Secuencia de escopeta

En genética, la secuenciación aleatoria es un método que se utiliza para secuenciar hebras aleatorias de ADN. Se nombra por analogía con la agrupación de disparos casi aleatorios de rápida expansión de una escopeta.

El método de terminación de cadena de secuenciación de ADN ("secuenciación de Sanger") solo se puede usar para cadenas cortas de ADN de 100 a 1000 pares de bases. Debido a este límite de tamaño, las secuencias más largas se subdividen en fragmentos más pequeños que se pueden secuenciar por separado y estas secuencias se ensamblan para dar la secuencia general.

En la secuenciación automática, el ADN se divide aleatoriamente en numerosos segmentos pequeños, que se secuencian mediante el método de terminación de cadena para obtener lecturas. Se obtienen múltiples lecturas superpuestas para el ADN objetivo realizando varias rondas de esta fragmentación y secuenciación. Luego, los programas de computadora usan los extremos superpuestos de diferentes lecturas para ensamblarlos en una secuencia continua.

La secuenciación instantánea fue una de las tecnologías precursoras responsables de permitir la secuenciación del genoma completo.

Ejemplo

Por ejemplo, considere las siguientes dos rondas de lecturas de escopeta:

En este ejemplo extremadamente simplificado, ninguna de las lecturas cubre la longitud total de la secuencia original, pero las cuatro lecturas se pueden ensamblar en la secuencia original usando la superposición de sus extremos para alinearlas y ordenarlas. En realidad, este proceso utiliza enormes cantidades de información que están plagadas de ambigüedades y errores de secuencia. El ensamblaje de genomas complejos se complica aún más por la gran abundancia de secuencias repetitivas, lo que significa que lecturas cortas similares podrían provenir de partes completamente diferentes de la secuencia.

Son necesarias muchas lecturas superpuestas para cada segmento del ADN original para superar estas dificultades y ensamblar la secuencia con precisión. Por ejemplo, para completar el Proyecto Genoma Humano, la mayor parte del genoma humano se secuenció con una cobertura de 12X o mayor; es decir, cada base de la secuencia final estuvo presente en promedio en 12 lecturas diferentes. Aun así, los métodos actuales no lograron aislar o ensamblar una secuencia confiable para aproximadamente el 1% del genoma humano (eucromático), a partir de 2004.

Secuenciación aleatoria del genoma completo

Historia

La secuenciación rápida del genoma completo para genomas pequeños (de 4000 a 7000 pares de bases) se sugirió por primera vez en 1979. El primer genoma secuenciado mediante secuenciación rápida fue el del virus del mosaico de la coliflor, publicado en 1981.

Secuenciación de extremos emparejados

Una aplicación más amplia se benefició de la secuenciación final por pares, conocida coloquialmente como secuenciación de escopeta de doble cañón. A medida que los proyectos de secuenciación comenzaron a asumir secuencias de ADN más largas y complicadas, varios grupos comenzaron a darse cuenta de que se podía obtener información útil mediante la secuenciación de ambos extremos de un fragmento de ADN. Aunque la secuenciación de ambos extremos del mismo fragmento y el seguimiento de los datos emparejados fue más engorrosa que la secuenciación de un solo extremo de dos fragmentos distintos, el conocimiento de que las dos secuencias estaban orientadas en direcciones opuestas y tenían aproximadamente la longitud de un fragmento aparte de cada uno. otro fue valioso para reconstruir la secuencia del fragmento objetivo original.

Historia. La primera descripción publicada del uso de extremos emparejados fue en 1990 como parte de la secuenciación del locus HGPRT humano, aunque el uso de extremos emparejados se limitó a cerrar brechas después de la aplicación de un enfoque de secuenciación de escopeta tradicional. La primera descripción teórica de una estrategia de secuenciación final por pares pura, asumiendo fragmentos de longitud constante, fue en 1991. En ese momento, había consenso en la comunidad de que la longitud óptima del fragmento para la secuenciación final por pares sería tres veces la longitud de lectura de la secuencia. En 1995 Roach et al. introdujo la innovación de usar fragmentos de diferentes tamaños y demostró que una estrategia de secuenciación final por pares pura sería posible en objetivos grandes. La estrategia fue adoptada posteriormente por el Instituto de Investigación Genómica (TIGR) para secuenciar el genoma de la bacteria Haemophilus influenzae en 1995, y luego por Celera Genomics para secuenciar la Drosophila melanogaster. (mosca de la fruta) en 2000, y posteriormente el genoma humano.

Enfoque

Para aplicar la estrategia, una hebra de ADN de alto peso molecular se corta en fragmentos aleatorios, se selecciona por tamaño (generalmente 2, 10, 50 y 150 kb) y se clona en un vector apropiado. A continuación, los clones se secuencian desde ambos extremos utilizando el método de terminación de cadena que produce dos secuencias cortas. Cada secuencia se denomina lectura final o lectura 1 y lectura 2 y dos lecturas del mismo clon se denominan pares de pareja. Dado que el método de terminación de cadena generalmente solo puede producir lecturas de entre 500 y 1000 bases de largo, en todos los clones, excepto en los más pequeños, los pares de pareja rara vez se superpondrán.

Montaje

La secuencia original se reconstruye a partir de las lecturas utilizando un software de ensamblaje de secuencias. Primero, las lecturas superpuestas se recopilan en secuencias compuestas más largas conocidas como contigs. Los contigs se pueden vincular entre sí en andamios siguiendo las conexiones entre pares de pareja. La distancia entre contigs se puede deducir de las posiciones de los pares de pareja si se conoce la longitud promedio de los fragmentos de la biblioteca y tiene una ventana estrecha de desviación. Dependiendo del tamaño del espacio entre contigs, se pueden usar diferentes técnicas para encontrar la secuencia en los espacios. Si la brecha es pequeña (5-20 kb), entonces se requiere el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar la región, seguida de la secuenciación. Si la brecha es grande (>20 kb), el fragmento grande se clona en vectores especiales, como los cromosomas artificiales bacterianos (BAC), seguido de la secuenciación del vector.

Pros y contras

Los defensores de este enfoque argumentan que es posible secuenciar todo el genoma a la vez utilizando grandes conjuntos de secuenciadores, lo que hace que todo el proceso sea mucho más eficiente que los enfoques más tradicionales. Los detractores argumentan que aunque la técnica secuencia rápidamente grandes regiones de ADN, su capacidad para vincular correctamente estas regiones es sospechosa, particularmente para genomas con regiones repetitivas. A medida que los programas de ensamblaje de secuencias se vuelven más sofisticados y la potencia informática se abarata, es posible que se supere esta limitación.

Cobertura

La cobertura (profundidad o profundidad de lectura) es el número promedio de lecturas que representan un nucleótido dado en la secuencia reconstruida. Se puede calcular a partir de la longitud del genoma original (G), el número de lecturas(N), y la longitud promedio de lectura(Lcomo ${displaystyle Ntimes L/G}$. Por ejemplo, un genoma hipotético con 2.000 pares de base reconstruidos de 8 lecturas con una longitud promedio de 500 nucleótidos tendrá 2x redundancia. Este parámetro también permite estimar otras cantidades, como el porcentaje del genoma cubierto por lecturas (a veces también llamada cobertura). Se desea una alta cobertura en secuenciación de escopetas porque puede superar errores en la llamada base y montaje. El tema de la teoría de secuenciación del ADN aborda las relaciones de tales cantidades.

A veces se hace una distinción entre cobertura de secuencia y cobertura física. La cobertura de secuencia es el número promedio de veces que se lee una base (como se describe anteriormente). La cobertura física es el número promedio de veces que se lee una base o se amplía mediante lecturas emparejadas.

Secuencia de escopeta jerárquica

En la secuenciación completa de escopeta de genoma (top), todo el genoma se derrama aleatoriamente en pequeños fragmentos (apropiado tamaño para secuenciar) y luego se reensambla. En la secuenciación jerárquica de escopeta (abajo), el genoma se divide primero en segmentos más grandes. Después de que el orden de estos segmentos se deduce, se derraman en fragmentos de tamaño adecuado para la secuenciación.

Aunque, en teoría, la secuenciación rápida puede aplicarse a un genoma de cualquier tamaño, su aplicación directa a la secuenciación de genomas grandes (por ejemplo, el genoma humano) estuvo limitada hasta finales de la década de 1990, cuando los avances tecnológicos hicieron práctico el manejo de las grandes cantidades de datos complejos involucrados en el proceso. Históricamente, se creía que la secuenciación aleatoria del genoma completo estaba limitada tanto por el tamaño de los genomas grandes como por la complejidad añadida por el alto porcentaje de ADN repetitivo (más del 50 % para el genoma humano) presente en los genomas grandes. No estaba ampliamente aceptado que una secuencia de escopeta de genoma completo de un genoma grande proporcionaría datos confiables. Por estas razones, se tuvieron que utilizar otras estrategias que redujeron la carga computacional del ensamblaje de la secuencia antes de realizar la secuenciación aleatoria. En la secuenciación jerárquica, también conocida como secuenciación de arriba hacia abajo, se crea un mapa físico de baja resolución del genoma antes de la secuenciación real. A partir de este mapa, se selecciona un número mínimo de fragmentos que cubren todo el cromosoma para la secuenciación. De esta manera, se requiere la cantidad mínima de secuenciación y ensamblaje de alto rendimiento.

El genoma amplificado se corta primero en piezas más grandes (50-200 kb) y se clona en un huésped bacteriano utilizando BAC o cromosomas artificiales derivados de P1 (PAC). Debido a que múltiples copias del genoma se han cortado al azar, los fragmentos contenidos en estos clones tienen diferentes extremos, y con suficiente cobertura (ver la sección anterior) es teóricamente posible encontrar un andamio de contigs BAC que cubra todo el genoma. Este andamio se denomina ruta de mosaico.

Un contig BAC que cubre todo el área genómica de interés compone el camino de inclinación.

Una vez que se ha encontrado una ruta de mosaico, los BAC que forman esta ruta se cortan al azar en fragmentos más pequeños y se pueden secuenciar utilizando el método de escopeta en una escala más pequeña.

Aunque no se conocen las secuencias completas de los contigs BAC, se conocen sus orientaciones relativas entre sí. Hay varios métodos para deducir este orden y seleccionar los BAC que componen una ruta de mosaico. La estrategia general consiste en identificar las posiciones de los clones entre sí y luego seleccionar la menor cantidad de clones necesarios para formar un andamio contiguo que cubra toda el área de interés. El orden de los clones se deduce determinando la forma en que se superponen. Los clones superpuestos se pueden identificar de varias maneras. Una pequeña sonda marcada radiactiva o químicamente que contiene un sitio etiquetado con secuencia (STS) se puede hibridar en una micromatriz sobre la que se imprimen los clones. De esta forma, se identifican todos los clones que contienen una determinada secuencia en el genoma. El final de uno de estos clones se puede secuenciar para producir una nueva sonda y el proceso se repite en un método llamado caminata cromosómica.

Alternativamente, la biblioteca BAC puede ser digerida por restricción. Se infiere que dos clones que tienen varios tamaños de fragmentos en común se superponen porque contienen múltiples sitios de restricción espaciados de manera similar en común. Este método de mapeo genómico se denomina identificación de restricción porque identifica un conjunto de sitios de restricción contenidos en cada clon. Una vez que se ha encontrado la superposición entre los clones y se conoce su orden en relación con el genoma, se secuencia al azar un andamio de un subconjunto mínimo de estos contigs que cubre todo el genoma.

Debido a que primero implica la creación de un mapa de baja resolución del genoma, la secuenciación aleatoria jerárquica es más lenta que la secuenciación aleatoria del genoma completo, pero se basa menos en algoritmos informáticos que la secuenciación aleatoria del genoma completo. Sin embargo, el proceso de creación de bibliotecas BAC extensivas y la selección de ruta de mosaico hacen que la secuenciación jerárquica de escopeta sea lenta y laboriosa. Ahora que la tecnología está disponible y se ha demostrado la confiabilidad de los datos, la velocidad y la rentabilidad de la secuenciación rápida del genoma completo la han convertido en el método principal para la secuenciación del genoma.

Nuevas tecnologías de secuenciación

La secuenciación aleatoria clásica se basó en el método de secuenciación de Sanger: esta fue la técnica más avanzada para secuenciar genomas entre 1995 y 2005 aproximadamente. La estrategia de escopeta todavía se aplica hoy en día, sin embargo, se utilizan otras tecnologías de secuenciación, como la secuenciación de lectura corta y la secuenciación de lectura larga.

Lectura corta o "próxima generación" la secuenciación produce lecturas más cortas (entre 25 y 500 pb), pero muchos cientos de miles o millones de lecturas en un tiempo relativamente corto (del orden de un día). Esto da como resultado una alta cobertura, pero el proceso de ensamblaje es mucho más intensivo desde el punto de vista computacional. Estas tecnologías son muy superiores a la secuenciación de Sanger debido al gran volumen de datos y al tiempo relativamente corto que lleva secuenciar un genoma completo.

Secuenciación de escopeta metagenómica

Tener lecturas de 400-500 pares de bases de longitud es suficiente para determinar la especie o cepa del organismo de donde proviene el ADN, siempre que su genoma ya se conozca, utilizando, por ejemplo, un software clasificador taxonómico basado en k-mer. Con millones de lecturas de la secuenciación de próxima generación de una muestra ambiental, es posible obtener una descripción completa de cualquier microbioma complejo con miles de especies, como la flora intestinal. Las ventajas sobre la secuenciación de amplicón de ARNr 16S son: no estar limitado a bacterias; clasificación de nivel de cepa donde la secuenciación de amplicón solo obtiene el género; y la posibilidad de extraer genes completos y especificar su función como parte del metagenoma. La sensibilidad de la secuenciación metagenómica la convierte en una opción atractiva para uso clínico. Sin embargo, enfatiza el problema de la contaminación de la muestra o la tubería de secuenciación.