Extracción de ADN

La extracción de ADN es una técnica para aislar ácido desoxirribonucleico (ADN) de células o tejidos. También se le denomina purificación de ADN. El ADN así extraído se puede utilizar para investigaciones de biología molecular, como secuenciación del ADN, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o clonación. Existen diferentes protocolos para la extracción de ADN, aunque todos siguen aproximadamente el mismo esquema básico:

1. Lisis Celular
2. Eliminación de Proteínas
3. Exclusión de Otros Ácidos Nucleicos (ARN, etc.)
4. Concentración de ADN por precipitación con Etanol

Existen diferentes variaciones de la técnica de extracción de ADN, dependiendo de si el objetivo es extraer ADN genómico o ADN plasmídico. Si se busca la extracción de ADN genómico, se realiza a partir de los cromosomas de las células analizadas. Por otro lado, si se busca la extracción de ADN plasmídico se lleva a cabo a partir de los plásmidos, que son más comunes en células bacterianas como Escherichia coli. En la actualidad, el proceso se ha simplificado gracias a la disponibilidad de kits comerciales, que permiten realizar extracciones de manera rápida y eficiente, utilizando reactivos preparados listos para usar.

El primer aislamiento de ácido desoxirribonucleico (ADN) fue realizado en 1869 por el biólogo suizo Friedrich Miescher, marcando un hito en la historia de la biología molecular. Hoy en día, la extracción de ADN se ha convertido en un procedimiento rutinario, esencial tanto en investigaciones de biología molecular como en análisis forenses.

Para la extracción de ADN mediante métodos químicos, existen numerosos kits disponibles en el mercado. La elección del kit adecuado es crucial, ya que optimiza el tiempo y mejora la eficiencia del proceso de extracción. Además, se ha observado que la sensibilidad de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) varía entre los distintos kits comerciales, lo que destaca la importancia de seleccionar el kit más adecuado para cada investigación específica.

HSD

Procedimiento básico

• Las células que se van a estudiar necesitan ser recolectadas.
• Romper las membranas celulares para exponer el ADN junto con el citoplasma en su interior (lisis celular).
  • Los lípidos de la membrana celular y el núcleo se descomponen con detergentes y tensioactivos.
  • Descomponer las proteínas mediante la adición de una proteasa (opcional).
  • Rompiendo el ARN agregando una RNasa (opcional).
• La solución se trata con una solución salina concentrada (solución salina) para hacer que los desechos, como las proteínas rotas, los lípidos y el ARN, se agrupen.
• Centrifugación de la solución, que separa los restos celulares agrupados del ADN.
• Purificación de ADN a partir de detergentes, proteínas, sales y reactivos utilizados durante el paso de lisis celular. Los procedimientos más utilizados son:
  • Precipitación con etanol generalmente con etanol o isopropanol enfriado con hielo. Dado que el ADN es insoluble en estos alcoholes, se agregará, formando un sedimento tras la centrifugación. La precipitación del ADN se mejora aumentando la fuerza iónica, normalmente añadiendo acetato de sodio.
  • Extracción con fenol-cloroformo en la que el fenol desnaturaliza las proteínas de la muestra. Después de la centrifugación de la muestra, las proteínas desnaturalizadas permanecen en la fase orgánica mientras que la fase acuosa que contiene ácido nucleico se mezcla con cloroformo para eliminar los residuos de fenol de la solución.
  • Purificación en minicolumna que se basa en el hecho de que los ácidos nucleicos pueden unirse (adsorción) a la fase sólida (sílice u otra) dependiendo del pH y la concentración de sal del tampón.

Las proteínas celulares e histonas unidas al ADN pueden eliminarse añadiendo una proteasa o precipitando las proteínas con acetato de sodio o de amonio, o extrayéndolas con una mezcla de fenol-cloroformo antes de la precipitación del ADN.

Después del aislamiento, el ADN se disuelve en un tampón ligeramente alcalino, normalmente en un tampón TE, o en agua ultrapura.

Selección de método

Algunos de los métodos de extracción de ADN más comunes incluyen la extracción orgánica, la extracción Chelex y la extracción en fase sólida. Estos métodos producen ADN aislado de manera consistente, pero difieren tanto en la calidad como en la cantidad de ADN producido. Al seleccionar un método de extracción de ADN, hay múltiples factores a considerar, incluidos el costo, el tiempo, la seguridad y el riesgo de contaminación.

La extracción orgánica implica la adición e incubación en múltiples soluciones químicas diferentes; incluyendo un paso de lisis, una extracción con cloroformo de fenol, una precipitación con etanol y pasos de lavado. La extracción orgánica se usa a menudo en los laboratorios porque es barata y produce grandes cantidades de ADN puro. Aunque es fácil, hay muchos pasos involucrados y toma más tiempo que otros métodos. También implica el uso desfavorable de los químicos tóxicos fenol y cloroformo, y existe un mayor riesgo de contaminación debido a la transferencia del ADN entre múltiples tubos. Varios protocolos basados ​​en la extracción orgánica de ADN se desarrollaron efectivamente hace décadas, aunque también se han desarrollado y publicado versiones mejoradas y más prácticas de estos protocolos en los últimos años.

El método de extracción Chelex consiste en agregar la resina Chelex a la muestra, hervir la solución, luego agitarla en un vórtex y centrifugarla. Los materiales celulares se unen a las perlas de Chelex, mientras que el ADN está disponible en el sobrenadante. El método Chelex es mucho más rápido y sencillo que la extracción orgánica, y solo requiere un tubo, lo que disminuye el riesgo de contaminación del ADN. Desafortunadamente, la extracción de Chelex no produce tanta cantidad y el ADN producido es monocatenario, lo que significa que solo puede usarse para análisis basados ​​en PCR y no para RFLP.

La extracción en fase sólida, como el uso de un método de extracción basado en columna giratoria, aprovecha el hecho de que el ADN se une a la sílice. La muestra que contiene ADN se agrega a una columna que contiene gel de sílice o perlas de sílice y sales caotrópicas. Las sales caotrópicas interrumpen los enlaces de hidrógeno entre las hebras y facilitan la unión del ADN a la sílice al hacer que los ácidos nucleicos se vuelvan hidrofóbicos. Esto expone los residuos de fosfato para que estén disponibles para la adsorción. El ADN se une a la sílice, mientras que el resto de la solución se lava con etanol para eliminar las sales caotrópicas y otros componentes innecesarios. A continuación, el ADN se puede rehidratar con soluciones acuosas bajas en sal que permiten la elución del ADN de las perlas.

Este método produce ADN de alta calidad, en gran parte de doble cadena, que se puede utilizar tanto para análisis de PCR como de RFLP. Este procedimiento puede automatizarse y tiene un alto rendimiento, aunque menor que el método de fenol-cloroformo. Este es un método de un solo paso, es decir, todo el procedimiento se completa en un tubo. Esto reduce el riesgo de contaminación, lo que lo hace muy útil para la extracción forense de ADN. Diferentes empresas fabrican y comercializan kits comerciales de extracción en fase sólida múltiple; el único problema es que son más caros que la extracción orgánica o la extracción Chelex.

Hay kits de extracción de ADN disponibles comercialmente para una variedad de muestras biológicas, uno de esos kits es el kit de ADN genómico de sangre Taqgen®, que es adecuado para la extracción de ADN genómico de sangre completa, fluidos corporales, hisopos bucales, capa leucocitaria y células cultivadas. Es un kit basado en una columna giratoria que proporciona una purificación fácil, rápida y eficiente de ADN genómico de alta calidad. El ADN purificado se puede usar directamente en una variedad de aplicaciones posteriores, que incluyen PCR, PCR en tiempo real, transferencia Southern y digestión con enzimas de restricción. El kit elimina la necesidad de resina costosa, extracciones tóxicas de fenol-cloroformo o precipitación con alcohol que requiere mucho tiempo. El procedimiento estándar tarda menos de 20 minutos después de la lisis celular y produce ADN purificado de más de 30 Kb de tamaño.

Tipos especiales

Deben elegirse técnicas específicas para el aislamiento de ADN de algunas muestras. Las muestras típicas con aislamiento de ADN complicado son:

• muestras arqueológicas que contienen ADN parcialmente degradado, ver ADN antiguo
• muestras que contienen inhibidores de los procedimientos de análisis posteriores, en particular inhibidores de la PCR, como el ácido húmico del suelo, el índigo y otros tintes de telas o la hemoglobina en la sangre
• muestras de microorganismos con pared celular gruesa, por ejemplo levadura
• muestras que contienen ADN mixto de múltiples fuentes

El ADN extracromosómico generalmente es fácil de aislar, especialmente los plásmidos pueden aislarse fácilmente mediante lisis celular seguida de precipitación de proteínas, que atrapa el ADN cromosómico en la fracción insoluble y, después de la centrifugación, el ADN del plásmido puede purificarse a partir de la fracción soluble.

Una extracción de ADN Hirt es un aislamiento de todo el ADN extracromosómico en una célula de mamífero. El proceso de extracción de Hirt elimina el ADN nuclear de alto peso molecular, dejando solo el ADN mitocondrial de bajo peso molecular y cualquier episoma viral presente en la célula.

Detección de ADN

Un indicador de difenilamina (DPA) confirmará la presencia de ADN. Este procedimiento implica la hidrólisis química del ADN: cuando se calienta (p. ej., ≥95 °C) en ácido, la reacción requiere un azúcar desoxirribosa y, por lo tanto, es específica para el ADN. En estas condiciones, la 2-desoxirribosa se convierte en w-hidroxilevulinil aldehído, que reacciona con el compuesto difenilamina para producir un compuesto de color azul. La concentración de ADN se puede determinar midiendo la intensidad de absorbancia de la solución a 600 nm con un espectrofotómetro y comparándola con una curva estándar de concentraciones de ADN conocidas.

La medición de la intensidad de absorbancia de la solución de ADN a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm se utiliza como medida de la pureza del ADN. El ADN se puede cuantificar cortando el ADN con una enzima de restricción, ejecutándolo en un gel de agarosa, tiñendo con bromuro de etidio (EtBr) o una tinción diferente y comparando la intensidad del ADN con un marcador de ADN de concentración conocida.

Usando la técnica de transferencia Southern, este ADN cuantificado puede aislarse y examinarse más usando análisis PCR y RFLP. Estos procedimientos permiten la diferenciación de las secuencias repetidas dentro del genoma. Son estas técnicas las que utilizan los científicos forenses para comparar, identificar y analizar.

Método de extracción de ADN de alto peso molecular

En este método, los núcleos de las plantas se aíslan triturando físicamente los tejidos y reconstituyendo los núcleos intactos en un único tampón de aislamiento nuclear (NIB). Los ADN plástidos se liberan de los orgánulos y se eliminan con un tampón osmótico mediante lavado y centrifugación. A continuación, los núcleos purificados se lisan y se limpian más mediante extracción orgánica, y el ADN genómico se precipita con una alta concentración de CTAB. El ADNg altamente puro y de alto peso molecular se extrae de los núcleos, se disuelve en un tampón de pH alto, lo que permite un almacenamiento estable a largo plazo.