Faloidina

faloidina pertenece a una clase de toxinas llamadas falotoxinas, que se encuentran en el hongo de la muerte (Amanita phalloides). Se trata de un heptapéptido bicíclico rígido que resulta letal al cabo de unos días cuando se inyecta en el torrente sanguíneo. El síntoma principal de la intoxicación por faloidina es el hambre aguda debido a la destrucción de las células del hígado. Funciona uniendo y estabilizando la actina filamentosa (actina F) y previene eficazmente la despolimerización de las fibras de actina. Debido a su unión estrecha y selectiva a la actina F, los derivados de faloidina que contienen etiquetas fluorescentes se utilizan ampliamente en microscopía para visualizar la actina F en la investigación biomédica.

Descubrimiento y antecedentes

La faloidina fue uno de los primeros péptidos cíclicos descubiertos. Fue aislado del hongo de la muerte y cristalizado por Feodor Lynen y Ulrich Wieland en 1937. Su estructura es inusual porque contiene un enlace cisteína-triptófano para formar un heptapéptido bicíclico. Este vínculo no se había caracterizado antes y dificulta significativamente la elucidación de la estructura de la faloidina. Determinaron la presencia del átomo de azufre mediante espectroscopía UV y descubrieron que esta estructura de anillo tenía una longitud de onda ligeramente desplazada. Los experimentos con níquel de Raney confirmaron la presencia de azufre en el anillo de triptófano. Los investigadores descubrieron que la faloidina desulfurada todavía era circular, lo que demostró que la estructura de la faloidina es normalmente bicíclica. Una vez linealizada, la secuencia de aminoácidos de la faloidina desulfurada fue aclarada mediante la degradación de Edman por Wieland y Schön en 1955.

Debido a su alta afinidad por la actina, los científicos descubrieron su uso potencial como reactivo de tinción para la visualización eficaz de la actina en microscopía. Los derivados conjugados con fluoróforos se venden ampliamente. Debido a su capacidad para unirse selectivamente a actina filamentosa (actina F) y no a monómeros de actina (actina G), la faloidina marcada con fluorescencia es más eficaz que los anticuerpos contra la actina.

Síntesis

Biosíntesis

La faloidina es un heptapéptido bicíclico que contiene un enlace inusual cisteína-triptófano. El gen que codifica la síntesis de faloidina es parte de la familia MSDIN en el hongo Death Cap y codifica un propéptido de 34 aminoácidos. Un residuo de prolina flanquea la región de siete residuos que luego se convertirá en faloidina. Después de la traducción, el péptido debe escindirse proteolíticamente, ciclarse, hidroxilarse, entrecruzarse con Trp-Cys para formar triptationina y epimerizarse para formar un D-Thr. El orden y el mecanismo bioquímico exacto de estos pasos aún no se comprenden completamente. La creencia actual es que los genes biosintéticos necesarios están agrupados cerca de los genes MSDIN.

La primera modificación postraduccional del 34-mer es la escisión proteolítica mediante una prolil oligopeptidasa (POP) para eliminar el "líder" péptido. Luego, el POP cicla el heptapéptido Ala-Trp-Leu-Ala-Thr-Cys-Pro mediante transpeptidación entre el aminoácido 1 (Ala) y el aminoácido 7 (Pro). Se cree que a continuación se produce la formación de triptationina a través del entrecruzamiento de Trp-Cys.

Síntesis química

Dado que la faloidina se aprovecha por su capacidad para unirse y estabilizar los polímeros de actina, pero las células no pueden absorberla fácilmente, los científicos han descubierto que los derivados de faloidina son más útiles en la investigación. Esencialmente, sigue la síntesis típica de péptidos pequeños, utilizando hidroxil-prolina. La principal dificultad en la síntesis es la formación del enlace triptationina (entrecruzamiento cisteína-triptófano).

A continuación se muestra el mecanismo sintético general llevado a cabo por Anderson et al. en 2005 para la síntesis en fase sólida de ala⁷-faloidina, que difiere en el residuo 7 de la faloidina como se indica a continuación. THPP significa conector de tetrahidropiranilo poliestireno, que se utiliza para conectar la molécula con el soporte sólido durante la síntesis. Tenga en cuenta que la siguiente síntesis es simplemente un esquema general para mostrar el orden de formación de enlaces para conectar los materiales de partida. La Ala⁷-faloidina, así como muchas otras variantes similares de faloidina, son útiles para aumentar la absorción celular en relación con la faloidina y para unir un fluoróforo para ayudar en la visualización de la actina F en microscopía.

La primera síntesis total de faloidina se logró mediante una combinación de síntesis en fase sólida y en fase solución (Baosheng Liu y Jianheng Zhang, patente de Estados Unidos, US 8,569,452 B2). Las propiedades físicas y químicas de la faloidina sintética son las mismas que las de la faloidina natural.

Mecanismo de acción

La faloidina se une a la actina F, evitando su despolimerización y envenenando la célula. La faloidina se une específicamente a la interfaz entre las subunidades de actina F, uniendo las subunidades adyacentes. La faloidina, un heptapéptido bicíclico, se une a los filamentos de actina mucho más estrechamente que a los monómeros de actina, lo que lleva a una disminución en la constante de velocidad para la disociación de las subunidades de actina de los extremos de los filamentos, lo que esencialmente estabiliza los filamentos de actina mediante la prevención de la despolimerización de los filamentos. Además, se ha descubierto que la faloidina inhibe la actividad de hidrólisis de ATP de la actina F. Por lo tanto, la faloidina atrapa los monómeros de actina en una conformación distinta de la actina G y estabiliza la estructura de la actina F al reducir en gran medida la constante de velocidad de disociación de los monómeros, un evento asociado con la captura de ADP. En general, se encuentra que la faloidina reacciona estequiométricamente con la actina, promueve fuertemente la polimerización de actina y estabiliza los polímeros de actina.

La faloidina funciona de manera diferente en distintas concentraciones en las células. Cuando se introduce en el citoplasma en bajas concentraciones, la faloidina recluta las formas menos polimerizadas de actina citoplasmática, así como la filamina, en "islas" estables. de polímeros de actina agregados, pero no interfiere con las fibras tensas, es decir, haces gruesos de microfilamentos. Wehland et al. también señala que en concentraciones más altas, la faloidina induce la contracción celular.

Síntomas

Poco después de su descubrimiento, los científicos inyectaron faloidina en ratones y descubrieron que su LD50 es de 2 mg/kg mediante inyección IP. Cuando se expusieron a la dosis letal mínima, estos ratones tardaron varios días en morir. El único efecto secundario aparente del envenenamiento con faloidina es el hambre extrema. Esto se debe a que el hígado sólo absorbe la faloidina a través de las proteínas transportadoras de la membrana de las sales biliares. Una vez dentro del hígado, la faloidina se une a la actina F, impidiendo su despolimerización. Este proceso necesita tiempo para destruir las células del hígado. Los riñones también pueden absorber faloidina, pero no con tanta eficacia como el hígado. Aquí, la faloidina causa nefrosis.

Utilizar como herramienta de imágenes

Las propiedades de la faloidina la convierten en una herramienta útil para investigar la distribución de la actina F en las células marcando la faloidina con análogos fluorescentes y utilizándolos para teñir los filamentos de actina para microscopía óptica. Los derivados fluorescentes de la faloidina han resultado enormemente útiles para localizar filamentos de actina en células vivas o fijas, así como para visualizar filamentos de actina individuales in vitro. Se desarrolló una técnica de alta resolución para detectar actina F a niveles microscópicos óptico y electrónico mediante el uso de faloidina conjugada con el fluoróforo eosina, que actúa como etiqueta fluorescente. En este método conocido como fotooxidación por fluorescencia, se pueden utilizar moléculas fluorescentes para impulsar la oxidación de diaminobencidina (DAB) para crear un producto de reacción que pueda volverse denso en electrones y detectable mediante microscopía electrónica. La cantidad de fluorescencia visualizada se puede utilizar como medida cuantitativa de la cantidad de actina filamentosa que hay en las células si se utilizan cantidades saturadas de faloidina fluorescente. En consecuencia, la microscopía de inmunofluorescencia junto con la microinyección de faloidina se pueden utilizar para evaluar las funciones directas e indirectas de la actina citoplasmática en sus diferentes etapas de formación del polímero. Por lo tanto, la faloidina fluorescente puede utilizarse como una herramienta importante en el estudio de redes de actina en alta resolución.

Usos y limitaciones

La faloidina es mucho más pequeña que un anticuerpo que normalmente se usaría para marcar proteínas celulares para microscopía fluorescente, lo que permite un etiquetado mucho más denso de actina filamentosa y se pueden adquirir imágenes mucho más detalladas, particularmente a resoluciones más altas.

Las faloidinas no modificadas no atraviesan las membranas celulares, lo que las hace menos efectivas en experimentos con células vivas. Se han sintetizado derivados de faloidina con una permeabilidad celular muy aumentada.

Las células tratadas con faloidinas exhiben una serie de efectos tóxicos y con frecuencia mueren. Además, es importante señalar que las células tratadas con faloidina tendrán mayores niveles de actina asociada con sus membranas plasmáticas, y la microinyección de faloidina en células vivas cambiará la distribución de actina y la motilidad celular.