Tampón de lisis

Un tampón de lisis es una solución tampón que se utiliza con el fin de romper células abiertas para su uso en experimentos de biología molecular que analizan las macromoléculas lábiles de las células (por ejemplo, Western blot para proteínas o para extracción de ADN).). La mayoría de los tampones de lisis contienen sales tampón (p. ej., Tris-HCl) y sales iónicas (p. ej., NaCl) para regular el pH y la osmolaridad del lisado. A veces se añaden detergentes (como Triton X-100 o SDS) para romper las estructuras de las membranas. Para los tampones de lisis destinados a la extracción de proteínas, a menudo se incluyen inhibidores de proteasa y, en casos difíciles, pueden ser casi necesarios. Los tampones de lisis se pueden utilizar en células de tejidos tanto animales como vegetales.

Elegir un búfer

El objetivo principal del tampón de lisis es aislar las moléculas de interés y mantenerlas en un entorno estable. Para las proteínas, en algunos experimentos, las proteínas objetivo deben estar completamente desnaturalizadas, mientras que en otros experimentos la proteína objetivo debe permanecer plegada y funcional. Las diferentes proteínas también tienen diferentes propiedades y se encuentran en diferentes entornos celulares. Por tanto, es fundamental elegir el mejor tampón en función del propósito y diseño de los experimentos. Los factores importantes a considerar son: pH, fuerza iónica, uso de detergente, inhibidores de proteasa para prevenir procesos proteolíticos. Por ejemplo, la adición de detergente es necesaria cuando se lisan bacterias Gram negativas, pero no en el caso de bacterias Gram positivas. Es común que se agregue un inhibidor de proteasa al tampón de lisis, junto con otros inhibidores enzimáticos de elección, como un inhibidor de fosfatasa cuando se estudian proteínas con fosforilación.

Componentes

Búfer

El tampón crea un entorno para proteínas aisladas. Cada elección de tampón tiene un rango de pH específico, por lo que el tampón debe elegirse en función de si la proteína objetivo del experimento es estable bajo un determinado pH. Además, para tampones con rangos de pH similares, es importante considerar si el tampón es compatible con la proteína objetivo del experimento. La siguiente tabla contiene varios de los tampones más utilizados y sus rangos de pH.

Aditivos

Sales

El tampón de lisis suele contener una o más sales. La función de las sales en el tampón de lisis es establecer una fuerza iónica en la solución tampón. Algunas de las sales más utilizadas son NaCl, KCl y (NH₄)₂SO_4. Se suelen utilizar con una concentración entre 50 y 150 mm.

Detergente

Los detergentes son tensioactivos orgánicos anfipáticos (con cola hidrófoba y cabeza hidrófila). Se utilizan para separar las proteínas de las membranas porque la parte hidrófoba del detergente puede rodear las membranas biológicas y así aislar las proteínas de las membranas. Aunque los detergentes se utilizan ampliamente y tienen funciones similares, las propiedades físicas y químicas de los detergentes de interés deben considerarse a la luz de los objetivos de un experimento.

Los detergentes a menudo se clasifican como no iónicos, aniónicos, catiónicos o zwitteriónicos, según la característica de su grupo principal hidrófilo.

Los detergentes no iónicos como Triton X-100 y los detergentes zwitteriónicos como CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato) no son desnaturalizantes (no alteran las funciones de las proteínas). Los detergentes iónicos como el dodecilsulfato de sodio (SDS) y los detergentes catiónicos como el bromuro de etiltrimetilamonio son desnaturalizantes (alteran las funciones de las proteínas). Los detergentes son un ingrediente importante que determina la fuerza de lisis de un tampón de lisis determinado.

Tampones de lisis celular sin detergente

Un problema común al que se enfrentan muchos tampones de lisis celular es la alteración de las estructuras de las proteínas durante el proceso de lisis, causada en parte por el uso de detergentes. Los detergentes a menudo impiden la restauración de las condiciones nativas necesarias para el plegamiento adecuado de las proteínas.

Durante mucho tiempo, después de una lisis celular basada en detergente, se debía realizar un intercambio de tampón y/o diálisis para eliminar el detergente entre otros compuestos que obstaculizaban el proceso y restaurar las condiciones nativas.

Para superar esto, ha surgido una solución en forma de un tampón de lisis celular sin detergente. El tampón GentleLys emplea copolímeros en lugar de detergentes, lo que garantiza una lisis celular eficiente y al mismo tiempo mantiene el entorno nativo crucial para el correcto plegamiento de los componentes celulares, como las proteínas.

Otros

Otros aditivos incluyen iones metálicos, azúcar como la glucosa, glicerol, quelantes de metales (por ejemplo, EDTA) y agentes reductores como el ditiotreitol (DTT).

Búfers de uso común

Tampón de lisis NP-40

Puede que sea el tampón de lisis más utilizado. El agente solubilizante es el NP-40, que puede ser sustituido por otros detergentes en diferentes concentraciones. Dado que NP-40 es un detergente no iónico, este tampón de lisis tiene un efecto más suave que el tampón RIPA. Puede utilizarse cuando se deben conservar las funciones de las proteínas con una alteración mínima.

Receta:

• 150 mM NaCl
• 1.0% Nonidet P-40 o Triton X-100
• 50 mM Tris-Cl
• Ajuste de pH a 7.4

Tampón de lisis RIPA (ensayo de radioinmunoprecipitación)

El tampón RIPA es un tampón de lisis comúnmente utilizado para la inmunoprecipitación y la extracción general de proteínas de células y tejidos. El tampón se puede almacenar sin vanadato a 4 °C durante hasta 1 año. El tampón RIPA libera proteínas de las células y altera la mayoría de las interacciones débiles entre proteínas.

Receta:

• 1% (w/w) Nonidet P-40 (NP-40)
• 1% (w/v) sodium deoxycholate
• 0,1% (w/v) SDS
• 0.15 M NaCl
• 0,01 M fosfato de sodio, pH 7.2
• 2 mM EDTA
• 50 mM de fluoruro de sodio (NaF)
• 0,2 mM de sodio fresco ortovanadate (Na₃VO₄.2H₂O, tiene función de inhibidor de fosfatasa porque imita fosfato)
• 100 Inhibidor de la proteasa U/ml, como la aprotinina

Tampón de lisis SDS (dodecilsulfato de sodio)

SDS es un detergente desnaturalizante iónico. El tampón SDS caliente se utiliza a menudo cuando las proteínas necesitan ser completamente solubilizadas y desnaturalizadas.

Receta:

• 0,5% (w/v) SDS
• 0,05 M Tris⋅Cl
• Ajuste de pH a 8.0
• Añadir 1 mM dithiothreitol fresco (DTT)

Tampón de lisis ACK (Amonio-Cloruro-Potasio)

ACK se utiliza para la lisis de glóbulos rojos en muestras biológicas donde otras células, como los glóbulos blancos, son de mayor interés.

Receta:

• Cloruro de amonio de 150 mM
• Bicarbonato de potasio 10 mM
• 0.1 mM EDTA
• Ajuste del pH a 7.2-7.4

GentleLys (Lisis suave)

El tampón GentleLys emplea copolímeros de nanodiscos sintéticos para alterar suavemente la membrana celular, ofreciendo una alternativa más suave a los tampones de lisis convencionales a base de detergentes. Este enfoque suave elimina la necesidad de utilizar productos químicos agresivos, creando un entorno que preserva el estado nativo de las proteínas celulares. En consecuencia, las proteínas mantienen su integridad estructural y funcionalidad, un marcado alejamiento de los efectos desnaturalizantes de los tampones a base de detergentes.

Detergentes, sales y productos enzimas

La lisis celular es un paso crítico en la purificación de enzimas de células bacterianas; comúnmente se incluyen varios componentes en los tampones de lisis para facilitar la alteración celular efectiva y la liberación de la enzima objetivo. Estos componentes incluyen detergentes, sales y enzimas, cada uno de los cuales desempeña un papel específico en el proceso de lisis. Ejemplos de detergentes utilizados en tampones de lisis incluyen:

Detergentes:

Los detergentes son moléculas anfipáticas que poseen propiedades tanto hidrófilas como hidrófobas. En el contexto de la lisis celular, los detergentes actúan alterando la bicapa lipídica de la membrana celular bacteriana, lo que lleva a la permeabilización de la membrana y la liberación de componentes intracelulares, incluida la enzima objetivo.

Los detergentes utilizados habitualmente en los tampones de lisis incluyen:

a. Triton X-100: un detergente no iónico frecuentemente utilizado debido a sus suaves y efectivas propiedades disruptoras de membrana, solubiliza lípidos y proteínas de membrana, permitiendo la liberación del contenido intracelular.

b. Dodecilsulfato de sodio (SDS): un detergente aniónico que desnaturaliza las proteínas alterando sus estructuras secundarias y terciarias, solubiliza las membranas celulares y ayuda en la extracción de proteínas.

c. Tween-20: un detergente no iónico es más suave en comparación con SDS y Triton X-100. Ayuda a la permeabilización de la membrana y la solubilización de proteínas sin causar una desnaturalización significativa.

Sales:

Las sales son componentes cruciales de los tampones de lisis, ya que ayudan a mantener condiciones celulares óptimas y proporcionan fuerza iónica para facilitar la alteración celular.

Las sales comúnmente utilizadas en los tampones de lisis incluyen:

a. Cloruro de sodio (NaCl): a menudo se incluye NaCl para mantener las condiciones isotónicas, evitando el shock osmótico y la ruptura celular durante el proceso de lisis.

b. Cloruro de potasio (KCl): similar al NaCl, el KCl se puede utilizar para ajustar la fuerza iónica y facilitar la lisis celular.

Enzimas:

Se añaden ciertas enzimas a los tampones de lisis para mejorar la lisis celular mediante la digestión de componentes celulares específicos que pueden interferir con la extracción de la enzima objetivo.

Ejemplos de enzimas utilizadas en tampones de lisis incluyen:

a. Lisozima: La lisozima descompone la capa de peptidoglicano de las paredes celulares bacterianas, debilitando su integridad estructural y facilitando la alteración posterior. Es particularmente eficaz para las bacterias Gram positivas.

b. ADNasa (desoxirribonucleasa): la ADNasa degrada el ADN presente en el lisado, reduciendo su viscosidad y previniendo la interferencia relacionada con el ADN en los pasos de purificación posteriores.

c. ARNasa (ribonucleasa): similar a la ADNasa, la ARNasa degrada el ARN en el lisado, reduciendo su viscosidad y minimizando la interferencia relacionada con el ARN.

La combinación específica y las concentraciones de detergentes, sales y enzimas en los tampones de lisis pueden variar según la enzima objetivo, el tipo de célula y los requisitos experimentales; la optimización de estos componentes es crucial para lograr una lisis celular eficiente y al mismo tiempo preservar la estabilidad y la actividad. de la enzima deseada durante el proceso de purificación.

Tampón de lisis en estudios de ADN y ARN

En estudios como las huellas dactilares de ADN, el tampón de lisis se utiliza para el aislamiento del ADN. El jabón para platos se puede utilizar en caso de necesidad para descomponer las membranas celulares y nucleares, permitiendo que se libere el ADN. Otros tampones de lisis similares incluyen el producto patentado de Qiagen Buffer P2.