Hapteno

Haptenos (derivados del griego haptein, que significa "sujetar") son moléculas pequeñas que provocan una respuesta inmune sólo cuando se unen a un portador grande, como una proteína.; el portador puede ser uno que tampoco provoque una respuesta inmune por sí solo. Los mecanismos de ausencia de respuesta inmune pueden variar e involucrar interacciones inmunológicas complejas, pero pueden incluir señales coestimuladoras ausentes o insuficientes de las células presentadoras de antígenos.

Los haptenos se han utilizado para estudiar la dermatitis alérgica de contacto (ACD) y los mecanismos de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) para inducir respuestas de tipo autoinmune.

El concepto de haptenos surgió del trabajo del inmunólogo austriaco Karl Landsteiner, quien también fue pionero en el uso de haptenos sintéticos para estudiar fenómenos inmunoquímicos.

Reacción inmune sobre un aducto de portador de hapteno

Los haptenos aplicados sobre la piel, cuando se conjugan con un portador, podrían inducir hipersensibilidad de contacto, que es una reacción de hipersensibilidad retardada de tipo IV mediada por células T y células dendríticas. Consta de dos fases: sensibilización y elicitación. La fase de sensibilización en la que el hapteno se aplica a la piel por primera vez se caracteriza por la activación de respuestas inmunes innatas, incluida la migración de células dendríticas a los ganglios linfáticos, el cebado de células T vírgenes específicas de antígeno y la generación de células T vírgenes específicas de antígeno. células T efectoras o de memoria y células B y células plasmáticas secretoras de anticuerpos. La segunda fase de provocación, en la que el hapteno se aplica a un área diferente de la piel, comienza con la activación de las células T efectoras seguida de daño tisular mediado por células T y respuestas inmunes mediadas por anticuerpos. Los haptenos activan inicialmente las respuestas inmunes innatas mediante mecanismos complejos que involucran citoquinas inflamatorias, patrones moleculares asociados al daño (DAMP) o el inflamasoma.

Una vez que el cuerpo ha generado anticuerpos contra un aducto portador de hapteno, la molécula pequeña de hapteno también puede unirse al anticuerpo, pero generalmente no iniciará una respuesta inmune; normalmente sólo el aducto del portador de hapteno puede hacer esto. A veces, el hapteno de molécula pequeña puede incluso bloquear la respuesta inmune al aducto del portador del hapteno al evitar que el aducto se una al anticuerpo, un proceso llamado inhibición del hapteno.

Un ejemplo bien conocido de hapteno es el urushiol, que es la toxina que se encuentra en la hiedra venenosa. Cuando se absorbe a través de la piel de una planta de hiedra venenosa, el urushiol sufre oxidación en las células de la piel para generar el hapteno real, una molécula reactiva de tipo quinona, que luego reacciona con las proteínas de la piel para formar aductos de hapteno. Después de una segunda exposición, las células T proliferadas se activan, generando una reacción inmune que produce ampollas típicas de una dermatitis de contacto inducida por urushiol.

Otro ejemplo de dermatitis de contacto mediada por hapteno es la alergia al níquel, que es causada por iones metálicos de níquel que penetran en la piel y se unen a las proteínas de la piel.

Ejemplos de haptenos

Muchos haptenos se encuentran en diferentes tipos de medicamentos, pesticidas, hormonas, toxinas alimentarias, etc. El factor más importante es la masa molecular, que es <1000 Da.

Los primeros haptenos investigados fueron la anilina y sus derivados carboxílicos (ácido o-, m- y p-aminobenzoico).

Algunos haptenos pueden inducir enfermedades autoinmunes. Un ejemplo es la hidralazina, un fármaco para reducir la presión arterial que ocasionalmente puede producir lupus eritematoso inducido por fármacos en ciertos individuos. Este también parece ser el mecanismo por el cual el gas anestésico halotano puede causar una hepatitis potencialmente mortal, así como el mecanismo por el cual los fármacos del tipo de la penicilina causan anemia hemolítica autoinmune.

Otros haptenos que se utilizan comúnmente en aplicaciones de biología molecular incluyen fluoresceína, biotina, digoxigenina y dinitrofenol.

Se han generado con éxito anticuerpos contra bacterias endógenas y bacterianas. moléculas pequeñas no reactivas como algunos neurotransmisores (por ejemplo, serotonina (5HT), glutamato, dopamina, GABA, triptamina, glicina, noradrenalina), aminoácidos (por ejemplo, triptófano, 5-hidroxitriptófano, 5-metoxitriptófano), mediante el uso de glutaraldehído para reticular estas moléculas a Proteínas transportadoras adecuadas para el reconocimiento inmunológico. En particular, la detección de moléculas tan pequeñas en tejidos requiere que el tejido esté fijado con glutaraldehído, ya que el enlace covalente de glutaraldehído en la molécula de interés a menudo forma una porción del epítopo reconocido del anticuerpo.

Conjugación de hapteno

Por su naturaleza y propiedades, los aductos portadores de hapteno han sido esenciales en inmunología. Se han utilizado para evaluar las propiedades de epítopos y anticuerpos específicos. Son importantes en la purificación y producción de anticuerpos monoclonales. También son vitales en el desarrollo de inmunoensayos cuantitativos y cualitativos sensibles. Sin embargo, para lograr los mejores y más deseables resultados, es necesario tener en cuenta muchos factores en el diseño de conjugados de hapteno. Estos incluyen el método de conjugación de hapteno, el tipo de portador utilizado y la densidad de hapteno. Las variaciones en estos factores podrían conducir a diferentes intensidades de la respuesta inmune hacia el determinante antigénico recién formado.

Transportistas

En general, las proteínas transportadoras deben ser inmunogénicas y contener suficientes residuos de aminoácidos en las cadenas laterales reactivas para conjugarse con los haptenos. Para que se produzca la haptenación de proteínas, el hapteno debe tener deficiencia de electrones (electrófilo), ya sea por sí solo, o puede convertirse en una especie reactiva a las proteínas, por ejemplo, mediante oxidación del aire o metabolismo cutáneo. Los haptenos se unen a una molécula portadora mediante un enlace covalente. Dependiendo de los haptenos que se utilicen, otros factores al considerar las proteínas transportadoras podrían incluir su toxicidad in vivo, disponibilidad comercial y costo.

Los portadores más comunes incluyen globulina sérica, albúmina, ovoalbúmina y muchos otros. La albúmina sérica humana (HSA) suele ser la proteína modelo de elección para los ensayos de unión a proteínas. Se trata de una proteína bien caracterizada, y la función de la albúmina en la sangre y los tejidos in vivo suele ser unirse a los xenobióticos a través de sus bolsas de unión al sustrato y eliminar la sustancia química invasora de la circulación o el tejido, para así eliminar la sustancia química invasora de la circulación o del tejido. actuando como mecanismo de desintoxicación.

Aunque las proteínas se emplean principalmente para la conjugación de hapteno, también se podrían utilizar polipéptidos sintéticos como el ácido poli-L-glutámico, polisacáridos y liposomas.

Mecanismos de unión a proteínas

Los mecanismos de reacción más comunes que forman enlaces covalentes y que se prevé que estén involucrados en la sensibilización son la sustitución nucleofílica en un centro saturado, la sustitución nucleofílica en un centro insaturado y la adición nucleofílica. También son posibles otras reacciones, como la sustitución electrófila (sales de diazonio), reacciones radicalarias y reacciones iónicas.

Métodos de conjugación de hapteno

Al seleccionar un método adecuado para la conjugación de hapteno, se deben identificar los grupos funcionales del hapteno y su portador. Dependiendo de los grupos presentes, se podría emplear una de las dos estrategias principales:

1. Reacción química espontánea: Se usa cuando el apten es una molécula reactiva química como anhídridos e isocyanatos. Este método de conjugación es espontáneo y no se necesitan agentes cruzados.
2. Intermediary moléculas cross-linkage: Este método se aplica principalmente a los heptens no reactivos. Los agentes con al menos dos grupos químicamente reactivas como carbodiimido o glutaraldehído son para ayudar a la conjugación de heptens a sus portadores. El alcance de la conexión cruzada depende de la proporción hapten/carrier al agente de acoplamiento, la concentración hapten/carrier y la temperatura, pH del medio ambiente.
   • Carbodiimide: Un grupo de compuestos con una fórmula general de R-N=C=N-R, donde R y R " son aliphatic (es decir, diethylcarbodiimide) o aromático (es decir, diphenylcarbodiimide). La conjugación usando un carbodiimido requiere la presencia de α o χ2 y un grupo de carboxilo. El grupo amino suele provenir del residuo de lisilo de la proteína portadora mientras que el grupo de carboxilo proviene del hapten. El mecanismo exacto para esta reacción sigue siendo desconocido. Sin embargo, se proponen dos vías. Se forman los primeros postulados que un intermediario que puede reaccionar con una amina. El segundo indicando que se ha producido una reorganización de una urea acyl, el principal producto lateral de la reacción a alta temperatura.
   • Glutaraldehído: Este método funciona por la reacción entre glutaraldehyde con grupos de amina para formar bases Schiff o productos de doble unión tipo Michael. El rendimiento de los conjugados puede ser controlado por variar el pH de la reacción. El pH más alto daría lugar a más intermediarios de base Schiff y posteriormente conduciría al aumento del número y tamaño de los conjugados hapten. En general, el enlace cruzado con glutaraldehyde es muy estable. Sin embargo, los animales inmunizados tienden a reconocer los puentes cruzados de glutaraldehyde como epitopes.
3. Electroforesis capilar de alto rendimiento: La electroforesis capilar de alto rendimiento (HPCE) es un método alternativo para optimizar la conjugación hapten-proteína. HPCE se utiliza predominantemente en la separación de carbohidratos con una capacidad de separación muy alta. Existen numerosas ventajas para utilizar HPCE como técnica para investigar ciertos conjugados, como sólo requerir tamaños de muestras de minuto (nl). Además, la muestra utilizada no necesita ser pura y no se necesita ningún tipo de radioetiqueta. Un gran beneficio para este método de conjugación hapten es que hay análisis automatizado de la muestra y la prueba de interacciones de la muestra se puede determinar en solución libre. Este método de conjugación hapten-proteína es excepcionalmente eficaz con conjugados de densidades bajas de epitopo, donde es de otra manera muy difícil por el uso de otros métodos para determinar su movilidad eléctrica o iónica.

Uso clínico

Inhibición de hapteno

Inhibición de hapteno o "semi-hapteno" es la inhibición de una respuesta de hipersensibilidad tipo III. En la inhibición, las moléculas de hapteno libres se unen a anticuerpos contra esa molécula sin causar la respuesta inmune, dejando menos anticuerpos para unirse al aducto inmunogénico de proteína hapteno. Un ejemplo de inhibidor de hapteno es el dextrano 1, que es una pequeña fracción (1 kilodalton) de todo el complejo de dextrano, que es suficiente para unirse a los anticuerpos anti-dextrano, pero insuficiente para dar lugar a la formación de complejos inmunes y respuestas inmunes resultantes.

Investigación

Los haptenos se utilizan ampliamente en inmunología y campos relacionados. Los productos químicos sensibilizantes pueden provocar diferentes formas de alergia, dermatitis alérgica de contacto o sensibilización del tracto respiratorio. Curiosamente, tipos discretos de sustancias químicas inducen respuestas inmunes divergentes: los alérgenos de contacto provocan respuestas de hipersensibilidad preferenciales de tipo I, mientras que los alérgenos respiratorios estimulan respuestas selectivas de tipo II, lo que podría ser muy adecuado para modelar cómo la respuesta inmune se polariza hacia diferentes tipos de antígenos.

En alergología, las pruebas in vitro/in silico para la sensibilización de la piel, la identificación de peligros y la evaluación de la potencia de diferentes componentes farmacológicos y cosméticos son muy preferidas en el desarrollo inicial de productos. La capacidad de un fármaco para actuar como un hapteno es una indicación clara de su potencial inmunogenicidad.

Los anticuerpos específicos de hapteno se utilizan en una amplia área de diferentes inmunoensayos, tecnologías de inmunobiosensores y columnas de purificación de cromatografía de inmunoafinidad; esos anticuerpos podrían usarse para detectar pequeños contaminantes ambientales, drogas de abuso, vitaminas, hormonas, metabolitos, toxinas alimentarias y contaminantes ambientales.