Ingeniería metabólica

Ingeniería metabólica es la práctica de optimizar los procesos genéticos y regulatorios dentro de las células para aumentar la producción celular de una determinada sustancia. Estos procesos son redes químicas que utilizan una serie de reacciones bioquímicas y enzimas que permiten a las células convertir materias primas en moléculas necesarias para la supervivencia de la célula. La ingeniería metabólica busca específicamente modelar matemáticamente estas redes, calcular el rendimiento de productos útiles y señalar partes de la red que limitan la producción de estos productos. Luego se pueden utilizar técnicas de ingeniería genética para modificar la red y aliviar estas limitaciones. Una vez más, esta red modificada se puede modelar para calcular el rendimiento del nuevo producto.

El objetivo final de la ingeniería metabólica es poder utilizar estos organismos para producir sustancias valiosas a escala industrial de manera rentable. Los ejemplos actuales incluyen la producción de cerveza, vino, queso, productos farmacéuticos y otros productos biotecnológicos. Algunas de las estrategias comunes utilizadas para la ingeniería metabólica son (1) sobreexpresar el gen que codifica la enzima limitante de la velocidad de la vía biosintética, (2) bloquear las vías metabólicas competitivas, (3) expresión de genes heterólogos y (4) ingeniería enzimática.

Dado que las células utilizan estas redes metabólicas para sobrevivir, los cambios pueden tener efectos drásticos en la estructura de las células. viabilidad. Por lo tanto, surgen compensaciones en la ingeniería metabólica entre la capacidad de las células para producir la sustancia deseada y sus necesidades naturales de supervivencia. Por lo tanto, en lugar de eliminar y/o sobreexpresar directamente los genes que codifican las enzimas metabólicas, el objetivo actual es apuntar a las redes reguladoras de una célula para diseñar de manera eficiente el metabolismo.

Historia y aplicaciones

En el pasado, para aumentar la productividad de un metabolito deseado, se modificaba genéticamente un microorganismo mediante una mutación inducida químicamente y luego se elegía la cepa mutante que sobreexpresaba el metabolito deseado. Sin embargo, uno de los principales problemas de esta técnica fue que no se analizó la ruta metabólica para la producción de ese metabolito y, como resultado, se desconocían las limitaciones de la producción y las enzimas relevantes de la ruta que debían modificarse.

En la década de 1990, surgió una nueva técnica llamada ingeniería metabólica. Esta técnica analiza la ruta metabólica de un microorganismo y determina las limitaciones y sus efectos en la producción de los compuestos deseados. Luego utiliza la ingeniería genética para aliviar estas limitaciones. Algunos ejemplos de ingeniería metabólica exitosa son los siguientes: (i) Identificación de limitaciones a la producción de lisina en Corynebacterium glutamicum e inserción de nuevos genes para aliviar estas limitaciones y mejorar la producción (ii ) Ingeniería de una nueva vía de biosíntesis de ácidos grasos, llamada vía de beta oxidación inversa, que es más eficiente que la vía nativa en la producción de ácidos grasos y alcoholes que potencialmente pueden convertirse catalíticamente en productos químicos y combustibles (iii) Producción mejorada de DAHP, un metabolito aromático. producido por E. coli que es un intermediario en la producción de aminoácidos aromáticos. Se determinó mediante análisis de flujo metabólico que el rendimiento máximo teórico de DAHP por molécula de glucosa utilizada fue 3/7. Esto se debe a que parte del carbono de la glucosa se pierde como dióxido de carbono, en lugar de utilizarse para producir DAHP. Además, uno de los metabolitos (PEP o fosfoenolpiruvato) que se utilizan para producir DAHP se estaba convirtiendo en piruvato (PYR) para transportar glucosa al interior de la célula y, por lo tanto, ya no estaba disponible para producir DAHP. Para aliviar la escasez de PEP y aumentar el rendimiento, Patnaik et al. utilizó ingeniería genética en E. coli para introducir una reacción que convierta PYR nuevamente en PEP. Por tanto, la PEP utilizada para transportar glucosa al interior de la célula se regenera y puede utilizarse para producir DAHP. Esto resultó en un nuevo rendimiento máximo teórico de 6/7, el doble que el E nativo. coli sistema.

A escala industrial, la ingeniería metabólica se está volviendo más conveniente y rentable. Según la Organización de la Industria de Biotecnología, "se están construyendo más de 50 instalaciones de biorrefinería en América del Norte para aplicar ingeniería metabólica para producir biocombustibles y productos químicos a partir de biomasa renovable que pueden ayudar a reducir las emisiones de gases de efecto invernadero". Los biocombustibles potenciales incluyen alcoholes y alcanos de cadena corta (para reemplazar la gasolina), ésteres metílicos de ácidos grasos y alcoholes grasos (para reemplazar el diesel) y biocombustibles a base de ácidos grasos e isoprenoides (para reemplazar el diesel).

La ingeniería metabólica continúa evolucionando en eficiencia y procesos con la ayuda de avances en el campo de la biología sintética y avances en la comprensión del daño de los metabolitos y su reparación o prevención. Los primeros experimentos de ingeniería metabólica demostraron que la acumulación de intermediarios reactivos puede limitar el flujo en las vías diseñadas y ser perjudicial para las células huésped si faltan o son inadecuados los sistemas de control de daños correspondientes. Los investigadores en biología sintética optimizan las vías genéticas, que a su vez influyen en los resultados metabólicos celulares. Las recientes disminuciones en el costo del ADN sintetizado y los avances en los circuitos genéticos ayudan a influir en la capacidad de la ingeniería metabólica para producir los resultados deseados.

Análisis del flujo metabólico

Puede encontrar un análisis del flujo metabólico en Análisis del equilibrio de flujo

Configuración de una vía metabólica para el análisis

El primer paso del proceso es identificar el objetivo deseado a alcanzar mediante la mejora o modificación del metabolismo de un organismo. Se utilizan libros de referencia y bases de datos en línea para investigar reacciones y vías metabólicas que pueden producir este producto o resultado. Estas bases de datos contienen abundante información genómica y química, incluidas vías de metabolismo y otros procesos celulares. Utilizando esta investigación, se elige un organismo que se utilizará para crear el producto o resultado deseado. Las consideraciones que se tienen en cuenta al tomar esta decisión son qué tan cerca está la vía metabólica del organismo de la vía deseada, los costos de mantenimiento asociados con el organismo y qué tan fácil es modificar la vía del organismo. Escherichia coli (E. coli) se usa ampliamente en ingeniería metabólica para sintetizar una amplia variedad de productos como aminoácidos porque es relativamente fácil de mantener y modificar. Si el organismo no contiene la ruta completa para el producto o resultado deseado, entonces se deben incorporar al organismo los genes que producen las enzimas faltantes.

Analizando una ruta metabólica

La ruta metabólica completa se modela matemáticamente para encontrar el rendimiento teórico del producto o los flujos de reacción en la célula. Un flujo es la velocidad a la que se produce una reacción determinada en la red. El análisis simple de la vía metabólica se puede realizar a mano, pero la mayoría requiere el uso de software para realizar los cálculos. Estos programas utilizan complejos algoritmos de álgebra lineal para resolver estos modelos. Para resolver una red usando la ecuación para sistemas determinados que se muestra a continuación, se debe ingresar la información necesaria sobre las reacciones relevantes y sus flujos. La información sobre la reacción (como los reactivos y la estequiometría) está contenida en las matrices G_x y G_m. Las matrices V_m y V_x contienen los flujos de las reacciones relevantes. Cuando se resuelve, la ecuación produce los valores de todos los flujos desconocidos (contenidos en V_x).

Vx=− − ()Gx)− − 1Alternativa Alternativa ()GmAlternativa Alternativa Vm){displaystyle V_{x}=-(G_{x})^{-1}* (G_{m}*V_{m})}

Determinación de las manipulaciones genéticas óptimas

Después de resolver los flujos de reacciones en la red, es necesario determinar qué reacciones pueden alterarse para maximizar el rendimiento del producto deseado. Para determinar qué manipulaciones genéticas específicas realizar, es necesario utilizar algoritmos computacionales, como OptGene u OptFlux. Proporcionan recomendaciones sobre qué genes deben sobreexpresarse, eliminarse o introducirse en una célula para permitir una mayor producción del producto deseado. Por ejemplo, si una reacción determinada tiene un flujo particularmente bajo y limita la cantidad de producto, el software puede recomendar que la enzima que cataliza esta reacción se sobreexprese en la célula para aumentar el flujo de la reacción. Las manipulaciones genéticas necesarias se pueden realizar utilizando técnicas estándar de biología molecular. Los genes pueden sobreexpresarse o eliminarse de un organismo, dependiendo de su efecto en la vía y el objetivo final.

Medidas experimentales

Para crear un modelo con solución, a menudo es necesario tener ciertos flujos ya conocidos o medidos experimentalmente. Además, para verificar el efecto de las manipulaciones genéticas en la red metabólica (para garantizar que se alineen con el modelo), es necesario medir experimentalmente los flujos en la red. Para medir los flujos de reacción, las mediciones del flujo de carbono se realizan mediante marcaje isotópico de carbono 13. El organismo se alimenta con una mezcla que contiene moléculas en las que carbonos específicos están diseñados para ser átomos de carbono 13, en lugar de carbono 12. Después de que estas moléculas se utilizan en la red, los metabolitos posteriores también se marcan con carbono-13, a medida que incorporan esos átomos en sus estructuras. El patrón de etiquetado específico de los distintos metabolitos está determinado por los flujos de reacción en la red. Los patrones de etiquetado se pueden medir utilizando técnicas como la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) junto con algoritmos computacionales para determinar los flujos de reacción.