Prueba de Ames

Procedimiento de prueba de ames

La prueba de Ames es un método ampliamente utilizado que utiliza bacterias para probar si una sustancia química determinada puede causar mutaciones en el ADN del organismo de prueba. Más formalmente, es un ensayo biológico para evaluar el potencial mutagénico de los compuestos químicos. Una prueba positiva indica que la sustancia química es mutagénica y, por lo tanto, puede actuar como carcinógeno, porque el cáncer a menudo está relacionado con la mutación. La prueba sirve como un ensayo rápido y conveniente para estimar el potencial carcinogénico de un compuesto porque los ensayos carcinógenos estándar en ratones y ratas requieren mucho tiempo (de dos a tres años en completarse) y son costosos. Sin embargo, se conocen falsos positivos y falsos negativos.

El procedimiento fue descrito en una serie de artículos a principios de la década de 1970 por Bruce Ames y su grupo en la Universidad de California, Berkeley.

Procedimiento general

La prueba de Ames utiliza varias cepas de la bacteria Salmonella typhimurium que portan mutaciones en genes implicados en la síntesis de histidina. Estas cepas son mutantes auxotróficas, es decir, requieren histidina para crecer, pero no pueden producirla. El método prueba la capacidad de la sustancia probada para crear mutaciones que resultan en un retorno a un estado "prototrófico" estado, para que las células puedan crecer en un medio libre de histidina.

Las cepas de prueba están especialmente diseñadas para detectar mutaciones de cambio de marco (por ejemplo, cepas TA-1537 y TA-1538) o puntuales (por ejemplo, cepa TA-1531) en los genes necesarios para sintetizar histidina, de modo que los mutágenos que actúan a través de diferentes mecanismos puedan ser identificado. Algunos compuestos son bastante específicos y causan reversiones en solo una o dos cepas. Las cepas de prueba también portan mutaciones en los genes responsables de la síntesis de lipopolisacáridos, lo que hace que la pared celular de la bacteria sea más permeable, y en el sistema de reparación por escisión para que la prueba sea más sensible.

Los organismos más grandes, como los mamíferos, tienen procesos metabólicos que podrían convertir una sustancia química considerada no mutagénica en una que lo sea o una que se considere mutagénica en una que no lo sea. Por lo tanto, para probar de manera más efectiva la mutagenicidad de un compuesto químico en relación con organismos más grandes, se pueden agregar enzimas de hígado de rata en un intento de replicar los procesos metabólicos. efecto sobre el compuesto que se está probando en la prueba de Ames. El extracto de hígado de rata se agrega opcionalmente para simular el efecto del metabolismo, ya que algunos compuestos, como el benzo[a]pireno, no son mutagénicos, pero sus productos metabólicos sí lo son.

Las bacterias se esparcen en una placa de agar con una pequeña cantidad de histidina. Esta pequeña cantidad de histidina en el medio de cultivo permite que la bacteria crezca durante un tiempo inicial y tenga la oportunidad de mutar. Cuando se agota la histidina, solo sobrevivirán las bacterias que han mutado para obtener la capacidad de producir su propia histidina. La placa se incuba durante 48 horas. La mutagenicidad de una sustancia es proporcional al número de colonias observadas.

Test de Ames y carcinógenos

Los mutágenos identificados mediante la prueba de Ames también son posibles carcinógenos, y los primeros estudios realizados por Ames demostraron que el 90 % de los carcinógenos conocidos pueden identificarse mediante esta prueba. Sin embargo, estudios posteriores mostraron la identificación del 50% al 70% de los carcinógenos conocidos. La prueba se utilizó para identificar una serie de compuestos utilizados anteriormente en productos comerciales como carcinógenos potenciales. Los ejemplos incluyen fosfato de tris(2,3-dibromopropilo), que se usó como retardante de llama en plásticos y textiles, como ropa de dormir para niños, y furilfuramida, que se usó como aditivo antibacteriano en alimentos en Japón en las décadas de 1960 y 1970.. De hecho, la furilfuramida había superado previamente pruebas con animales, pero pruebas más vigorosas después de su identificación en la prueba de Ames demostraron que era cancerígena. Sus pruebas positivas dieron como resultado que esos químicos fueran retirados del uso en productos de consumo.

Un resultado interesante de la prueba de Ames es que la curva de respuesta a la dosis que utiliza concentraciones variables de la sustancia química es casi siempre lineal, lo que indica que no existe una concentración umbral para la mutagénesis. Por lo tanto, sugiere que, al igual que con la radiación, puede que no haya un umbral seguro para los mutágenos o carcinógenos químicos. Sin embargo, algunos han propuesto que los organismos podrían tolerar niveles bajos de mutágenos debido a mecanismos de protección como la reparación del ADN y, por lo tanto, puede existir un umbral para ciertos mutágenos químicos. El propio Bruce Ames argumentó en contra de la extrapolación lineal de dosis-respuesta de la dosis alta utilizada en las pruebas de carcinogénesis en sistemas animales a la dosis más baja de sustancias químicas que normalmente se encuentran en la exposición humana, ya que los resultados pueden ser falsos positivos debido a la respuesta mitogénica provocada por la dosis artificialmente alta. de productos químicos utilizados en dichas pruebas. También advirtió contra la "histeria sobre pequeños rastros de sustancias químicas que pueden o no causar cáncer", que "excluye por completo los principales riesgos de los que debe estar consciente".

La prueba de Ames se usa a menudo como una de las pruebas iniciales de posibles fármacos para descartar posibles carcinógenos, y es una de las ocho pruebas exigidas por la Ley de Pesticidas (EE. UU.) y una de las seis exigidas por la Toxic Ley de Control de Sustancias (EE.UU.).

Limitaciones

Salmonella typhimurium es una procariota, por lo que no es un modelo perfecto para humanos. La fracción S9 de hígado de rata se usa para imitar las condiciones metabólicas de los mamíferos, de modo que se pueda evaluar el potencial mutagénico de los metabolitos formados por una molécula original en el sistema hepático; sin embargo, existen diferencias en el metabolismo entre humanos y ratas que pueden afectar la mutagenicidad de los químicos que se están probando. Por lo tanto, la prueba puede mejorarse mediante el uso de la fracción S9 de hígado humano; anteriormente su uso estaba limitado por su disponibilidad, pero ahora está disponible comercialmente y, por lo tanto, puede ser más factible. Se ha realizado un modelo in vitro adaptado para células eucariotas, por ejemplo levaduras.

Los mutágenos identificados en la prueba de Ames no necesariamente tienen que ser cancerígenos, y se requieren más pruebas para cualquier carcinógeno potencial identificado en la prueba. Los medicamentos que contienen la fracción nitrato a veces dan positivo para Ames cuando en realidad son seguros. Los compuestos de nitrato pueden generar óxido nítrico, una molécula de señal importante que puede dar un falso positivo. La nitroglicerina es un ejemplo que da un Ames positivo, pero todavía se usa en el tratamiento en la actualidad. Sin embargo, los nitratos en los alimentos pueden reducirse por acción bacteriana a nitritos que se sabe que generan carcinógenos al reaccionar con aminas y amidas. Se necesitan estudios prolongados de toxicología y resultados con tales compuestos para refutar una prueba de Ames positiva.

Método de fluctuación

Método de fluctuación: placa 96-well

Método de fluctuación: 384-well plate

La prueba de Ames se desarrolló inicialmente utilizando placas de agar (la técnica de incorporación de placas), como se describe anteriormente. Desde ese momento, se ha desarrollado una alternativa a la realización de la prueba de Ames, que se conoce como el "método de la fluctuación". Esta técnica tiene el mismo concepto que el método basado en agar, ya que se agregan bacterias a una mezcla de reacción con una pequeña cantidad de histidina, lo que permite que las bacterias crezcan y muten, volviendo a sintetizar su propia histidina. Al incluir un indicador de pH, la frecuencia de mutación se cuenta en microplacas como el número de pozos que han cambiado de color (causado por una caída en el pH debido a procesos metabólicos de reproducción de bacterias). Al igual que con la prueba de Ames tradicional, la muestra se compara con la tasa de fondo natural de mutación inversa para establecer la genotoxicidad de una sustancia. El método de fluctuación se realiza completamente en cultivo líquido y se puntúa contando el número de pocillos que se vuelven amarillos de púrpura en microplacas de 96 o 384 pocillos.

En el método de placa de 96 pocillos, la frecuencia de mutación se cuenta como el número de pocillos de 96 que han cambiado de color. Las placas se incuban durante un máximo de cinco días, y las colonias mutadas (amarillas) se cuentan cada día y se comparan con la tasa de fondo de mutación inversa utilizando tablas de importancia establecidas para determinar las diferencias significativas entre la tasa de mutación de fondo y la de las células analizadas. muestras

En el método de microfluctuación de placa de 384 pocillos más reducido, la frecuencia de mutación se cuenta como el número de pocillos de 48 que han cambiado de color después de 2 días de incubación. Una muestra de prueba se analiza en 6 niveles de dosis con una dosis cero simultánea (fondo) y controles positivos que caben en una placa de 384 pocillos. El ensayo se realiza por triplicado para proporcionar robustez estadística. Utiliza las cepas de prueba recomendadas por la directriz 471 de la OCDE (auxótrofos de histidina y auxótrofos de triptófano).

El método de fluctuación es comparable al método tradicional de placa de vertido en términos de sensibilidad y precisión, sin embargo, tiene una serie de ventajas: necesita menos muestra de prueba, tiene un punto final colorimétrico simple, contando la cantidad de pocillos positivos de 96 o 48 pocillos posibles requiere mucho menos tiempo que contar colonias individuales en una placa de agar. Hay varios kits comerciales disponibles. La mayoría de los kits tienen componentes consumibles listos para usar, incluidas bacterias liofilizadas, y las pruebas se pueden realizar con pipetas multicanal. El método de fluctuación también permite probar volúmenes más altos de muestras acuosas (hasta un 75 % v/v), aumentando la sensibilidad y extendiendo su aplicación a mutágenos ambientales de bajo nivel.