Splicing alternativo

El empalme alternativo, o empalme alternativo de ARN, o empalme diferencial, es un proceso de empalme alternativo durante la expresión génica que permite que un solo gen codifica para múltiples proteínas. En este proceso, los exones particulares de un gen pueden incluirse o excluirse del ARN mensajero (ARNm) procesado final producido a partir de ese gen. Esto significa que los exones se unen en diferentes combinaciones, lo que da lugar a diferentes cadenas de ARNm (alternativas). En consecuencia, las proteínas traducidas de ARNm empalmados alternativamente suelen contener diferencias en su secuencia de aminoácidos y, a menudo, en sus funciones biológicas (ver Figura).

El empalme alternativo biológicamente relevante ocurre como un fenómeno normal en los eucariotas, donde aumenta la cantidad de proteínas que el genoma puede codificar. En los seres humanos, se cree ampliamente que ~95 % de los genes multiexónicos se empalman alternativamente para producir productos alternativos funcionales a partir del mismo gen, pero muchos científicos creen que la mayoría de las variantes de empalme observadas se deben a errores de empalme y al número real de mutaciones biológicas. genes empalmados alternativamente relevantes es mucho menor.

El empalme alternativo permite la generación regulada de múltiples productos de ARNm y proteínas a partir de un solo gen.

Se han observado numerosos modos de empalme alternativo, de los cuales el más común es la omisión de exón. En este modo, un exón particular puede incluirse en mRNAs bajo algunas condiciones o en tejidos particulares, y omitirse del mRNA en otros.

La producción de ARNm empalmados alternativamente está regulada por un sistema de proteínas que actúan en trans que se unen a los sitios que actúan en cis en la propia transcripción primaria. Dichas proteínas incluyen activadores de empalme que promueven el uso de un sitio de empalme particular y represores de empalme que reducen el uso de un sitio particular. Los mecanismos de empalme alternativo son muy variables y constantemente se encuentran nuevos ejemplos, particularmente mediante el uso de técnicas de alto rendimiento. Los investigadores esperan dilucidar por completo los sistemas reguladores involucrados en el empalme, de modo que los productos de empalme alternativos de un gen dado en condiciones particulares ("variantes de empalme") puedan predecirse mediante un "código de empalme".

Las variaciones anormales en el empalme también están implicadas en la enfermedad; una gran proporción de los trastornos genéticos humanos resultan de variantes de corte y empalme. También se cree que las variantes de empalme anormales contribuyen al desarrollo del cáncer, y los genes del factor de empalme se mutan con frecuencia en diferentes tipos de cáncer.

Descubrimiento

El empalme alternativo se observó por primera vez en 1977. El adenovirus produce cinco transcripciones primarias al principio de su ciclo infeccioso, antes de la replicación del ADN viral, y una adicional más tarde, después de que comienza la replicación del ADN. Las primeras transcripciones primarias continúan produciéndose después de que comienza la replicación del ADN. La transcripción primaria adicional que se produce al final de la infección es grande y proviene de 5/6 del genoma del adenovirus de 32 kb. Esto es mucho más grande que cualquiera de los ARNm de adenovirus individuales presentes en las células infectadas. Los investigadores descubrieron que el transcrito de ARN primario producido por el adenovirus tipo 2 en la fase tardía se empalmaba de muchas maneras diferentes, lo que resultaba en ARNm que codificaban diferentes proteínas virales. Además, la transcripción primaria contenía múltiples sitios de poliadenilación, dando diferentes extremos 3' para los ARNm procesados.

En 1981, se caracterizó el primer ejemplo de corte y empalme alternativo en una transcripción de un gen endógeno normal. Se descubrió que el gen que codifica la hormona tiroidea calcitonina se empalma alternativamente en células de mamífero. La transcripción primaria de este gen contiene 6 exones; el ARNm de calcitonina contiene los exones 1–4 y termina después de un sitio de poliadenilación en el exón 4. Se produce otro ARNm a partir de este pre-ARNm saltando el exón 4 e incluye los exones 1–3, 5 y 6. Codifica una proteína conocida como CGRP (péptido relacionado con el gen de la calcitonina). A principios de la década de 1980 también se observaron ejemplos de corte y empalme alternativo en transcritos de genes de inmunoglobina en mamíferos.

Desde entonces, se han encontrado muchos otros ejemplos de corte y empalme alternativo biológicamente relevantes en eucariotas. El "poseedor del récord" para el empalme alternativo es un D. melanogaster llamado Dscam, que potencialmente podría tener 38.016 variantes de empalme.

En 2021, se descubrió que el genoma del adenovirus tipo 2, el adenovirus en el que se identificó por primera vez el empalme alternativo, podía producir una variedad de ARNm mucho mayor de lo que se pensaba anteriormente. Mediante el uso de tecnología de secuenciación de próxima generación, los investigadores pudieron actualizar el transcriptoma del adenovirus humano tipo 2 y presentar un ARNm único 904 alucinante, producido por el virus a través de un patrón complejo de empalme alternativo. Se ha demostrado que muy pocas de estas variantes de empalme son funcionales, un punto que los autores plantean en su artículo.

"Una pregunta sobresaliente es qué roles juega la menagerie de los nuevos ARNs o si son moléculas espurias generadas por una maquinaria de espolvoramiento sobrecargada."

Modos

Por lo general, se reconocen cinco modos básicos de empalme alternativo.

• Exon saltando o cassette exon: en este caso, un exón puede ser salpicado de la transcripción primaria o retenido. Este es el modo más común en los premRNAs mamíferos.
• Exones Mutually exclusivos: Uno de los dos exones se retiene en mRNAs después de rociar, pero no ambos.
• Sitio de donantes alternativos: Se utiliza una unión de empalme alternativa de 5' (sitio de donantes) que cambia el límite de 3' del exón aguas arriba.
• Sitio de aceptación alternativo: Se utiliza una unión de empalme alternativa de 3' (sitio de receptor) que cambia el límite de 5' del exón aguas abajo.
• Retención de hierro: Una secuencia puede ser rociada como un intrón o simplemente retenida. Esto se distingue de los saltos de exón porque la secuencia retenida no está flanqueada por los intrones. Si el intrón retenido está en la región de codificación, el intrón debe codificar aminoácidos en marco con los exones vecinos, o un codón de parada o un cambio en el marco de lectura hará que la proteína no funcione. Este es el modo más raro en los mamíferos pero el más común en las plantas.

Además de estos modos primarios de corte y empalme alternativo, existen otros dos mecanismos principales mediante los cuales se pueden generar diferentes ARNm a partir del mismo gen; múltiples promotores y múltiples sitios de poliadenilación. El uso de múltiples promotores se describe adecuadamente como un mecanismo de regulación transcripcional en lugar de corte y empalme alternativo; al iniciar la transcripción en diferentes puntos, se pueden generar transcripciones con diferentes exones 5'-most. En el otro extremo, múltiples sitios de poliadenilación proporcionan diferentes 3' puntos finales de la transcripción. Ambos mecanismos se encuentran en combinación con empalmes alternativos y proporcionan una variedad adicional en los ARNm derivados de un gen.

Estos modos describen mecanismos básicos de empalme, pero pueden ser inadecuados para describir eventos de empalme complejos. Por ejemplo, la figura de la derecha muestra 3 formas de corte y empalme del gen de la hialuronidasa 3 de ratón. La comparación de la estructura exónica que se muestra en la primera línea (verde) con la de la segunda línea (amarillo) muestra la retención de intrones, mientras que la comparación entre la segunda y la tercera forma de empalme (amarillo frente a azul) muestra la omisión de exón. Recientemente se ha propuesto una nomenclatura modelo para designar de forma única todos los posibles patrones de empalme.

Mecanismos

Mecanismo general de empalme

Cuando el pre-ARNm se ha transcrito a partir del ADN, incluye varios intrones y exones. (En los nematodos, la media es de 4 a 5 exones e intrones; en la mosca de la fruta Drosophila puede haber más de 100 intrones y exones en un pre-ARNm transcrito). El ARNm se determina durante el proceso de empalme. La regulación y selección de los sitios de empalme se realizan mediante activadores de empalme que actúan en trans y proteínas represoras de empalme, así como elementos que actúan en cis dentro del propio pre-ARNm, como potenciadores de empalme exónicos y silenciadores de empalme exónicos.

El intrón nuclear eucariótico típico tiene secuencias de consenso que definen regiones importantes. Cada intrón tiene la secuencia GU en su posición 5' fin. Cerca del 3' final hay un sitio de sucursal. El nucleótido en el punto de ramificación es siempre una A; el consenso en torno a esta secuencia varía algo. En humanos, la secuencia consenso del sitio de ramificación es yUnAy. El sitio de ramificación es seguido por una serie de pirimidinas, el tracto de polipirimidina, luego por AG en el 3' fin.

El empalme del ARNm lo realiza un complejo de proteína y ARN conocido como spliceosoma, que contiene snRNP designados como U1, U2, U4, U5 y U6 (U3 no participa en el empalme del ARNm). U1 se une al 5' GU y U2, con la ayuda de los factores proteicos U2AF, se unen al punto de ramificación A dentro del sitio de ramificación. El complejo en esta etapa se conoce como complejo de espliceosoma A. La formación del complejo A suele ser el paso clave para determinar los extremos del intrón que se va a empalmar y definir los extremos del exón que se va a retener. (La nomenclatura U se deriva de su alto contenido de uridina).

El complejo U4,U5,U6 se une y U6 reemplaza la posición U1. U1 y U4 se van. El complejo restante luego realiza dos reacciones de transesterificación. En la primera transesterificación, 5' El extremo del intrón se escinde del exón corriente arriba y se une al sitio de ramificación A mediante un enlace 2',5'-fosfodiéster. En la segunda transesterificación, el 3' El extremo del intrón se escinde del exón aguas abajo y los dos exones se unen mediante un enlace fosfodiéster. A continuación, el intrón se libera en forma de lazo y se degrada.

Elementos reguladores y proteínas

El empalme está regulado por proteínas que actúan en trans (represores y activadores) y los correspondientes sitios reguladores que actúan en cis (silenciadores y potenciadores) en el pre-ARNm. Sin embargo, como parte de la complejidad del empalme alternativo, se observa que los efectos de un factor de empalme dependen con frecuencia de la posición. Es decir, un factor de empalme que sirve como activador de empalme cuando se une a un elemento potenciador intrónico puede servir como represor cuando se une a su elemento de empalme en el contexto de un exón, y viceversa. La estructura secundaria de la transcripción de pre-ARNm también desempeña un papel en la regulación del empalme, por ejemplo, reuniendo elementos de empalme o enmascarando una secuencia que, de otro modo, serviría como elemento de unión para un factor de empalme. Juntos, estos elementos forman un "código de empalme" que gobierna cómo ocurrirá el empalme bajo diferentes condiciones celulares.

Hay dos tipos principales de elementos de secuencia de ARN que actúan en cis presentes en los pre-ARNm y tienen proteínas de unión a ARN que actúan en trans correspondientes. Los silenciadores de empalme son sitios a los que se unen las proteínas represoras de empalme, lo que reduce la probabilidad de que un sitio cercano se utilice como unión de empalme. Estos pueden estar ubicados en el propio intrón (silenciadores de empalme intrónico, ISS) o en un exón vecino (silenciadores de empalme exónico, ESS). Varían en secuencia, así como en los tipos de proteínas que se unen a ellos. La mayoría de los represores de corte y empalme son ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNP), como hnRNPA1 y proteína de unión al tracto de polipirimidina (PTB). Los potenciadores de empalme son sitios a los que se unen proteínas activadoras de empalme, lo que aumenta la probabilidad de que un sitio cercano se utilice como unión de empalme. Estos también pueden ocurrir en el intrón (potenciadores de empalme intrónico, ISE) o exón (potenciadores de empalme exónico, ESE). La mayoría de las proteínas activadoras que se unen a los ISE y ESEs son miembros de la familia de proteínas SR. Tales proteínas contienen motivos de reconocimiento de ARN y dominios ricos en arginina y serina (RS).

En general, los determinantes del empalme funcionan de manera interdependiente que depende del contexto, de modo que las reglas que rigen cómo se regula el empalme forman un código de empalme. La presencia de un elemento de secuencia de ARN que actúa en cis particular puede aumentar la probabilidad de que un sitio cercano se empalme en algunos casos, pero disminuir la probabilidad en otros casos, según el contexto. El contexto dentro del cual actúan los elementos reguladores incluye el contexto de actuación en cis que se establece por la presencia de otras características de la secuencia de ARN y el contexto de actuación en trans que se establece por las condiciones celulares. Por ejemplo, algunos elementos de la secuencia de ARN que actúan en cis influyen en el corte y empalme solo si hay varios elementos presentes en la misma región para establecer el contexto. Como otro ejemplo, un elemento que actúa en cis puede tener efectos opuestos en el empalme, según qué proteínas se expresen en la célula (p. ej., PTB neuronal frente a no neuronal). La importancia adaptativa de empalmar silenciadores y potenciadores está atestiguada por estudios que muestran que existe una fuerte selección en genes humanos contra mutaciones que producen nuevos silenciadores o interrumpen los potenciadores existentes.

Metilación del ADN y empalme alternativo en insectos sociales

La metilación del ADN CpG ha mostrado un papel en la regulación del empalme alternativo en insectos sociales. En las abejas melíferas (Apis mellifera), la metilación del ADN CpG parece regular la omisión de exón según los primeros estudios genómicos posteriores a la disponibilidad del genoma de la abeja melífera. La metilación del ADN CpG regula el empalme alternativo de manera más extensa, no solo afecta la omisión de exón, sino también la retención de intrones y otros eventos de empalme.

Ejemplos

Omisión de exón: Drosophila dsx

Pre-ARNm de la D. El gen melanogaster dsx contiene 6 exones. En los machos, los exones 1, 2, 3, 5 y 6 se unen para formar el ARNm, que codifica una proteína reguladora de la transcripción necesaria para el desarrollo masculino. En las mujeres, los exones 1, 2, 3 y 4 se unen y una señal de poliadenilación en el exón 4 provoca la escisión del ARNm en ese punto. El ARNm resultante es una proteína reguladora transcripcional requerida para el desarrollo femenino.

Este es un ejemplo de omisión de exón. El intrón aguas arriba del exón 4 tiene un tramo de polipirimidina que no coincide bien con la secuencia de consenso, por lo que las proteínas U2AF se unen mal a él sin la ayuda de los activadores de corte y empalme. Este 3' Por lo tanto, el sitio del aceptor de empalme no se usa en machos. Las hembras, sin embargo, producen el transformador activador de empalme (Tra) (ver más abajo). La proteína SR Tra2 se produce en ambos sexos y se une a un ESE en el exón 4; si Tra está presente, se une a Tra2 y, junto con otra proteína SR, forma un complejo que ayuda a las proteínas U2AF a unirse al tracto de polipirimidina débil. U2 se recluta en el punto de ramificación asociado y esto lleva a la inclusión del exón 4 en el ARNm.

Sitios aceptores alternativos: Drosophila Transformer

Los pre-ARNm del gen Transformador (Tra) de Drosophila melanogaster se someten a empalmes alternativos a través del modo de sitio aceptor alternativo. El gen Tra codifica una proteína que se expresa solo en mujeres. La transcripción primaria de este gen contiene un intrón con dos posibles sitios aceptores. En los machos, se usa el sitio aceptor aguas arriba. Esto hace que se incluya una versión más larga del exón 2 en la transcripción procesada, incluido un codón de parada temprano. El ARNm resultante codifica un producto proteico truncado que es inactivo. Las hembras producen la proteína maestra de determinación del sexo Sex lethal (Sxl). La proteína Sxl es un represor de corte y empalme que se une a un ISS en el ARN de la transcripción de Tra cerca del sitio aceptor corriente arriba, evitando que la proteína U2AF se una al tracto de polipirimidina. Esto evita el uso de esta unión, desplazando la unión del spliceosoma al sitio aceptor aguas abajo. El empalme en este punto pasa por alto el codón de terminación, que se elimina como parte del intrón. El ARNm resultante codifica una proteína Tra activa, que en sí misma es un regulador del corte y empalme alternativo de otros genes relacionados con el sexo (ver dsx arriba).

Definición de exón: receptor Fas

Se producen múltiples isoformas de la proteína del receptor Fas mediante corte y empalme alternativo. Dos isoformas que ocurren normalmente en humanos son producidas por un mecanismo de omisión de exón. Un ARNm que incluye el exón 6 codifica la forma unida a la membrana del receptor Fas, que promueve la apoptosis o muerte celular programada. El aumento de la expresión del receptor Fas en las células de la piel expuestas crónicamente al sol y la ausencia de expresión en las células cancerosas de la piel sugiere que este mecanismo puede ser importante en la eliminación de las células precancerosas en los seres humanos. Si se omite el exón 6, el ARNm resultante codifica una proteína Fas soluble que no promueve la apoptosis. La inclusión o la omisión del exón depende de dos proteínas antagonistas, la TIA-1 y la proteína de unión al tracto de polipirimidina (PTB).

• El sitio de 5' donantes en el intron río abajo del exón 6 en el pre-mRNA tiene un acuerdo débil con la secuencia de consenso, y no está obligado generalmente por el U1 snRNP. Si U1 no se une, el exón se salta (ver "a" en figura acompañante).
• La unión de la proteína TIA-1 a un sitio de potenciador de empalme intronico estabiliza la unión de la U1 snRNP. El complejo de sitio de 5' donante resultante ayuda en la unión del factor de empalme U2AF al sitio de 3' empalmes arriba del exón, a través de un mecanismo que aún no se conoce (ver b).
• Exon 6 contiene un silenciador exónico rico en pirimidina, ure6, donde PTB puede atar. Si PTB se une, inhibe el efecto del complejo de donantes de 5' sobre la unión de U2AF al sitio de aceptadores, lo que resulta en el escaneo de exones (véase c).

Este mecanismo es un ejemplo de definición de exón en el empalme. Un spliceosoma se ensambla en un intrón y las subunidades snRNP pliegan el ARN para que el 5' y 3' se unen los extremos del intrón. Sin embargo, ejemplos estudiados recientemente como este muestran que también hay interacciones entre los extremos del exón. En este caso particular, estas interacciones de definición de exón son necesarias para permitir la unión de los factores de empalme del núcleo antes del ensamblaje de los spliceosomas en los dos intrones flanqueantes.

Competencia represor-activador: VIH-1 tat exón 2

El VIH, el retrovirus que causa el SIDA en humanos, produce un único transcrito de ARN primario, que se empalma alternativamente de múltiples formas para producir más de 40 ARNm diferentes. El equilibrio entre las transcripciones empalmadas diferencialmente proporciona múltiples ARNm que codifican diferentes productos que se requieren para la multiplicación viral. Una de las transcripciones empalmadas diferencialmente contiene el gen tat, en el que el exón 2 es un exón de casete que se puede omitir o incluir. La inclusión del exón 2 tat en el ARN está regulada por la competencia entre el represor de corte y empalme hnRNP A1 y la proteína SR SC35. Dentro del exón 2, una secuencia silenciadora de empalme exónico (ESS) y una secuencia potenciadora de empalme exónico (ESE) se superponen. Si la proteína represora A1 se une al ESS, inicia la unión cooperativa de múltiples moléculas A1, extendiéndose hacia el sitio donante 5' aguas arriba del exón 2 y evitando la unión del factor central de empalme U2AF35 al tracto de polipirimidina. Si SC35 se une al ESE, evita la unión de A1 y mantiene el sitio donante 5' en un estado accesible para el ensamblaje del spliceosoma. La competencia entre el activador y el represor asegura que se produzcan ambos tipos de ARNm (con y sin exón 2).

Importancia adaptativa

El empalme alternativo genuino ocurre tanto en los genes que codifican proteínas como en los genes que no codifican para producir múltiples productos (proteínas o ARN no codificantes). Se necesita información externa para decidir qué producto se hace, dada una secuencia de ADN y la transcripción inicial. Dado que los métodos de regulación se heredan, esto proporciona formas novedosas para que las mutaciones afecten la expresión génica.

El empalme alternativo puede proporcionar flexibilidad evolutiva. Una mutación de un solo punto puede hacer que un exón determinado se excluya o incluya ocasionalmente de una transcripción durante el corte y empalme, lo que permite la producción de una nueva isoforma de proteína sin pérdida de la proteína original. Los estudios han identificado regiones intrínsecamente desordenadas (consulte Proteínas intrínsecamente no estructuradas) como enriquecidas en los exones no constitutivos, lo que sugiere que las isoformas de proteínas pueden mostrar diversidad funcional debido a la alteración de los módulos funcionales dentro de estas regiones. Tal diversidad funcional lograda por las isoformas se refleja en sus patrones de expresión y puede predecirse mediante enfoques de aprendizaje automático. Los estudios comparativos indican que el empalme alternativo precedió a la multicelularidad en la evolución y sugieren que este mecanismo podría haber sido cooptado para ayudar en el desarrollo de organismos multicelulares.

La investigación basada en el Proyecto del Genoma Humano y otras secuencias del genoma ha demostrado que los humanos tienen solo alrededor de un 30 % más de genes que el gusano redondo Caenorhabditis elegans, y solo alrededor del doble que la mosca Drosophila melanogaster. Este hallazgo llevó a la especulación de que la mayor complejidad percibida de los humanos, o de los vertebrados en general, podría deberse a tasas más altas de empalmes alternativos en los humanos que en los invertebrados. Sin embargo, un estudio sobre muestras de 100 000 EST de humanos, ratones, ratas, vacas, moscas (D. melanogaster), gusanos (C. elegans) y plantas Arabidopsis thaliana no encontró grandes diferencias en la frecuencia de genes empalmados alternativamente entre humanos y cualquiera de los otros animales probados. Otro estudio, sin embargo, propuso que estos resultados eran un artefacto de los diferentes números de tecnologías ecológicamente racionales disponibles para los distintos organismos. Cuando compararon frecuencias de empalme alternativo en subconjuntos aleatorios de genes de cada organismo, los autores concluyeron que los vertebrados tienen tasas más altas de empalme alternativo que los invertebrados.

Enfermedad

Los cambios en la maquinaria de procesamiento del ARN pueden conducir a un empalme incorrecto de múltiples transcritos, mientras que las alteraciones de un solo nucleótido en los sitios de empalme o los sitios reguladores de empalme que actúan en cis pueden conducir a diferencias en el empalme de un solo gen y, por lo tanto, en el ARNm producido a partir de las transcripciones de un gen mutante. Un estudio realizado en 2005 que involucró análisis probabilísticos indicó que más del 60% de las mutaciones causantes de enfermedades humanas afectan el empalme en lugar de afectar directamente las secuencias de codificación. Un estudio más reciente indica que es probable que un tercio de todas las enfermedades hereditarias tengan un componente de empalme. Independientemente del porcentaje exacto, existen varias enfermedades relacionadas con el empalme. Como se describe a continuación, un ejemplo destacado de enfermedades relacionadas con el empalme es el cáncer.

Los ARNm empalmados anormalmente también se encuentran en una alta proporción de células cancerosas. Los análisis combinados de RNA-Seq y proteómica han revelado una expresión diferencial sorprendente de isoformas de empalme de proteínas clave en importantes vías del cáncer. No siempre está claro si tales patrones aberrantes de empalme contribuyen al crecimiento canceroso o son meramente consecuencia de anomalías celulares asociadas con el cáncer. Para ciertos tipos de cáncer, como el colorrectal y el de próstata, se ha demostrado que la cantidad de errores de empalme por cáncer varía mucho entre los cánceres individuales, un fenómeno denominado inestabilidad del transcriptoma. Además, se ha demostrado que la inestabilidad del transcriptoma se correlaciona en gran medida con un nivel de expresión reducido de los genes del factor de empalme. Se ha demostrado que la mutación de DNMT3A contribuye a las neoplasias malignas hematológicas y que las líneas celulares mutadas en DNMT3A muestran inestabilidad transcriptómica en comparación con sus contrapartes isogénicas de tipo salvaje.

De hecho, en realidad hay una reducción del empalme alternativo en las células cancerosas en comparación con las normales, y los tipos de empalme difieren; por ejemplo, las células cancerosas muestran niveles más altos de retención de intrones que las células normales, pero niveles más bajos de omisión de exón. Algunas de las diferencias en el empalme en las células cancerosas pueden deberse a la alta frecuencia de mutaciones somáticas en los genes del factor de empalme, y algunas pueden resultar de cambios en la fosforilación de los factores de empalme que actúan en trans. Otros pueden ser producidos por cambios en las cantidades relativas de factores de empalme producidos; por ejemplo, se ha demostrado que las células de cáncer de mama tienen niveles elevados del factor de empalme SF2/ASF. Un estudio encontró que un porcentaje relativamente pequeño (383 de más de 26000) de variantes de corte y empalme alternativas tenían una frecuencia significativamente mayor en las células tumorales que en las células normales, lo que sugiere que hay un conjunto limitado de genes que, cuando se empalman mal, contribuyen a la formación de tumores. desarrollo. Sin embargo, se cree que los efectos nocivos de las transcripciones empalmadas incorrectamente generalmente se salvaguardan y eliminan mediante un mecanismo de control de calidad postranscripcional celular denominado descomposición del ARNm mediada por tonterías [NMD].

Un ejemplo de una variante de empalme específica asociada con el cáncer se encuentra en uno de los genes DNMT humanos. Tres genes DNMT codifican enzimas que agregan grupos metilo al ADN, una modificación que a menudo tiene efectos reguladores. Varios ARNm de DNMT3B empalmados anormalmente se encuentran en tumores y líneas de células cancerosas. En dos estudios separados, la expresión de dos de estos ARNm empalmados de manera anormal en células de mamífero provocó cambios en los patrones de metilación del ADN en esas células. Las células con uno de los ARNm anormales también crecieron dos veces más rápido que las células de control, lo que indica una contribución directa de este producto al desarrollo de tumores.

Otro ejemplo es el protooncogén Ron (MST1R). Una propiedad importante de las células cancerosas es su capacidad para moverse e invadir el tejido normal. Se ha encontrado que la producción de una transcripción anormalmente empalmada de Ron está asociada con niveles elevados de SF2/ASF en células de cáncer de mama. La isoforma anormal de la proteína Ron codificada por este ARNm conduce a la motilidad celular.

La sobreexpresión de una variante de empalme truncado del gen FOSB (ΔFosB) en una población específica de neuronas en el núcleo accumbens se ha identificado como el mecanismo causal implicado en la inducción y el mantenimiento de una adicción a las drogas y las recompensas naturales.

Estudios provocativos recientes apuntan a una función clave de la estructura de la cromatina y las modificaciones de las histonas en la regulación del empalme alternativo. Estos conocimientos sugieren que la regulación epigenética determina no solo qué partes del genoma se expresan, sino también cómo se empalman.

Análisis de todo el genoma

El análisis de todo el genoma del empalme alternativo es una tarea desafiante. Por lo general, se han encontrado transcritos empalmados alternativamente comparando secuencias de EST, pero esto requiere la secuenciación de un gran número de EST. La mayoría de las bibliotecas de EST provienen de un número muy limitado de tejidos, por lo que es probable que se pasen por alto variantes de empalme específicas de tejido en cualquier caso. Sin embargo, se han desarrollado enfoques de alto rendimiento para investigar el empalme, como: análisis basados en micromatrices de ADN, ensayos de unión de ARN y secuenciación profunda. Estos métodos se pueden usar para detectar polimorfismos o mutaciones en o alrededor de los elementos de empalme que afectan la unión a proteínas. Cuando se combina con ensayos de corte y empalme, incluidos los ensayos de genes informadores in vivo, se pueden analizar los efectos funcionales de los polimorfismos o mutaciones en el corte y empalme de los transcritos de pre-ARNm.

En el análisis de micromatrices, se han utilizado matrices de fragmentos de ADN que representan exones individuales (p. ej., micromatriz de exones de Affymetrix) o límites exón/exón (p. ej., matrices de ExonHit o Jivan).. A continuación, la matriz se sondea con cDNA marcado de tejidos de interés. Los ADNc de la sonda se unen al ADN de los exones que están incluidos en los ARNm en su tejido de origen, o al ADN del límite donde se han unido dos exones. Esto puede revelar la presencia de mRNA particulares empalmados alternativamente.

CLIP (entrecruzamiento e inmunoprecipitación) utiliza radiación ultravioleta para unir proteínas a moléculas de ARN en un tejido durante el empalme. A continuación, se precipita una proteína reguladora de corte y empalme que actúa en trans de interés utilizando anticuerpos específicos. Cuando el ARN unido a esa proteína se aísla y se clona, revela las secuencias objetivo de esa proteína. Otro método para identificar proteínas de unión a ARN y mapear su unión a transcripciones de pre-ARNm es "Microarray Evaluation of Genomic Aptamers by shift (MEGAshift)".net. Este método implica una adaptación de "Systematic Evolución de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX)" método junto con una lectura basada en microarrays. El uso del método MEGAshift ha proporcionado información sobre la regulación del empalme alternativo al permitir la identificación de secuencias en transcripciones de pre-ARNm que rodean exones empalmados alternativamente que median la unión a diferentes factores de empalme, como ASF/SF2 y PTB. Este enfoque también se ha utilizado para ayudar a determinar la relación entre la estructura secundaria del ARN y la unión de los factores de corte y empalme.

Se han utilizado tecnologías de secuenciación profunda para realizar análisis de ARNm de todo el genoma (sin procesar y procesados), lo que proporciona información sobre empalmes alternativos. Por ejemplo, los resultados del uso de la secuenciación profunda indican que, en humanos, aproximadamente el 95 % de las transcripciones de los genes multiexon se someten a empalmes alternativos, con varios transcritos de pre-ARNm empalmados de manera específica de tejido. La genómica funcional y los enfoques computacionales basados en el aprendizaje de múltiples instancias también se han desarrollado para integrar datos de RNA-seq para predecir funciones para isoformas empalmadas alternativamente. La secuenciación profunda también ha ayudado en la detección in vivo de los lariats transitorios que se liberan durante el empalme, la determinación de secuencias de sitios de ramificación y el mapeo a gran escala de puntos de ramificación en transcripciones de pre-ARNm humano.

El uso de ensayos indicadores hace posible encontrar las proteínas de empalme involucradas en un evento de empalme alternativo específico mediante la construcción de genes indicadores que expresarán una de dos proteínas fluorescentes diferentes según la reacción de empalme que se produzca. Este método se ha utilizado para aislar mutantes que afectan al empalme y, por lo tanto, para identificar nuevas proteínas reguladoras del empalme inactivadas en esos mutantes.

Bases de datos

Hay una colección de bases de datos de empalme alternativas. Estas bases de datos son útiles para encontrar genes que tienen pre-ARNm que se someten a empalmes alternativos y eventos de empalmes alternativos o para estudiar el impacto funcional del empalme alternativo.