Puromicina

Puromicina es un antibiótico inhibidor de la síntesis de proteínas que provoca la terminación prematura de la cadena durante la traducción.

Inhibición de la traducción

La puromicina es un antibiótico aminonucleósido, derivado de la bacteria Streptomyces alboniger, que provoca la terminación prematura de la cadena durante la traducción que tiene lugar en el ribosoma. Parte de la molécula se parece al 3' extremo del ARNt aminoacilado. Entra en el sitio A y se transfiere a la cadena en crecimiento, provocando la formación de una cadena naciente puromicilada y la liberación prematura de la cadena. El mecanismo de acción exacto se desconoce por el momento, pero el 3' La posición contiene un enlace amida en lugar del enlace éster normal del ARNt. Eso hace que la molécula sea mucho más resistente a la hidrólisis y detiene el ribosoma.

La puromicina es selectiva tanto para procariotas como para eucariotas.

También es de destacar que la puromicina es fundamental en la visualización del ARNm. En esta reacción, se une químicamente una molécula de puromicina al extremo de una plantilla de ARNm, que luego se traduce en proteína. Luego, la puromicina puede formar un enlace covalente a la cadena peptídica en crecimiento, lo que permite que el ARNm se una físicamente a su producto de traducción.

Los anticuerpos que reconocen cadenas nacientes puromiciladas también se pueden utilizar para purificar polipéptidos recién sintetizados y para visualizar la distribución de ribosomas que se traducen activamente mediante inmunofluorescencia.

Inhibidor de peptidasa

La puromicina es un inhibidor reversible de la dipeptidil-peptidasa II (serina peptidasa) y de la alanil aminopeptidasa del citosol (metalopeptidasa). El mecanismo de inhibición no se comprende bien; sin embargo, la puromicina se puede utilizar para distinguir entre la aminopeptidasa M (activa) y la alanil aminopeptidasa del citosol (inhibida por la puromicina).

Cultivo celular

La puromicina se utiliza en biología celular como agente selectivo en sistemas de cultivo celular. Es tóxico para las células procarióticas y eucariotas. La resistencia a la puromicina la confiere el gen pac que codifica una puromicina N-acetil-transferasa (PAC) que se encontró en una cepa productora de Streptomyces. La puromicina es soluble en agua (50 mg/ml) como solución incolora a 10 mg/ml. La puromicina es estable durante un año como solución cuando se almacena a -20 °C. La dosis recomendada como agente de selección en cultivos celulares está dentro del rango de 1-10 μg/ml, aunque puede ser tóxico para las células eucariotas en concentraciones tan bajas como 1 μg/ml. La puromicina actúa rápidamente y puede matar hasta el 99% de las células no resistentes en 2 días.

Selección de Escherichia coli

La puromicina tiene poca actividad sobre E. coli. Los transformantes resistentes a la puromicina se seleccionan en medio agar LB suplementado con 125 µg/ml de puromicina. Pero el uso de puromicina para E. coli requiere un ajuste preciso del pH y también depende de la cepa seleccionada. Para una selección sin complicaciones y resultados óptimos, es posible el uso de puromicina especialmente modificada. Las placas que contienen puromicina son estables durante 1 mes si se almacenan a 4 °C.

Selección de levadura

La resistencia a la puromicina en levaduras también se puede conferir mediante la expresión del gen de la puromicina N-acetil-transferasa (pac). Las concentraciones letales de puromicina son mucho más altas en las cepas de Saccharomyces cerevisiae que en las líneas celulares de mamíferos. La eliminación del gen que codifica la bomba de eflujo de múltiples fármacos Pdr5 sensibiliza las células a la puromicina.

Pérdida de memoria en ratones

La plasticidad sináptica a largo plazo, como la que se requiere para los procesos de memoria, requiere cambios morfológicos a nivel de proteínas. Como la puromicina inhibe la síntesis de proteínas en las células eucariotas, los investigadores pudieron demostrar que las inyecciones de este fármaco provocarán una pérdida de memoria tanto a corto como a largo plazo en ratones.