Replicación del ADN

En biología molecular, la replicación del ADN es el proceso biológico de producir dos réplicas idénticas de ADN a partir de una molécula de ADN original. La replicación del ADN ocurre en todos los organismos vivos actuando como la parte más esencial para la herencia biológica. Esto es esencial para la división celular durante el crecimiento y la reparación de los tejidos dañados, mientras que también asegura que cada una de las nuevas células reciba su propia copia del ADN . La célula posee la propiedad distintiva de la división, lo que hace que la replicación del ADN sea esencial.

El ADN está formado por una doble hélice de dos hebras complementarias. La doble hélice describe la apariencia de un ADN de doble cadena que, por lo tanto, se compone de dos cadenas lineales que corren una frente a la otra y se retuercen para formar. Durante la replicación, estas hebras se separan. Cada hebra de la molécula de ADN original sirve luego como molde para la producción de su contraparte, un proceso denominado replicación semiconservadora. Como resultado de la replicación semiconservadora, la nueva hélice estará compuesta por una hebra de ADN original y una hebra recién sintetizada. Los mecanismos celulares de revisión y verificación de errores aseguran una fidelidad casi perfecta para la replicación del ADN.

En una célula, la replicación del ADN comienza en lugares específicos, u orígenes de replicación, en el genoma que contiene el material genético de un organismo. El desenrollado del ADN en el origen y la síntesis de nuevas hebras, acomodadas por una enzima conocida como helicasa, da como resultado horquillas de replicación que crecen bidireccionalmente desde el origen. Varias proteínas están asociadas con la horquilla de replicación para ayudar en el inicio y la continuación de la síntesis de ADN. Lo más destacado es que la ADN polimerasa sintetiza las nuevas hebras al agregar nucleótidos que complementan cada hebra (plantilla). La replicación del ADN ocurre durante la etapa S de la interfase.

La replicación del ADN (amplificación del ADN) también se puede realizar in vitro (artificialmente, fuera de una célula). Las polimerasas de ADN aisladas de células y los cebadores de ADN artificiales se pueden utilizar para iniciar la síntesis de ADN en secuencias conocidas en una molécula de ADN molde. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR) y la amplificación mediada por transcripción (TMA) son ejemplos. En marzo de 2021, los investigadores informaron evidencia que sugiere que una forma preliminar de ARN de transferencia, un componente necesario de la traducción, la síntesis biológica de nuevas proteínas de acuerdo con el código genético, podría haber sido una molécula replicante en el desarrollo muy temprano de la vida. o abiogénesis.

Estructura del ADN

El ADN existe como una estructura de doble cadena, con ambas cadenas enrolladas juntas para formar la doble hélice característica. Cada hebra de ADN es una cadena de cuatro tipos de nucleótidos. Los nucleótidos en el ADN contienen un azúcar desoxirribosa, un fosfato y una nucleobase. Los cuatro tipos de nucleótidos corresponden a las cuatro nucleobases adenina, citosina, guanina y timina, comúnmente abreviadas como A, C, G y T. La adenina y la guanina son bases de purina, mientras que la citosina y la timina son pirimidinas. Estos nucleótidos forman enlaces fosfodiéster, creando el esqueleto de fosfato-desoxirribosa de la doble hélice del ADN con las nucleobases apuntando hacia adentro (es decir, hacia la hebra opuesta). Las nucleobases se emparejan entre hebras a través de enlaces de hidrógeno para formar pares de bases. La adenina se empareja con la timina (dos enlaces de hidrógeno),

Las hebras de ADN tienen una direccionalidad, y los diferentes extremos de una sola hebra se denominan "extremo 3 '(tres primos)" y "extremo 5 '(cinco primos)". Por convención, si se da la secuencia de bases de una sola hebra de ADN, el extremo izquierdo de la secuencia es el extremo 5', mientras que el extremo derecho de la secuencia es el extremo 3'. Las cadenas de la doble hélice son antiparalelas, siendo una de 5 'a 3' y la cadena opuesta de 3 'a 5'. Estos términos se refieren al átomo de carbono en la desoxirribosa al que se une el siguiente fosfato en la cadena. La direccionalidad tiene consecuencias en la síntesis de ADN, porque la ADN polimerasa puede sintetizar ADN en una sola dirección al agregar nucleótidos al extremo 3 'de una cadena de ADN.

El emparejamiento de bases complementarias en el ADN (a través de enlaces de hidrógeno) significa que la información contenida dentro de cada hebra es redundante. Los enlaces fosfodiéster (intra-cadena) son más fuertes que los enlaces de hidrógeno (entre-cadena). El trabajo real de los enlaces fosfodiéster es donde en los polímeros de ADN se conecta el átomo de carbono 5' de un nucleótido con el átomo de carbono 3' de otro nucleótido, mientras que los enlaces de hidrógeno estabilizan las dobles hélices del ADN a lo largo del eje de la hélice pero no en la dirección del eje 1.Esto permite que las hebras se separen unas de otras. Por lo tanto, los nucleótidos de una sola hebra se pueden utilizar para reconstruir nucleótidos de una hebra asociada recién sintetizada.

ADN polimerasa

Las ADN polimerasas son una familia de enzimas que llevan a cabo todas las formas de replicación del ADN. Las polimerasas de ADN en general no pueden iniciar la síntesis de nuevas cadenas, sino que solo pueden extender una cadena de ADN o ARN existente emparejada con una cadena molde. Para comenzar la síntesis, se debe crear un fragmento corto de ARN, llamado cebador, y emparejarlo con la hebra de ADN molde.

La ADN polimerasa agrega una nueva hebra de ADN al extender el extremo 3 'de una cadena de nucleótidos existente, agregando nuevos nucleótidos emparejados con la hebra de plantilla uno a la vez mediante la creación de enlaces fosfodiéster. La energía para este proceso de polimerización del ADN proviene de la hidrólisis de los enlaces fosfato (fosfoanhídrido) de alta energía entre los tres fosfatos unidos a cada base no incorporada. Las bases libres con sus grupos fosfato unidos se denominan nucleótidos; en particular, las bases con tres grupos fosfato unidos se llaman nucleósidos trifosfatos. Cuando se agrega un nucleótido a una hebra de ADN en crecimiento, la formación de un enlace fosfodiéster entre el fosfato proximal del nucleótido y la cadena en crecimiento se acompaña de hidrólisis de un enlace fosfato de alta energía con liberación de los dos grupos fosfato distales como pirofosfato. La hidrólisis enzimática del pirofosfato resultante en fosfato inorgánico consume un segundo enlace de fosfato de alta energía y hace que la reacción sea efectivamente irreversible.

En general, las ADN polimerasas son muy precisas, con una tasa de error intrínseco de menos de un error por cada 10 nucleótidos agregados. Además, algunas ADN polimerasas también tienen capacidad de corrección; pueden eliminar nucleótidos del extremo de una hebra en crecimiento para corregir las bases que no coinciden. Finalmente, los mecanismos de reparación de desajustes posteriores a la replicación monitorean el ADN en busca de errores, siendo capaces de distinguir los desajustes en la cadena de ADN recién sintetizada de la secuencia de la cadena original. Juntos, estos tres pasos de discriminación permiten una fidelidad de replicación de menos de un error por cada 10 nucleótidos agregados.

La tasa de replicación del ADN en una célula viva se midió primero como la tasa de elongación del ADN del fago T4 en E. coli infectada con fago. Durante el período de aumento exponencial del ADN a 37 °C, la tasa fue de 749 nucleótidos por segundo. La tasa de mutación por par de bases por replicación durante la síntesis de ADN del fago T4 es de 1,7 por 10.

Proceso de replicación

La replicación del ADN, como todos los procesos de polimerización biológica, procede en tres pasos coordinados y catalizados enzimáticamente: iniciación, elongación y terminación.

Iniciación

Para que una célula se divida, primero debe replicar su ADN. La replicación del ADN es un proceso de todo o nada; una vez que comienza la replicación, continúa hasta su finalización. Una vez que se completa la replicación, no vuelve a ocurrir en el mismo ciclo celular. Esto es posible gracias a la división de iniciación del complejo de pre-replicación.

Complejo de pre-replicación

En la mitosis tardía y la fase G1 temprana, un gran complejo de proteínas iniciadoras se ensambla en el complejo de pre-replicación en puntos particulares del ADN, conocidos como "orígenes". En E. coli, la proteína iniciadora primaria es DnaA; en la levadura, este es el complejo de reconocimiento de origen. Las secuencias utilizadas por las proteínas iniciadoras tienden a ser "ricas en AT" (ricas en bases de adenina y timina), porque los pares de bases AT tienen dos enlaces de hidrógeno (en lugar de los tres formados en un par CG) y, por lo tanto, son más fáciles de separar. En eucariotas, el complejo de reconocimiento de origen cataliza el ensamblaje de proteínas iniciadoras en el complejo de pre-replicación. Además, un informe reciente sugiere que la levadura ORC en ciernes se dimeriza de manera dependiente del ciclo celular para controlar la licencia.ORC y Noc3p se unen continuamente a la cromatina durante todo el ciclo celular. Luego, Cdc6 y Cdt1 se asocian con el complejo de reconocimiento de origen unido en el origen para formar un complejo más grande necesario para cargar el complejo Mcm en el ADN. El complejo Mcm es la helicasa que desenredará la hélice del ADN en los orígenes de replicación y las horquillas de replicación en eucariotas. El complejo Mcm se recluta en la fase G1 tardía y el complejo ORC-Cdc6-Cdt1 lo carga en el ADN a través de la remodelación de proteínas dependiente de ATP. La carga del complejo Mcm en el ADN de origen marca la finalización de la formación del complejo previo a la replicación.

Si las condiciones ambientales son adecuadas en la fase G1 tardía, se activan los complejos ciclina-Cdk G1 y G1/S, que estimulan la expresión de genes que codifican componentes de la maquinaria sintética del ADN. La activación de G1/S-Cdk también promueve la expresión y activación de los complejos S-Cdk, que pueden desempeñar un papel en la activación de los orígenes de replicación según la especie y el tipo de célula. El control de estas Cdk varía según el tipo de célula y la etapa de desarrollo. Esta regulación se comprende mejor en la levadura en ciernes, donde las ciclinas S Clb5 y Clb6 son las principales responsables de la replicación del ADN. Los complejos Clb5,6-Cdk1 desencadenan directamente la activación de los orígenes de replicación y, por lo tanto, se requieren a lo largo de la fase S para activar directamente cada origen.

De manera similar, también se requiere Cdc7 a través de la fase S para activar los orígenes de replicación. Cdc7 no está activo durante todo el ciclo celular y su activación está estrictamente programada para evitar el inicio prematuro de la replicación del ADN. En G1 tardío, la actividad de Cdc7 aumenta abruptamente como resultado de la asociación con la subunidad reguladora DBF4, que se une directamente a Cdc7 y promueve su actividad de proteína quinasa. Se ha descubierto que Cdc7 es un regulador limitante de la velocidad de la actividad de origen. Juntos, G1/S-Cdks y/o S-Cdks y Cdc7 colaboran para activar directamente los orígenes de replicación, lo que lleva al inicio de la síntesis de ADN.

Complejo de preiniciación

En la fase S temprana, la activación de S-Cdk y Cdc7 conduce al ensamblaje del complejo de preiniciación, un complejo proteico masivo formado en el origen. La formación del complejo de preiniciación desplaza a Cdc6 y Cdt1 del complejo de replicación de origen, lo que inactiva y desarma el complejo de prereplicación. Cargar el complejo de preiniciación en el origen activa la helicasa Mcm, provocando el desenrollado de la hélice del ADN. El complejo de preiniciación también carga α-primasa y otras ADN polimerasas en el ADN.

Después de que la α-primasa sintetiza los primeros cebadores, las uniones cebador-plantilla interactúan con el cargador de abrazaderas, que carga la abrazadera deslizante en el ADN para comenzar la síntesis de ADN. Los componentes del complejo de preiniciación permanecen asociados con horquillas de replicación a medida que se alejan del origen.

Alargamiento

La ADN polimerasa tiene actividad 5′–3′. Todos los sistemas de replicación de ADN conocidos requieren un grupo hidroxilo 3 'libre antes de que se pueda iniciar la síntesis (nota: la plantilla de ADN se lee en la dirección 3' a 5' mientras que una nueva hebra se sintetiza en la dirección 5' a 3'; esto es a menudo confundido). Se reconocen cuatro mecanismos distintos para la síntesis de ADN:

1. Todas las formas de vida celular y muchos virus, fagos y plásmidos de ADN utilizan una primasa para sintetizar un cebador de ARN corto con un grupo 3' OH libre que posteriormente se alarga mediante una ADN polimerasa.
2. Los retroelementos (incluidos los retrovirus) emplean un ARN de transferencia que estimula la replicación del ADN proporcionando un 3' OH libre que la transcriptasa inversa utiliza para la elongación.
3. En los adenovirus y la familia de bacteriófagos φ29, el grupo 3' OH lo proporciona la cadena lateral de un aminoácido de la proteína unida al genoma (la proteína terminal) a la que la ADN polimerasa agrega nucleótidos para formar una nueva hebra.
4. En los virus de ADN monocatenario, un grupo que incluye los circovirus, los geminivirus, los parvovirus y otros, y también en los numerosos fagos y plásmidos que utilizan el mecanismo de replicación del círculo rodante (RCR), la endonucleasa RCR crea una muesca en la hebra del genoma. (virus monocatenarios) o una de las cadenas de ADN (plásmidos). El extremo 5' de la hebra mellada se transfiere a un residuo de tirosina en la nucleasa y la ADN polimerasa utiliza el grupo OH 3' libre para sintetizar la nueva hebra.

El primero es el más conocido de estos mecanismos y es utilizado por los organismos celulares. En este mecanismo, una vez que se separan las dos hebras, la primasa agrega cebadores de ARN a las hebras molde. La hebra principal recibe un cebador de ARN mientras que la hebra rezagada recibe varios. La cadena principal se extiende continuamente desde el cebador mediante una polimerasa de ADN con alta procesividad, mientras que la cadena rezagada se extiende de forma discontinua desde cada cebador formando fragmentos de Okazaki. La RNasa elimina los fragmentos de ARN del cebador y entra una polimerasa de ADN de baja procesividad distinta de la polimerasa replicativa para llenar los huecos. Cuando esto se completa, se puede encontrar una sola muesca en la hebra principal y varias muescas en la hebra rezagada. La ligasa trabaja para llenar estos cortes, completando así la molécula de ADN recién replicada.

La primasa utilizada en este proceso difiere significativamente entre bacterias y arqueas/eucariotas. Las bacterias utilizan una primasa perteneciente a la superfamilia de proteínas DnaG que contiene un dominio catalítico del tipo de pliegue TOPRIM. El pliegue TOPRIM contiene un núcleo α/β con cuatro hebras conservadas en una topología similar a la de Rossmann. Esta estructura también se encuentra en los dominios catalíticos de la topoisomerasa Ia, la topoisomerasa II, las nucleasas de la familia OLD y las proteínas reparadoras del ADN relacionadas con la proteína RecR.

La primasa utilizada por arqueas y eucariotas, por el contrario, contiene una versión altamente derivada del motivo de reconocimiento de ARN (RRM). Esta primasa es estructuralmente similar a muchas ARN polimerasas virales dependientes de ARN, transcriptasas inversas, ciclasas generadoras de nucleótidos cíclicos y ADN polimerasas de las familias A/B/Y que están involucradas en la replicación y reparación del ADN. En la replicación eucariótica, la primasa forma un complejo con Pol α.

Múltiples ADN polimerasas asumen diferentes roles en el proceso de replicación del ADN. En E. coli, DNA Pol III es la enzima polimerasa principalmente responsable de la replicación del ADN. Se ensambla en un complejo de replicación en la bifurcación de replicación que exhibe una procesividad extremadamente alta y permanece intacto durante todo el ciclo de replicación. Por el contrario, DNA Pol I es la enzima responsable de reemplazar los cebadores de ARN con ADN. DNA Pol I tiene una actividad de exonucleasa de 5 'a 3' además de su actividad de polimerasa, y usa su actividad de exonucleasa para degradar los cebadores de ARN que se encuentran delante de él a medida que extiende la hebra de ADN detrás de él, en un proceso llamado traducción de mella. Pol I es mucho menos procesiva que Pol III porque su función principal en la replicación del ADN es crear muchas regiones cortas de ADN en lugar de unas pocas regiones muy largas.

En eucariotas, la enzima de baja procesabilidad, Pol α, ayuda a iniciar la replicación porque forma un complejo con primasa. En eucariotas, se cree que la síntesis de la cadena principal la lleva a cabo Pol ε; sin embargo, esta opinión ha sido cuestionada recientemente, lo que sugiere un papel para Pol δ. La eliminación del cebador se completa con Pol δ mientras que la reparación del ADN durante la replicación se completa con Pol ε.

A medida que continúa la síntesis de ADN, las hebras de ADN originales continúan desenrollándose a cada lado de la burbuja, formando una horquilla de replicación con dos puntas. En las bacterias, que tienen un único origen de replicación en su cromosoma circular, este proceso crea una "estructura theta" (similar a la letra griega theta: θ). Por el contrario, los eucariotas tienen cromosomas lineales más largos e inician la replicación en múltiples orígenes dentro de estos.

Horquilla de replicación

La horquilla de replicación es una estructura que se forma dentro del ADN helicoidal largo durante la replicación del ADN. Es creado por helicasas, que rompen los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos hebras de ADN en la hélice. La estructura resultante tiene dos "puntas" ramificadas, cada una compuesta por una sola hebra de ADN. Estas dos cadenas sirven como plantilla para las cadenas principal y rezagada, que se crearán a medida que la ADN polimerasa haga coincidir los nucleótidos complementarios con las plantillas; las plantillas pueden denominarse correctamente plantilla de la hebra principal y plantilla de la hebra retrasada.

La ADN polimerasa lee el ADN en la dirección 3' a 5', lo que significa que la nueva hebra se sintetiza en la dirección 5' a 3'. Dado que las plantillas de la cadena principal y la retrasada están orientadas en direcciones opuestas en la horquilla de replicación, un problema importante es cómo lograr la síntesis de ADN de la nueva cadena retrasada, cuya dirección de síntesis es opuesta a la dirección de la horquilla de replicación creciente.

Filamento principal

La cadena principal es la cadena de ADN nuevo que se sintetiza en la misma dirección que la horquilla de replicación en crecimiento. Este tipo de replicación del ADN es continua.

Hebra rezagada

La hebra retrasada es la hebra de ADN nuevo cuya dirección de síntesis es opuesta a la dirección de la horquilla de replicación creciente. Debido a su orientación, la replicación de la cadena retrasada es más complicada que la de la cadena principal. Como consecuencia, se ve que la ADN polimerasa en esta hebra se "retrasa" con respecto a la otra hebra.

La hebra rezagada se sintetiza en segmentos cortos y separados. En la plantilla de cadena rezagada, una primasa "lee" la plantilla de ADN e inicia la síntesis de un cebador de ARN complementario corto. Una ADN polimerasa extiende los segmentos cebados, formando fragmentos de Okazaki. Luego, los cebadores de ARN se eliminan y se reemplazan con ADN, y los fragmentos de ADN se unen mediante ADN ligasa.

Dinámica en la horquilla de replicación

En todos los casos, la helicasa se compone de seis polipéptidos que envuelven solo una hebra del ADN que se replica. Las dos polimerasas están unidas al hexómero helicasa. En eucariotas, la helicasa envuelve la hebra principal y en procariotas, envuelve la hebra rezagada.

A medida que la helicasa desenrolla el ADN en la horquilla de replicación, el ADN anterior se ve obligado a rotar. Este proceso da como resultado una acumulación de giros en el ADN por delante. Esta acumulación forma una resistencia a la torsión que eventualmente detendría el progreso de la horquilla de replicación. Las topoisomerasas son enzimas que rompen temporalmente las hebras de ADN, aliviando la tensión provocada por el desenrollado de las dos hebras de la hélice del ADN; las topoisomerasas (incluida la ADN girasa) logran esto agregando superenrollamientos negativos a la hélice del ADN.

El ADN monocatenario desnudo tiende a plegarse sobre sí mismo formando estructuras secundarias; estas estructuras pueden interferir con el movimiento de la ADN polimerasa. Para evitar esto, las proteínas de unión de una sola cadena se unen al ADN hasta que se sintetiza una segunda cadena, lo que evita la formación de estructuras secundarias.

El ADN de doble cadena se enrolla alrededor de las histonas que desempeñan un papel importante en la regulación de la expresión génica, por lo que el ADN replicado debe enrollarse alrededor de las histonas en los mismos lugares que el ADN original. Para garantizar esto, las histonas chaperonas desmontan la cromatina antes de que se replique y reemplazan las histonas en el lugar correcto. Algunos pasos en este reensamblaje son algo especulativos.

Las proteínas de abrazadera forman una abrazadera deslizante alrededor del ADN, lo que ayuda a la ADN polimerasa a mantener el contacto con su plantilla, lo que ayuda a la procesividad. La cara interna de la abrazadera permite que el ADN pase a través de ella. Una vez que la polimerasa llega al final de la plantilla o detecta ADN de doble cadena, la abrazadera deslizante sufre un cambio conformacional que libera la ADN polimerasa. Las proteínas de carga de la abrazadera se utilizan para cargar inicialmente la abrazadera, reconociendo la unión entre la plantilla y los cebadores de ARN.

Proteínas de replicación del ADN

En la horquilla de replicación, muchas enzimas de replicación se ensamblan en el ADN en una máquina molecular compleja llamada replisoma. La siguiente es una lista de las principales enzimas de replicación del ADN que participan en el replisoma:

Enzima	Función en la replicación del ADN
ADN helicasa	También conocida como enzima desestabilizadora de hélice. La helicasa separa las dos hebras de ADN en la horquilla de replicación detrás de la topoisomerasa.
ADN polimerasa	La enzima responsable de catalizar la adición de sustratos de nucleótidos al ADN en la dirección 5' a 3' durante la replicación del ADN. También realiza corrección de errores y corrección de pruebas. Existen muchos tipos diferentes de ADN polimerasa, cada uno de los cuales realiza funciones diferentes en diferentes tipos de células.
abrazadera de ADN	Proteína que evita que las polimerasas de ADN alargadas se disocien de la hebra original de ADN.
Proteína de unión al ADN monocatenario	Se une al ssDNA y evita que la doble hélice del ADN se vuelva a hibridar después de que la ADN helicasa la desenrolla, manteniendo así la separación de las hebras y facilitando la síntesis de la nueva hebra.
topoisomerasa	Relaja el ADN de su naturaleza súper enrollada.
ADN girasa	Alivia la tensión del desenrollado por la ADN helicasa; este es un tipo específico de topoisomerasa
ADN ligasa	Vuelve a recocer las hebras semiconservadoras y une los Fragmentos de Okazaki de la hebra rezagada.
primasa	Proporciona un punto de partida de ARN (o ADN) para que la ADN polimerasa comience la síntesis de la nueva hebra de ADN.
telomerasa	Alarga el ADN telomérico añadiendo secuencias de nucleótidos repetitivas a los extremos de los cromosomas eucariotas. Esto permite que las células germinales y las células madre eviten el límite de Hayflick en la división celular.

Maquinaria de replicación

Las maquinarias de replicación consisten en factores involucrados en la replicación del ADN y que aparecen en los ssDNA de plantilla. Las maquinarias de replicación incluyen primosotores que son enzimas de replicación; polimerasa de ADN, helicasas de ADN, abrazaderas de ADN y topoisomerasas de ADN, y proteínas de replicación; por ejemplo, proteínas de unión a ADN monocatenario (SSB). En las maquinarias de replicación estos componentes se coordinan. En la mayoría de las bacterias, todos los factores involucrados en la replicación del ADN están ubicados en las horquillas de replicación y los complejos permanecen en las horquillas durante la replicación del ADN. Estas maquinarias de replicación se denominan replisomas o sistemas de ADN replicasa. Estos términos son términos genéricos para proteínas ubicadas en horquillas de replicación. En las células eucariotas y algunas bacterianas no se forman los replisomas.

Dado que las maquinarias de replicación no se mueven en relación con las plantillas de ADN, como las fábricas, se denominan fábricas de replicación.En una figura alternativa, las fábricas de ADN son similares a los proyectores y los ADN son como películas cinematográficas que pasan constantemente a los proyectores. En el modelo de fábrica de replicación, después de que tanto las helicasas de ADN para las hebras principales como las hebras rezagadas se cargan en los ADN molde, las helicasas corren a lo largo de los ADN entre sí. Las helicasas permanecen asociadas durante el resto del proceso de replicación. Peter Meister et al. observó directamente los sitios de replicación en la levadura en ciernes mediante el control de las polimerasas de ADN α marcadas con proteína fluorescente verde (GFP). Detectaron la replicación del ADN de pares de loci etiquetados separados simétricamente desde un origen de replicación y encontraron que la distancia entre los pares disminuyó notablemente con el tiempo.Este hallazgo sugiere que el mecanismo de replicación del ADN va con las fábricas de ADN. Es decir, se cargan pares de fábricas de replicación en los orígenes de replicación y las fábricas asociadas entre sí. Además, las plantillas de ADN se trasladan a las fábricas, que traen la extrusión de la plantilla de ssDNA y nuevos ADN. El hallazgo de Meister es la primera evidencia directa del modelo de fábrica de replicación. Investigaciones posteriores han demostrado que las helicasas de ADN forman dímeros en muchas células eucariotas y que las maquinarias de replicación bacteriana permanecen en una sola ubicación intranuclear durante la síntesis de ADN.

Las fábricas de replicación realizan el desenredo de las cromátidas hermanas. El desenredo es esencial para distribuir las cromátidas en las células hijas después de la replicación del ADN. Debido a que las cromátidas hermanas después de la replicación del ADN se unen entre sí mediante anillos de cohesina, existe la única posibilidad de que se desenreden en la replicación del ADN. La fijación de maquinarias de replicación como fábricas de replicación puede mejorar la tasa de éxito de la replicación del ADN. Si las horquillas de replicación se mueven libremente en los cromosomas, la concatenación de los núcleos se agrava e impide la segregación mitótica.

Terminación

Los eucariotas inician la replicación del ADN en múltiples puntos del cromosoma, por lo que las horquillas de replicación se encuentran y terminan en muchos puntos del cromosoma. Debido a que los eucariotas tienen cromosomas lineales, la replicación del ADN no puede llegar al final de los cromosomas. Debido a este problema, el ADN se pierde en cada ciclo de replicación desde el final del cromosoma. Los telómeros son regiones de ADN repetitivo cerca de los extremos y ayudan a prevenir la pérdida de genes debido a este acortamiento. El acortamiento de los telómeros es un proceso normal en las células somáticas. Esto acorta los telómeros del cromosoma de ADN hijo. Como resultado, las células solo pueden dividirse un cierto número de veces antes de que la pérdida de ADN impida una mayor división. (Esto se conoce como el límite de Hayflick). Dentro de la línea de células germinales, que pasa el ADN a la siguiente generación, la telomerasa extiende las secuencias repetitivas de la región de los telómeros para evitar la degradación. La telomerasa puede volverse activa por error en las células somáticas, lo que a veces conduce a la formación de cáncer. El aumento de la actividad de la telomerasa es una de las características del cáncer.

La terminación requiere que el progreso de la horquilla de replicación del ADN se detenga o se bloquee. La terminación en un lugar específico, cuando ocurre, implica la interacción entre dos componentes: (1) una secuencia del sitio de terminación en el ADN y (2) una proteína que se une a esta secuencia para detener físicamente la replicación del ADN. En varias especies bacterianas, esto se denomina proteína de unión al sitio terminal de replicación del ADN, o proteína Ter.

Debido a que las bacterias tienen cromosomas circulares, la terminación de la replicación ocurre cuando las dos horquillas de replicación se encuentran en el extremo opuesto del cromosoma original. E. coli regula este proceso mediante el uso de secuencias de terminación que, cuando se unen a la proteína Tus, permiten que pase solo una dirección de la horquilla de replicación. Como resultado, las horquillas de replicación están obligadas a encontrarse siempre dentro de la región de terminación del cromosoma.

Regulación

Eucariotas

Dentro de los eucariotas, la replicación del ADN se controla dentro del contexto del ciclo celular. A medida que la célula crece y se divide, avanza a través de etapas en el ciclo celular; La replicación del ADN tiene lugar durante la fase S (fase de síntesis). El progreso de la célula eucariota a través del ciclo está controlado por puntos de control del ciclo celular. La progresión a través de los puntos de control se controla a través de interacciones complejas entre varias proteínas, incluidas las ciclinas y las quinasas dependientes de ciclina. A diferencia de las bacterias, el ADN eucariótico se replica en los confines del núcleo.

El punto de control G1/S (o punto de control de restricción) regula si las células eucariotas entran en el proceso de replicación del ADN y posterior división. Las células que no pasan por este punto de control permanecen en la etapa G0 y no replican su ADN.

Después de pasar por el punto de control G1/S, el ADN debe replicarse solo una vez en cada ciclo celular. Cuando el complejo Mcm se aleja del origen, el complejo de pre-replicación se desmantela. Debido a que un nuevo complejo Mcm no puede cargarse en un origen hasta que se reactivan las subunidades previas a la replicación, un origen de replicación no puede usarse dos veces en el mismo ciclo celular.

La activación de S-Cdks en la fase S temprana promueve la destrucción o inhibición de los componentes complejos previos a la replicación individuales, evitando el reensamblaje inmediato. S y M-Cdks continúan bloqueando el ensamblaje complejo previo a la replicación incluso después de que se completa la fase S, lo que garantiza que el ensamblaje no pueda volver a ocurrir hasta que toda la actividad de Cdk se reduzca en la mitosis tardía.

En la levadura en ciernes, la inhibición del ensamblaje es causada por la fosforilación dependiente de Cdk de los componentes del complejo previo a la replicación. Al comienzo de la fase S, la fosforilación de Cdc6 por Cdk1 provoca la unión de Cdc6 a la proteína ligasa de ubiquitina SCF, lo que provoca la destrucción proteolítica de Cdc6. La fosforilación de proteínas Mcm dependiente de Cdk promueve su exportación fuera del núcleo junto con Cdt1 durante la fase S, evitando la carga de nuevos complejos Mcm en los orígenes durante un solo ciclo celular. La fosforilación de Cdk del complejo de replicación de origen también inhibe el ensamblaje del complejo previo a la replicación. La presencia individual de cualquiera de estos tres mecanismos es suficiente para inhibir el ensamblaje del complejo previo a la replicación. Sin embargo, las mutaciones de las tres proteínas en la misma célula desencadenan el reinicio en muchos orígenes de replicación dentro de un ciclo celular.

En las células animales, la proteína geminina es un inhibidor clave del ensamblaje del complejo previo a la replicación. Geminin se une a Cdt1, evitando su unión al complejo de reconocimiento de origen. En G1, los niveles de geminina se mantienen bajos gracias a la APC, que ubiquitina la geminina para apuntarla a la degradación. Cuando se destruye geminina, se libera Cdt1, lo que le permite funcionar en un ensamblaje complejo previo a la replicación. Al final de G1, la APC se inactiva, lo que permite que la geminina se acumule y se una a Cdt1.

La replicación de los genomas mitocondriales y del cloroplasto ocurre independientemente del ciclo celular, a través del proceso de replicación del bucle D.

Enfoque de replicación

En las células de vertebrados, los sitios de replicación se concentran en posiciones llamadas focos de replicación. Los sitios de replicación pueden detectarse mediante la inmunotinción de las hebras hijas y las enzimas de replicación y el control de los factores de replicación marcados con GFP. Mediante estos métodos se encuentra que aparecen focos de replicación de tamaños y posiciones variables en la fase S de la división celular y su número por núcleo es mucho menor que el número de horquillas de replicación genómica.

P. Heun et al. , (2001) rastrearon focos de replicación etiquetados con GFP en células de levadura en ciernes y revelaron que los orígenes de replicación se mueven constantemente en la fase G1 y S y la dinámica disminuyó significativamente en la fase S. Tradicionalmente, los sitios de replicación se fijaban en la estructura espacial de los cromosomas mediante matriz nuclear o láminas. Los resultados de Heun negaron los conceptos tradicionales, las levaduras en ciernes no tienen láminas y apoyan que los orígenes de replicación se autoensamblan y forman focos de replicación.

Mediante el disparo de orígenes de replicación, controlados espacial y temporalmente, se regula la formación de focos de replicación. DA Jackson et al. (1998) revelaron que los orígenes vecinos se disparan simultáneamente en células de mamíferos. La yuxtaposición espacial de los sitios de replicación genera la agrupación de horquillas de replicación. El agrupamiento rescata las bifurcaciones de replicación estancadasy favorece el progreso normal de las horquillas de replicación. El progreso de las horquillas de replicación se ve inhibido por muchos factores; colisión con proteínas o con complejos que se unen fuertemente al ADN, deficiencia de dNTP, mellas en el ADN molde, etc. Si las bifurcaciones de replicación se bloquean y las secuencias restantes de las bifurcaciones bloqueadas no se replican, las hebras hijas tienen sitios no replicados obtenidos con muescas. Los sitios no replicados en la hebra de uno de los padres mantienen unida la otra hebra, pero no las hebras hijas. Por lo tanto, las cromátidas hermanas resultantes no pueden separarse entre sí y no pueden dividirse en 2 células hijas. Cuando los orígenes vecinos se disparan y una bifurcación de un origen se detiene, la bifurcación de otro origen accede en una dirección opuesta a la bifurcación detenida y duplica los sitios no replicados. Como otro mecanismo del rescate existe la aplicación deorígenes de replicación latentes que el exceso de orígenes no desencadenan en la replicación normal del ADN.

Bacterias

La mayoría de las bacterias no pasan por un ciclo celular bien definido, sino que copian continuamente su ADN; durante el crecimiento rápido, esto puede resultar en la ocurrencia simultánea de múltiples rondas de replicación. En E. coli, la bacteria mejor caracterizada, la replicación del ADN se regula a través de varios mecanismos, que incluyen: la hemimetilación y el secuestro de la secuencia de origen, la proporción de trifosfato de adenosina (ATP) a difosfato de adenosina (ADP) y los niveles de proteína ADNA. Todos estos controlan la unión de las proteínas iniciadoras a las secuencias de origen.

Debido a que E. coli metila las secuencias de ADN GATC, la síntesis de ADN da como resultado secuencias hemimetiladas. Este ADN hemimetilado es reconocido por la proteína SeqA, que se une y secuestra la secuencia de origen; además, DnaA (requerido para el inicio de la replicación) se une menos al ADN hemimetilado. Como resultado, se evita que los orígenes recién replicados inicien inmediatamente otra ronda de replicación del ADN.

El ATP se acumula cuando la célula está en un medio rico, lo que desencadena la replicación del ADN una vez que la célula ha alcanzado un tamaño específico. ATP compite con ADP para unirse a DnaA, y el complejo DnaA-ATP puede iniciar la replicación. También se requiere una cierta cantidad de proteínas DnaA para la replicación del ADN: cada vez que se copia el origen, la cantidad de sitios de unión para DnaA se duplica, lo que requiere la síntesis de más DnaA para permitir otro inicio de la replicación.

En las bacterias de crecimiento rápido, como E. coli, la replicación cromosómica lleva más tiempo que la división de la célula. Las bacterias resuelven esto iniciando una nueva ronda de replicación antes de que finalice la anterior. La nueva ronda de replicación formará el cromosoma de la célula que nace dos generaciones después de la célula en división. Este mecanismo crea ciclos de replicación superpuestos.

Problemas con la replicación del ADN

Hay muchos eventos que contribuyen al estrés de replicación, que incluyen:

• Incorporación errónea de ribonucleótidos
• Estructuras de ADN inusuales
• Conflictos entre replicación y transcripción
• Insuficiencia de factores esenciales de replicación
• Sitios frágiles comunes
• Sobreexpresión o activación constitutiva de oncogenes
• Inaccesibilidad a la cromatina

Reacción en cadena de la polimerasa

Los investigadores suelen replicar el ADN in vitro mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR utiliza un par de cebadores para abarcar una región objetivo en la plantilla de ADN y luego polimeriza las hebras asociadas en cada dirección a partir de estos cebadores usando una polimerasa de ADN termoestable. La repetición de este proceso a través de múltiples ciclos amplifica la región de ADN objetivo. Al comienzo de cada ciclo, la mezcla de plantilla y cebadores se calienta, separando la molécula y la plantilla recién sintetizadas. Luego, a medida que la mezcla se enfría, ambos se convierten en plantillas para la hibridación de nuevos cebadores y la polimerasa se extiende a partir de ellos. Como resultado, el número de copias de la región de destino se duplica en cada ronda, aumentando exponencialmente.