Glucógeno fosforilasa

La glucógeno fosforilasa es una de las enzimas fosforilasas (EC 2.4.1.1). La glucógeno fosforilasa cataliza el paso limitante de la velocidad en la glucogenólisis en animales al liberar glucosa-1-fosfato del enlace alfa-1,4-glucosídico terminal. La glucógeno fosforilasa también se estudia como una proteína modelo regulada tanto por fosforilación reversible como por efectos alostéricos.

Mecanismo

La glucógeno fosforilasa descompone el glucógeno en subunidades de glucosa (consulte también la figura siguiente):

(cadena de glucógeno α-1,4)_n + Pi ⇌ (cadena de glucógeno α-1,4)_n-1 + α-D-glucosa-1 -fosfato.

El glucógeno queda con una molécula de glucosa menos y la molécula de glucosa libre está en forma de glucosa-1-fosfato. Para poder utilizarlo en el metabolismo, la enzima fosfoglucomutasa debe convertirlo en glucosa-6-fosfato.

Aunque la reacción es reversible in vitro, dentro de la célula la enzima solo funciona en dirección directa, como se muestra a continuación, porque la concentración de fosfato inorgánico es mucho mayor que la de glucosa-1-fosfato.

La glucógeno fosforilasa puede actuar sólo sobre cadenas lineales de glucógeno (enlace glicosídico α1-4). Su trabajo se detendrá inmediatamente a cuatro residuos de la rama α1-6 (que son extremadamente comunes en el glucógeno). En estas situaciones es necesaria la enzima desramificante, que enderezará la cadena en esa zona. Además, la enzima transferasa desplaza un bloque de 3 residuos de glucosilo desde la rama externa al otro extremo, y luego se requiere una enzima glucosidasa α1-6 para romper el residuo α1-6 restante (glucosa única) que permanece en la nueva línea lineal. cadena. Una vez hecho todo esto, la glucógeno fosforilasa puede continuar. La enzima es específica de las cadenas α1-4, ya que la molécula contiene una grieta de 30 angstrom de largo con el mismo radio que la hélice formada por la cadena de glucógeno; esto tiene capacidad para 4-5 residuos de glucosilo, pero es demasiado estrecho para las ramas. Esta grieta conecta el sitio de almacenamiento de glucógeno con el sitio catalítico activo.

La glucógeno fosforilasa tiene un fosfato de piridoxal (PLP, derivado de la vitamina B6) en cada sitio catalítico. El piridoxal fosfato se une con residuos básicos (en este caso Lys680) y forma covalentemente una base de Schiff. Una vez que se forma el enlace de base de Schiff, que mantiene la molécula de PLP en el sitio activo, el grupo fosfato del PLP dona fácilmente un protón a una molécula de fosfato inorgánico, lo que permite que el fosfato inorgánico a su vez sea desprotonado por el oxígeno que forma el α-1. ,4 enlace glicosídico. El PLP se desprotona fácilmente porque su carga negativa no sólo está estabilizada dentro del grupo fosfato, sino también en el anillo de piridina, por lo que la base conjugada resultante de la desprotonación del PLP es bastante estable. El oxígeno protonado ahora representa un buen grupo saliente y la cadena de glucógeno se separa del glucógeno terminal en forma SN1, lo que da como resultado la formación de una molécula de glucosa con un carbocatión secundario en la posición 1. Finalmente, el fosfato inorgánico desprotonado actúa como nucleófilo y se une al carbocatión, lo que da como resultado la formación de glucosa-1-fosfato y una cadena de glucógeno acortada en una molécula de glucosa.

También existe un mecanismo alternativo propuesto que involucra un oxígeno cargado positivamente en una conformación de media silla.

Estructura

El monómero de glucógeno fosforilasa es una proteína de gran tamaño, compuesta por 842 aminoácidos con una masa de 97.434 kDa en las células musculares. Si bien la enzima puede existir como un monómero o tetrámero inactivo, es biológicamente activa como un dímero de dos subunidades idénticas.

En los mamíferos, las principales isoenzimas de la glucógeno fosforilasa se encuentran en los músculos, el hígado y el cerebro. El tipo de cerebro es predominante en el cerebro adulto y en los tejidos embrionarios, mientras que los tipos de hígado y músculo son predominantes en el hígado y el músculo esquelético de adultos, respectivamente.

El dímero de glucógeno fosforilasa tiene muchas regiones de importancia biológica, incluidos sitios catalíticos, sitios de unión de glucógeno, sitios alostéricos y un residuo de serina fosforilado reversible. Primero, los sitios catalíticos están relativamente enterrados, a 15 Å de la superficie de la proteína y de la interfaz de la subunidad. Esta falta de fácil acceso del sitio catalítico a la superficie es significativa porque hace que la actividad proteica sea altamente susceptible a la regulación, ya que pequeños efectos alostéricos podrían aumentar en gran medida el acceso relativo de glucógeno al sitio.

Quizás el sitio regulador más importante sea Ser14, el sitio de fosforilación reversible muy cerca de la interfaz de la subunidad. El cambio estructural asociado con la fosforilación y con la conversión de fosforilasa b en fosforilasa a, es la disposición de los residuos originalmente desordenados 10 a 22 en hélices α. Este cambio aumenta la actividad de la fosforilasa hasta un 25% incluso en ausencia de AMP y mejora aún más la activación de AMP.

El sitio alostérico de unión de AMP en las isoformas musculares de la glucógeno fosforilasa está cerca de la interfaz de la subunidad, al igual que Ser14. La unión de AMP en este sitio, correspondiente a un cambio del estado T de la enzima al estado R, produce pequeños cambios en la estructura terciaria en la interfaz de la subunidad que conducen a grandes cambios en la estructura cuaternaria. La unión de AMP hace girar las hélices de la torre (residuos 262-278) de las dos subunidades 50˚ entre sí a través de una mayor organización e interacciones entre subunidades. Esta rotación de las hélices de la torre conduce a una rotación de las dos subunidades de 10˚ entre sí y, lo que es más importante, altera los residuos 282-286 (el bucle 280) que bloquean el acceso al sitio catalítico en el estado T pero no lo hacen en el estado R.

El último sitio, quizás el más curioso, de la proteína glucógeno fosforilasa es el llamado sitio de almacenamiento de glucógeno. Los residuos 397-437 forman esta estructura, que permite que la proteína se una covalentemente a la cadena de glucógeno a 30 Å completos del sitio catalítico. Este sitio es probablemente el sitio en el que la enzima se une a los gránulos de glucógeno antes de iniciar la escisión de las moléculas terminales de glucosa. De hecho, el 70% de la fosforilasa dimérica en la célula existe unida a gránulos de glucógeno en lugar de flotar libremente.

Importancia clínica

La inhibición de la glucógeno fosforilasa se ha propuesto como un método para tratar la diabetes tipo 2. Dado que se ha demostrado que la producción de glucosa en el hígado aumenta en pacientes con diabetes tipo 2, inhibir la liberación de glucosa de los suministros de glucógeno del hígado parece ser un enfoque válido. La clonación de la glucógeno fosforilasa del hígado humano (HLGP) reveló un nuevo sitio de unión alostérico cerca de la interfaz de la subunidad que no está presente en la glucógeno fosforilasa del músculo de conejo (RMGP) que normalmente se usa en los estudios. Este sitio no era sensible a los mismos inhibidores que los del sitio alostérico AMP, y el mayor éxito se ha tenido en la síntesis de nuevos inhibidores que imitan la estructura de la glucosa, ya que la glucosa-6-fosfato es un inhibidor conocido de HLGP y estabiliza los menos activos. Estado T. Estos derivados de glucosa han tenido cierto éxito en la inhibición de HLGP, con valores de Ki previstos tan bajos como 0,016 mM.

Las mutaciones en la isoforma muscular de la glucógeno fosforilasa (PYGM) están asociadas con la enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo V (GSD V, enfermedad de McArdle). Hasta la fecha se han identificado más de 65 mutaciones en el gen PYGM que conducen a la enfermedad de McArdle. Los síntomas de la enfermedad de McArdle incluyen debilidad muscular, mialgia y falta de resistencia, todos derivados de niveles bajos de glucosa en el tejido muscular.

Las mutaciones en la isoforma hepática de la glucógeno fosforilasa (PYGL) están asociadas con la enfermedad de Hers'. Enfermedad (enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo VI). El de ella La enfermedad a menudo se asocia con síntomas leves que normalmente se limitan a hipoglucemia y, a veces, es difícil de diagnosticar debido a la actividad enzimática residual.

La isoforma cerebral de la glucógeno fosforilasa (PYGB) se ha propuesto como biomarcador del cáncer gástrico.

Reglamento

La glucógeno fosforilasa se regula mediante control alostérico y mediante fosforilación. La fosforilasa a y la fosforilasa b existen cada una en dos formas: un estado T (tenso) inactivo y un estado R (relajado). La fosforilasa b normalmente se encuentra en estado T, inactiva debido a la presencia fisiológica de ATP y Glucosa 6 fosfato, y la fosforilasa a normalmente se encuentra en estado R (activa). En el hígado existe una isoenzima de la glucógeno fosforilasa sensible a la concentración de glucosa, ya que el hígado actúa como exportador de glucosa. En esencia, la fosforilasa hepática responde a la glucosa, lo que provoca una transición muy sensible de la forma R a la T, inactivándola; además, la fosforilasa hepática es insensible al AMP.

Hormonas como la epinefrina, la insulina y el glucagón regulan la glucógeno fosforilasa utilizando sistemas de amplificación de segundos mensajeros vinculados a proteínas G. El glucagón activa la adenilato ciclasa a través de un receptor acoplado a proteína G (GPCR) acoplado a Gs que a su vez activa la adenilato ciclasa para aumentar las concentraciones intracelulares de AMPc. El AMPc se une y activa la proteína quinasa A (PKA). La PKA fosforila la fosforilasa quinasa, que a su vez fosforila la glucógeno fosforilasa b en Ser14, convirtiéndola en la glucógeno fosforilasa a activa.

En el hígado, el glucagón también activa otro GPCR que desencadena una cascada diferente, lo que resulta en la activación de la fosfolipasa C (PLC). PLC provoca indirectamente la liberación de calcio de los hepatocitos' retículo endoplásmico hacia el citosol. La mayor disponibilidad de calcio se une a la subunidad de calmodulina y activa la glucógeno fosforilasa quinasa. La glucógeno fosforilasa quinasa activa la glucógeno fosforilasa de la misma manera mencionada anteriormente.

La glucógeno fosforilasa b no siempre está inactiva en el músculo, ya que puede ser activada alostéricamente por el AMP. Un aumento en la concentración de AMP, que ocurre durante el ejercicio extenuante, indica la demanda de energía. AMP activa la glucógeno fosforilasa b cambiando su conformación de una forma tensa a una relajada. Esta forma relajada tiene propiedades enzimáticas similares a las de la enzima fosforilada. Un aumento en la concentración de ATP se opone a esta activación desplazando al AMP del sitio de unión de nucleótidos, lo que indica suficientes reservas de energía.

Al ingerir una comida, se libera insulina, lo que indica la disponibilidad de glucosa en la sangre. La insulina activa indirectamente la proteína fosfatasa 1 (PP1) y la fosfodiesterasa a través de una cascada de transducción de señales. PP1 desfosforila la glucógeno fosforilasa a, reformando la glucógeno fosforilasa b inactiva. La fosfodiesterasa convierte el AMPc en AMP. Juntos, disminuyen la concentración de AMPc e inhiben la PKA. Como resultado, la PKA ya no puede iniciar la cascada de fosforilación que finaliza con la formación de glucógeno fosforilasa a (activa). En general, la señalización de la insulina disminuye la glucogenólisis para preservar las reservas de glucógeno en la célula y desencadena la glucogénesis.

Importancia histórica

La glucógeno fosforilasa fue la primera enzima alostérica descubierta. Fue aislado y su actividad caracterizada en detalle por Carl F. Cori, Gerhard Schmidt y Gerty T. Cory. Arda Green y Gerty Cori lo cristalizaron por primera vez en 1943 e ilustraron que la glucógeno fosforilasa existía en las formas aob dependiendo de su estado de fosforilación, así como en los estados R o T según la presencia de AMP.