Precipitación de sulfato de amonio

Precipitación de sulfato de amonio es uno de los métodos más utilizados para la purificación y el fraccionamiento de proteínas a gran escala de laboratorio que puede usarse para separar las proteínas alterando su solubilidad en presencia de una alta concentración de sal.

Propiedades

El sulfato de amonio es una sal inorgánica con una alta solubilidad que se disocia en amonio ( nh ^+
₄ ) y sulfate (<< span class = "Chemf Nowrap"> So ^2-
₄ ) en soluciones acuosas. El sulfato de amonio es especialmente útil como precipitante porque es altamente soluble, estabiliza la estructura de proteínas, tiene una densidad relativamente baja, está fácilmente disponible y es relativamente económica.

mecanismo

sulfato de amonio, así como otras sales neutras, estabilizarán las proteínas por solvatación preferencial. Las proteínas generalmente se almacenan en sulfato de amonio porque inhibe el crecimiento bacteriano. Con la adición de sulfato de amonio, las proteínas desplegadas por desnaturalizantes pueden ser empujadas a sus conformaciones nativas. Esto se puede ver con el plegamiento de proteínas recombinantes.

La solubilidad de las proteínas varía según la resistencia iónica de la solución, por lo tanto, según la concentración de sal. A bajas concentraciones de iones (menos de 0.5 mol/L), la solubilidad de las proteínas aumenta al aumentar la concentración de sal, un efecto denominado " saling en ". A medida que aumenta aún más la concentración de sal, la solubilidad de la proteína comienza a disminuir. Con una resistencia iónica suficientemente alta, la proteína precipitará de la solución, un efecto denominado " saliendo ". Cuando el amonio ( nh ^+
₄ ) y sulfate ( so ^2-
₄ ) Los iones están dentro de la solución acuosa, se sienten atraídos por las cargas opuestas evidentes en el compuesto que se está purificando. Esta atracción de cargas opuestas evita que las moléculas de agua interactúen con el compuesto purificado, lo que lleva a la precipitación o "salando ".

Las proteínas difieren notablemente en sus solubilidades a alta resistencia iónica, por lo tanto, " saling " es un procedimiento muy útil para ayudar en la purificación de la proteína deseada. El sulfato de amonio se usa comúnmente para la precipitación debido a su alta solubilidad, además, forma dos iones altos en la serie Hofmeister. Debido a que estos dos iones están al final de la serie Hofmeister, el sulfato de amonio también puede estabilizar una estructura de proteínas. El comportamiento de solubilidad de sulfato de amonio para una proteína generalmente se expresa en función del porcentaje de saturación. Se puede determinar una curva de solubilidad trazando el registro de la solubilidad determinada experimentalmente, expresada como mg/ml, versus el porcentaje de saturación del sulfato de amonio.

Con el mecanismo de saltar, hay una omisión de la sal de la capa de agua, que está estrechamente asociada con la superficie de la proteína, conocida como la capa de hidratación. La capa de hidratación juega un papel vital en el mantenimiento de la solubilidad y la conformación natural adecuada. Hay tres interacciones principales de proteína-agua: hidratación de iones entre cadenas laterales cargadas, enlace de hidrógeno entre grupos polares y agua, e hidratación hidrófoba. Una vez que se agrega la sal a la mezcla, hay un aumento en la tensión superficial del agua, lo que aumenta las interacciones hidrofóbicas entre el agua y la proteína de interés. La proteína de interés luego reduce su área superficial, lo que disminuye su contacto con el solvente. Esto se muestra mediante el plegamiento y la autoasociación, lo que finalmente conduce a la precipitación. El plegado y la autoasociación de la proteína empujan el agua libre, lo que lleva a un aumento de la entropía y hace que este proceso sea enérgicamente favorable.

procedimiento

Típicamente, la concentración de sulfato de amonio aumenta paso a paso, y la proteína precipitada se recupera en cada etapa. Esto generalmente se hace agregando sulfato de amonio sólido; Sin embargo, calcular la cantidad de sulfato de amonio que debe agregarse para agregar a una solución para lograr la concentración deseada puede ser difícil porque la adición de sulfato de amonio aumenta significativamente el volumen de la solución. La cantidad de sulfato de amonio que debe agregarse a la solución se puede determinar a partir de nomogramas publicados o utilizando una calculadora en línea. La adición directa de sulfato de amonio sólido cambia el pH de la solución, lo que puede conducir a la pérdida de actividad enzimática. En esos casos, la adición de sulfato de amonio saturado en un tampón adecuado se usa como alternativa para agregar sulfato de amonio sólido. En cualquier enfoque, el precipitado de proteína resultante se puede disolver individualmente en un tampón estándar y analizarse para determinar el contenido total de proteínas.

La concentración de sulfato de amonio agregada debe incrementarse a un valor que precipitará la mayor parte de la proteína de interés mientras deja la cantidad máxima de contaminantes de proteínas aún en la solución. La proteína precipitada de interés se puede recuperar posteriormente mediante centrifugación y disolverse en tampón estándar para preparar la muestra para la siguiente etapa de purificación.

En la siguiente etapa de purificación, toda esta sal agregada debe eliminarse de la proteína. Una forma de hacerlo es usar diálisis, pero la diálisis diluye aún más la proteína concentrada. La mejor manera de eliminar el sulfato de amonio de la proteína es mezclar la proteína precipitada en un tampón que contiene una mezcla de SDS, Tris-HCl y fenol y centrifugando la mezcla. El precipitado que sale de esta centrifugación contendrá proteína concentrada sin sal.

aplicaciones

La precipitación de sulfato de amonio es una técnica útil como paso inicial en la purificación de proteínas porque permite una precipitación rápida y masiva de proteínas celulares. También se emplea a menudo durante las últimas etapas de purificación para concentrar la proteína de la solución diluida siguiendo procedimientos como la filtración en gel. El inconveniente de este método es que a menudo las diferentes sustancias pueden precipitar junto con la proteína, y se deben realizar otras técnicas de purificación, como la cromatografía iónica o la cromatografía de exclusión por tamaño.