del ADN ). La luz ultravioleta también indujo competencia en L. pneumophila. Charpentier et al. sugirió que la competencia para la transformación probablemente evolucionó como una respuesta al daño del ADN.

Las bacterias que crecen logarítmicamente difieren de las bacterias en fase estacionaria con respecto al número de copias del genoma presentes en la célula, y esto tiene implicaciones en la capacidad de llevar a cabo un importante proceso de reparación del ADN. Durante el crecimiento logarítmico, dos o más copias de cualquier región particular del cromosoma pueden estar presentes en una célula bacteriana, ya que la división celular no coincide con precisión con la replicación cromosómica. El proceso de reparación recombinante homóloga (HRR) es un proceso clave de reparación del ADN que es especialmente efectivo para reparar daños de doble cadena, como roturas de doble cadena. Este proceso depende de un segundo cromosoma homólogo además del cromosoma dañado. Durante el crecimiento logarítmico, la HRR puede reparar un daño en el ADN de un cromosoma utilizando la información de la secuencia del otro cromosoma homólogo.

Para probar si la función adaptativa de la transformación es la reparación de daños en el ADN, se llevaron a cabo una serie de experimentos usando B. subtilis irradiada con luz ultravioleta como agente dañino (revisado por Michod et al. y Bernstein et al.) Los resultados de estos experimentos indicaron que la transformación del ADN actúa para reparar daños en el ADN potencialmente letales introducidos por la luz ultravioleta en el ADN receptor. El proceso particular responsable de la reparación probablemente fue HRR. La transformación en bacterias puede verse como un proceso sexual primitivo, ya que implica la interacción de ADN homólogo de dos individuos para formar ADN recombinante que se transmite a las generaciones sucesivas. La transformación bacteriana en procariotas puede haber sido el proceso ancestral que dio lugar a la reproducción sexual meiótica en eucariotas (ver Evolución de la reproducción sexual; Meiosis).

Métodos y mecanismos de transformación en laboratorio

Bacteriano

La competencia artificial se puede inducir en procedimientos de laboratorio que implican hacer que la célula sea pasivamente permeable al ADN al exponerla a condiciones que normalmente no ocurren en la naturaleza. Normalmente, las células se incuban en una solución que contiene cationes divalentes (a menudo, cloruro de calcio) en condiciones de frío, antes de exponerlas a un pulso de calor (choque térmico). El cloruro de calcio interrumpe parcialmente la membrana celular, lo que permite que el ADN recombinante ingrese a la célula huésped. Las células que son capaces de captar el ADN se denominan células competentes.

Se ha encontrado que el crecimiento de bacterias Gram-negativas en Mg 20 mM reduce el número de enlaces proteína-lipopolisacárido aumentando la proporción de enlaces iónicos a covalentes, lo que aumenta la fluidez de la membrana, facilitando la transformación. El papel de los lipopolisacáridos aquí se verifica a partir de la observación de que las cadenas del lado O más cortas se transforman de manera más efectiva, tal vez debido a una mejor accesibilidad al ADN.

La superficie de bacterias como E. coli está cargada negativamente debido a los fosfolípidos y lipopolisacáridos en su superficie celular, y el ADN también está cargado negativamente. Por lo tanto, una función del catión divalente sería proteger las cargas coordinando los grupos fosfato y otras cargas negativas, permitiendo así que una molécula de ADN se adhiera a la superficie celular.

La entrada del ADN en las células de E. coli se realiza a través de canales conocidos como zonas de adhesión o unión de Bayer, y una célula típica lleva hasta 400 de estas zonas. Su papel se estableció cuando se descubrió que la cobalamina (que también utiliza estos canales) inhibía de manera competitiva la captación de ADN. Otro tipo de canal implicado en la captación de ADN consiste en poli (HB):poli P:Ca. En este poli (HB) se prevé que envuelva el ADN (en sí mismo un polifosfato), y se transporta en un escudo formado por iones de Ca.

Se sugiere que exponer las células a cationes divalentes en frío también puede cambiar o debilitar la estructura de la superficie celular, haciéndola más permeable al ADN. Se cree que el pulso de calor crea un desequilibrio térmico a través de la membrana celular, lo que obliga al ADN a entrar en las células a través de los poros celulares o de la pared celular dañada.

La electroporación es otro método para promover la competencia. En este método, las células reciben un breve choque con un campo eléctrico de 10-20 kV/cm, que se cree que crea agujeros en la membrana celular a través de los cuales puede entrar el ADN del plásmido. Después de la descarga eléctrica, los mecanismos de reparación de la membrana de la célula cierran rápidamente los orificios.

Levadura

La mayoría de las especies de levadura, incluida Saccharomyces cerevisiae, pueden transformarse mediante ADN exógeno en el medio ambiente. Se han desarrollado varios métodos para facilitar esta transformación a alta frecuencia en el laboratorio.

• Las células de levadura pueden tratarse con enzimas para degradar sus paredes celulares y producir esferoplastos. Estas células son muy frágiles pero absorben ADN extraño a un ritmo elevado.
• La exposición de células de levadura intactas a cationes alcalinos como los de cesio o litio permite que las células absorban ADN plasmídico. Protocolos posteriores adaptaron este método de transformación utilizando acetato de litio, polietilenglicol y ADN monocatenario. En estos protocolos, el ADN monocatenario se une preferentemente a la pared celular de la levadura, evitando que el ADN plasmídico lo haga y dejándolo disponible para la transformación.
• Electroporación: Formación de agujeros transitorios en las membranas celulares mediante descargas eléctricas; esto permite que el ADN ingrese como se describió anteriormente para las bacterias.
• La digestión enzimática o la agitación con perlas de vidrio también se pueden utilizar para transformar las células de levadura.

Eficiencia : diferentes géneros y especies de levaduras absorben ADN extraño con diferentes eficiencias. Además, la mayoría de los protocolos de transformación se han desarrollado para la levadura de panadería, S. cerevisiae y, por lo tanto, pueden no ser óptimos para otras especies. Incluso dentro de una especie, diferentes cepas tienen diferentes eficiencias de transformación, a veces diferentes en tres órdenes de magnitud. Por ejemplo, cuando las cepas de S. cerevisiae se transformaron con 10 ug del plásmido YEp13, la cepa DKD-5D-H produjo entre 550 y 3115 colonias, mientras que la cepa OS1 produjo menos de cinco colonias.

Plantas

Hay varios métodos disponibles para transferir ADN a células vegetales. Algunos métodos mediados por vectores son:

• La transformación mediada por Agrobacterium es la transformación de plantas más fácil y sencilla. El tejido vegetal (a menudo hojas) se corta en trozos pequeños, por ejemplo, 10x10 mm, y se sumerge durante diez minutos en un líquido que contiene Agrobacterium en suspensión.. La bacteria se adherirá a muchas de las células vegetales expuestas por el corte. Las células vegetales secretan compuestos fenólicos relacionados con las heridas que, a su vez, actúan para regular al alza el operón de virulencia de Agrobacterium. El operón de virulencia incluye muchos genes que codifican proteínas que forman parte de un sistema de secreción de tipo IV que exporta proteínas y ADN de la bacteria (delineados por motivos de reconocimiento específicos llamados secuencias de borde y escindidos como una sola hebra del plásmido de virulencia) a la planta. célula a través de una estructura llamada pilus. El ADN transferido (llamado T-DNA) se envía al núcleo de la célula vegetal mediante señales de localización nuclear presentes en la proteína VirD2 de Agrobacterium, que se une covalentemente al extremo del T-DNA en el borde derecho (RB). Exactamente cómo se integra el ADN-T en el ADN genómico de la planta huésped es un área activa de investigación en biología vegetal. Suponiendo que se incluyera un marcador de selección (como un gen de resistencia a antibióticos) en el T-DNA, el tejido vegetal transformado se puede cultivar en medios selectivos para producir brotes. Luego, los brotes se transfieren a un medio diferente para promover la formación de raíces. Una vez que las raíces comienzan a crecer a partir del brote transgénico, las plantas se pueden transferir al suelo para completar un ciclo de vida normal (hacer semillas). Las semillas de esta primera planta (llamada T1, para la primera generación transgénica) se pueden plantar en un selectivo (que contiene un antibiótico), o si se usó un gen de resistencia a herbicida, alternativamente se podrían plantar en el suelo y luego tratarse con herbicida para matar a los segregantes de tipo salvaje. Algunas especies de plantas, como Suponiendo que se incluyera un marcador de selección (como un gen de resistencia a antibióticos) en el T-DNA, el tejido vegetal transformado se puede cultivar en medios selectivos para producir brotes. Luego, los brotes se transfieren a un medio diferente para promover la formación de raíces. Una vez que las raíces comienzan a crecer a partir del brote transgénico, las plantas se pueden transferir al suelo para completar un ciclo de vida normal (hacer semillas). Las semillas de esta primera planta (llamada T1, para la primera generación transgénica) se pueden plantar en un selectivo (que contiene un antibiótico), o si se usó un gen de resistencia a herbicida, alternativamente se podrían plantar en el suelo y luego tratarse con herbicida para matar a los segregantes de tipo salvaje. Algunas especies de plantas, como Suponiendo que se incluyera un marcador de selección (como un gen de resistencia a antibióticos) en el T-DNA, el tejido vegetal transformado se puede cultivar en medios selectivos para producir brotes. Luego, los brotes se transfieren a un medio diferente para promover la formación de raíces. Una vez que las raíces comienzan a crecer a partir del brote transgénico, las plantas se pueden transferir al suelo para completar un ciclo de vida normal (hacer semillas). Las semillas de esta primera planta (llamada T1, para la primera generación transgénica) se pueden plantar en un selectivo (que contiene un antibiótico), o si se usó un gen de resistencia a herbicida, alternativamente se podrían plantar en el suelo y luego tratarse con herbicida para matar a los segregantes de tipo salvaje. Algunas especies de plantas, como el tejido vegetal transformado se puede cultivar en medios selectivos para producir brotes. Luego, los brotes se transfieren a un medio diferente para promover la formación de raíces. Una vez que las raíces comienzan a crecer a partir del brote transgénico, las plantas se pueden transferir al suelo para completar un ciclo de vida normal (hacer semillas). Las semillas de esta primera planta (llamada T1, para la primera generación transgénica) se pueden plantar en un selectivo (que contiene un antibiótico), o si se usó un gen de resistencia a herbicida, alternativamente se podrían plantar en el suelo y luego tratarse con herbicida para matar a los segregantes de tipo salvaje. Algunas especies de plantas, como el tejido vegetal transformado se puede cultivar en medios selectivos para producir brotes. Luego, los brotes se transfieren a un medio diferente para promover la formación de raíces. Una vez que las raíces comienzan a crecer a partir del brote transgénico, las plantas se pueden transferir al suelo para completar un ciclo de vida normal (hacer semillas). Las semillas de esta primera planta (llamada T1, para la primera generación transgénica) se pueden plantar en un selectivo (que contiene un antibiótico), o si se usó un gen de resistencia a herbicida, alternativamente se podrían plantar en el suelo y luego tratarse con herbicida para matar a los segregantes de tipo salvaje. Algunas especies de plantas, como las plantas se pueden transferir al suelo para completar un ciclo de vida normal (hacer semillas). Las semillas de esta primera planta (llamada T1, para la primera generación transgénica) se pueden plantar en un selectivo (que contiene un antibiótico), o si se usó un gen de resistencia a herbicida, alternativamente se podrían plantar en el suelo y luego tratarse con herbicida para matar a los segregantes de tipo salvaje. Algunas especies de plantas, como las plantas se pueden transferir al suelo para completar un ciclo de vida normal (hacer semillas). Las semillas de esta primera planta (llamada T1, para la primera generación transgénica) se pueden plantar en un selectivo (que contiene un antibiótico), o si se usó un gen de resistencia a herbicida, alternativamente se podrían plantar en el suelo y luego tratarse con herbicida para matar a los segregantes de tipo salvaje. Algunas especies de plantas, comoArabidopsis thaliana puede transformarse sumergiendo las flores o la planta entera en una suspensión de Agrobacterium tumefaciens, típicamente la cepa C58 (C=Cherry, 58=1958, año en que esta cepa particular de A. tumefaciens fue aislada de un cerezo en un huerto en la Universidad de Cornell en Ithaca, Nueva York). Aunque muchas plantas siguen siendo recalcitrantes a la transformación mediante este método, se están realizando investigaciones que continúan agregando a la lista las especies que se han modificado con éxito de esta manera.
• Transformación viral (transducción): empaquetar el material genético deseado en un virus vegetal adecuado y permitir que este virus modificado infecte la planta. Si el material genético es ADN, puede recombinarse con los cromosomas para producir células transformantes. Sin embargo, los genomas de la mayoría de los virus de plantas consisten en ARN monocatenario que se replica en el citoplasma de la célula infectada. Para tales genomas, este método es una forma de transfección y no una transformación real, ya que los genes insertados nunca llegan al núcleo de la célula y no se integran en el genoma huésped. La progenie de las plantas infectadas está libre de virus y también libre del gen insertado.

Algunos métodos sin vectores incluyen:

• Pistola de genes: también conocida como bombardeo de partículas, bombardeo de microproyectiles o biolística. Las partículas de oro o tungsteno se recubren con ADN y luego se inyectan en células de plantas jóvenes o embriones de plantas. Parte del material genético permanecerá en las células y las transformará. Este método también permite la transformación de plástidos vegetales. La eficiencia de transformación es menor que en la transformación mediada por Agrobacterium, pero la mayoría de las plantas se pueden transformar con este método.
• Electroporación: Formación de agujeros transitorios en las membranas celulares utilizando pulsos eléctricos de alta intensidad de campo; esto permite que el ADN ingrese como se describió anteriormente para las bacterias.

Hongos

Existen algunos métodos para producir hongos transgénicos, la mayoría de ellos análogos a los que se utilizan para las plantas. Sin embargo, los hongos deben tratarse de manera diferente debido a algunas de sus características microscópicas y bioquímicas:

• Un problema importante es el estado dicariótico en el que se encuentran partes de algunos hongos; las células dicarióticas contienen dos núcleos haploides, uno de cada hongo progenitor. Si solo uno de estos se transforma, que es la regla, el porcentaje de núcleos transformados disminuye después de cada esporulación.
• Las paredes de las células fúngicas son bastante gruesas, lo que dificulta la absorción de ADN, por lo que a menudo se requiere una eliminación (parcial); la degradación completa, que a veces es necesaria, produce protoplastos.
• Los hongos miceliares consisten en hifas filamentosas, que están, si acaso, separadas por paredes celulares internas interrumpidas por poros lo suficientemente grandes como para permitir que los nutrientes y los orgánulos, a veces incluso los núcleos, viajen a través de cada hifa. Como resultado, las células individuales por lo general no se pueden separar. Esto es problemático ya que las células transformadas vecinas pueden hacer que las no transformadas sean inmunes a los tratamientos de selección, por ejemplo, mediante el suministro de nutrientes o proteínas para la resistencia a los antibióticos.
• Además, el crecimiento (y, por lo tanto, la mitosis) de estos hongos ocurre exclusivamente en la punta de sus hifas, lo que también puede generar problemas.

Como se indicó anteriormente, una variedad de métodos utilizados para la transformación de plantas también funcionan en hongos:

• Agrobacterium no solo es capaz de infectar plantas sino también hongos, sin embargo, a diferencia de las plantas, los hongos no secretan los compuestos fenólicos necesarios para desencadenar Agrobacterium, por lo que deben agregarse, por ejemplo, en forma de acetosiringona.
• Gracias al desarrollo de un sistema de expresión para ARN pequeños en hongos, fue posible la introducción de un sistema CRISPR/CAS9 en células fúngicas. En 2016, el USDA declaró que no regulará una cepa de champiñón blanco editada con CRISPR/CAS9 para evitar que el cuerpo de la fruta se oscurezca, lo que provocó una amplia discusión sobre la comercialización de cultivos editados con CRISPR/CAS9.
• Los métodos físicos como la electroporación, la biolística ("pistola de genes"), la sonoporación que utiliza la cavitación de burbujas de gas producidas por ultrasonido para penetrar la membrana celular, etc. también son aplicables a los hongos.

Animales

La introducción de ADN en células animales suele denominarse transfección y se analiza en el artículo correspondiente.

Aspectos prácticos de la transformación en biología molecular

El descubrimiento de la competencia inducida artificialmente en bacterias permite que bacterias como Escherichia coli se utilicen como un huésped conveniente para la manipulación de ADN, así como para la expresión de proteínas. Normalmente, los plásmidos se utilizan para la transformación en E. coli. Para mantenerse estable en la célula, una molécula de ADN plasmídico debe contener un origen de replicación, que le permita replicarse en la célula independientemente de la replicación del propio cromosoma de la célula.

La eficiencia con la que un cultivo competente puede tomar ADN exógeno y expresar sus genes se conoce como eficiencia de transformación y se mide en unidades formadoras de colonias (ufc) por μg de ADN utilizado. Una eficiencia de transformación de 1 × 10 ufc/μg para un plásmido pequeño como pUC19 equivale aproximadamente a 1 en 2000 moléculas del plásmido utilizado que se está transformando.

En la transformación con cloruro de calcio, las células se preparan enfriándolas en presencia de Ca
(en CaCl
₂solución), haciendo que la célula se vuelva permeable al ADN plasmídico. Las células se incuban en hielo con el ADN y luego se someten a un choque térmico breve (p. ej., a 42 °C durante 30 a 120 segundos). Este método funciona muy bien para el ADN plásmido circular. Las preparaciones no comerciales normalmente deberían dar de 10 a 10 transformantes por microgramo de plásmido; una mala preparación será de alrededor de 10 /μg o menos, pero una buena preparación de células competentes puede dar hasta ~10 colonias por microgramo de plásmido. Sin embargo, existen protocolos para fabricar células supercompetentes que pueden producir una eficiencia de transformación de más de 10.El método químico, sin embargo, por lo general no funciona bien para el ADN lineal, como los fragmentos de ADN cromosómico, probablemente porque las enzimas exonucleasas nativas de la célula degradan rápidamente el ADN lineal. Por el contrario, las células que son naturalmente competentes suelen transformarse de forma más eficaz con ADN lineal que con ADN plasmídico.

La eficiencia de transformación usando el CaCl
₂El método disminuye con el tamaño del plásmido y, por lo tanto, la electroporación puede ser un método más eficaz para la captación de ADN plasmídico grande. Las celdas utilizadas en la electroporación deben prepararse primero lavándolas con agua bidestilada fría para eliminar las partículas cargadas que pueden generar chispas durante el proceso de electroporación.

Selección y cribado en transformación de plásmidos

Debido a que la transformación normalmente produce una mezcla de relativamente pocas células transformadas y una gran cantidad de células no transformadas, es necesario un método para seleccionar las células que han adquirido el plásmido.Por lo tanto, el plásmido requiere un marcador seleccionable de modo que aquellas células sin el plásmido puedan morir o detener su crecimiento. La resistencia a los antibióticos es el marcador más utilizado para los procariotas. El plásmido transformante contiene un gen que confiere resistencia a un antibiótico al que las bacterias son sensibles. La mezcla de células tratadas se cultiva en medios que contienen el antibiótico para que solo las células transformadas puedan crecer. Otro método de selección es el uso de ciertos marcadores auxotróficos que pueden compensar la incapacidad para metabolizar ciertos aminoácidos, nucleótidos o azúcares. Este método requiere el uso de cepas adecuadamente mutadas que son deficientes en la síntesis o utilidad de una biomolécula en particular,

En un experimento de clonación, se puede insertar un gen en un plásmido utilizado para la transformación. Sin embargo, en dicho experimento, no todos los plásmidos pueden contener un gen insertado con éxito. Por lo tanto, se pueden emplear técnicas adicionales para detectar células transformadas que contienen plásmido con el inserto. Los genes informadores se pueden usar como marcadores, como el gen lacZ que codifica la β-galactosidasa utilizada en la detección azul-blanca. Este método de detección se basa en el principio de la complementación α, donde un fragmento del gen lacZ ( lacZα ) en el plásmido puede complementar otro gen lacZ mutante ( lacZΔM15) en la celda. Ambos genes por sí mismos producen péptidos no funcionales, sin embargo, cuando se expresan juntos, como cuando un plásmido que contiene lacZ-α se transforma en células lacZΔM15, forman una β-galactosidasa funcional. La presencia de una β-galactosidasa activa puede detectarse cuando las células se cultivan en placas que contienen X-gal, formando colonias azules características. Sin embargo, el sitio de clonación múltiple, donde un gen de interés puede ligarse al vector plasmídico, está ubicado dentro del gen lacZα. Por lo tanto, la ligadura exitosa interrumpe la lacZαy no se puede formar β-galactosidasa funcional, lo que da como resultado colonias blancas. Las células que contienen un inserto ligado con éxito pueden identificarse fácilmente por su coloración blanca de las azules que no lo han sido.

Otros genes indicadores comúnmente utilizados son la proteína verde fluorescente (GFP), que produce células que brillan de color verde bajo la luz azul, y la enzima luciferasa, que cataliza una reacción con la luciferina para emitir luz. El ADN recombinante también puede detectarse utilizando otros métodos, como la hibridación de ácidos nucleicos con una sonda de ARN radiactivo, mientras que las células que expresaron la proteína deseada del plásmido también pueden detectarse utilizando métodos inmunológicos.