Espectrometría de masas

La espectrometría de masas es una técnica analítica que se utiliza para medir la relación masa-carga de los iones. Los resultados se presentan como un espectro de masas, un gráfico de intensidad en función de la relación masa-carga. La espectrometría de masas se utiliza en muchos campos diferentes y se aplica tanto a muestras puras como a mezclas complejas.

Un espectro de masas es un tipo de gráfico de la señal de iones en función de la relación masa-carga. Estos espectros se utilizan para determinar la firma elemental o isotópica de una muestra, las masas de partículas y moléculas, y para dilucidar la identidad química o estructura de moléculas y otros compuestos químicos.

En un procedimiento típico de MS, se ioniza una muestra, que puede ser sólida, líquida o gaseosa, por ejemplo, bombardeándola con un haz de electrones. Esto puede causar que algunas de las moléculas de la muestra se rompan en fragmentos cargados positivamente o simplemente se carguen positivamente sin fragmentarse. Estos iones (fragmentos) luego se separan de acuerdo con su relación masa-carga, por ejemplo, acelerándolos y sometiéndolos a un campo eléctrico o magnético: los iones de la misma relación masa-carga sufrirán la misma cantidad de desviación..Los iones son detectados por un mecanismo capaz de detectar partículas cargadas, como un multiplicador de electrones. Los resultados se muestran como espectros de la intensidad de la señal de los iones detectados en función de la relación masa-carga. Los átomos o moléculas de la muestra se pueden identificar correlacionando masas conocidas (p. ej., una molécula completa) con las masas identificadas o mediante un patrón de fragmentación característico.

Historia del espectrómetro de masas

En 1886, Eugen Goldstein observó rayos en descargas de gas a baja presión que se alejaban del ánodo y a través de canales en un cátodo perforado, en dirección opuesta a los rayos catódicos cargados negativamente (que viajan de cátodo a ánodo). Goldstein llamó a estos rayos de ánodo cargados positivamente "Kanalstrahlen"; la traducción estándar de este término al inglés es "canal rayos". Wilhelm Wien descubrió que los campos eléctricos o magnéticos fuertes desviaban los rayos del canal y, en 1899, construyó un dispositivo con campos eléctricos y magnéticos perpendiculares que separaban los rayos positivos según su relación carga-masa (Q/m). Wien descubrió que la relación carga-masa dependía de la naturaleza del gas en el tubo de descarga. El científico inglés JJ Thomson luego mejoró el trabajo de Wien al reducir la presión para crear el espectrógrafo de masas.

La palabra espectrógrafo se había convertido en parte del vocabulario científico internacional en 1884. Los primeros dispositivos de espectrometría que medían la relación masa-carga de los iones se llamaban espectrógrafos de masas y consistían en instrumentos que registraban un espectro de valores de masa en una placa fotográfica. Un espectroscopio de masas es similar a un espectrógrafo de masas excepto que el haz de iones se dirige a una pantalla de fósforo.Se utilizó una configuración de espectroscopio de masas en los primeros instrumentos cuando se deseaba que los efectos de los ajustes se observaran rápidamente. Una vez ajustado correctamente el instrumento, se insertó y expuso una placa fotográfica. El término espectroscopio de masas siguió utilizándose a pesar de que la iluminación directa de una pantalla de fósforo fue reemplazada por mediciones indirectas con un osciloscopio. Ahora se desaconseja el uso del término espectroscopia de masas debido a la posibilidad de confusión con la espectroscopia de luz. La espectrometría de masas a menudo se abrevia como espectrometría de masas o simplemente como MS.

Las técnicas modernas de espectrometría de masas fueron ideadas por Arthur Jeffrey Dempster y FW Aston en 1918 y 1919 respectivamente.

Los espectrómetros de masas sectoriales conocidos como calutrones fueron desarrollados por Ernest O. Lawrence y se utilizaron para separar los isótopos de uranio durante el Proyecto Manhattan. Los espectrómetros de masas Calutron se utilizaron para el enriquecimiento de uranio en la planta Y-12 de Oak Ridge, Tennessee, establecida durante la Segunda Guerra Mundial.

En 1989, la mitad del Premio Nobel de Física se otorgó a Hans Dehmelt y Wolfgang Paul por el desarrollo de la técnica de trampa de iones en las décadas de 1950 y 1960.

En 2002, el Premio Nobel de Química fue otorgado a John Bennett Fenn por el desarrollo de la ionización por electrospray (ESI) y a Koichi Tanaka por el desarrollo de la desorción por láser suave (SLD) y su aplicación a la ionización de macromoléculas biológicas, especialmente proteínas.

Partes de un espectrómetro de masas

Un espectrómetro de masas consta de tres componentes: una fuente de iones, un analizador de masas y un detector. El ionizador convierte una parte de la muestra en iones. Existe una amplia variedad de técnicas de ionización, dependiendo de la fase (sólido, líquido, gas) de la muestra y la eficiencia de varios mecanismos de ionización para las especies desconocidas. Un sistema de extracción elimina los iones de la muestra, que luego se dirigen a través del analizador de masas hacia el detector. Las diferencias en las masas de los fragmentos permiten que el analizador de masas clasifique los iones por su relación masa-carga. El detector mide el valor de una cantidad indicadora y, por lo tanto, proporciona datos para calcular las abundancias de cada ion presente. Algunos detectores también dan información espacial, por ejemplo, una placa multicanal.

Ejemplo teórico

A continuación se describe el funcionamiento de un espectrómetro analizador de masas, que es del tipo sector. (Otros tipos de analizadores se tratan a continuación). Considere una muestra de cloruro de sodio (sal de mesa). En la fuente de iones, la muestra se vaporiza (se convierte en gas) y se ioniza (se transforma en partículas cargadas eléctricamente) en sodio (Na) y cloruro (Cl) iones. Los átomos e iones de sodio son monoisotópicos, con una masa de unas 23 u. Los átomos de cloruro y los iones vienen en dos isótopos estables con masas de aproximadamente 35 u (en una abundancia natural de alrededor del 75 por ciento) y aproximadamente 37 u (en una abundancia natural de alrededor del 25 por ciento). La parte del analizador del espectrómetro contiene campos eléctricos y magnéticos, que ejercen fuerzas sobre los iones que viajan a través de estos campos. La velocidad de una partícula cargada puede aumentar o disminuir mientras atraviesa el campo eléctrico, y su dirección puede verse alterada por el campo magnético. La magnitud de la desviación de la trayectoria del ion en movimiento depende de su relación masa-carga. Los iones más ligeros son desviados por la fuerza magnética más que los iones más pesados ​​(basado en la segunda ley de movimiento de Newton, F = ma). Las corrientes de iones clasificados pasan del analizador al detector, que registra la abundancia relativa de cada tipo de ion. Esta información se utiliza para determinar la composición de elementos químicos de la muestra original (es decir, que tanto el sodio como el cloro están presentes en la muestra) y la composición isotópica de sus constituyentes (la proporción de Cl a Cl).

Creando iones

La fuente de iones es la parte del espectrómetro de masas que ioniza el material bajo análisis (el analito). Luego, los iones son transportados por campos magnéticos o eléctricos al analizador de masas.

Las técnicas de ionización han sido clave para determinar qué tipos de muestras pueden analizarse mediante espectrometría de masas. La ionización electrónica y la ionización química se utilizan para gases y vapores. En las fuentes de ionización química, el analito se ioniza mediante reacciones químicas ion-molécula durante las colisiones en la fuente. Dos técnicas que se utilizan a menudo con muestras biológicas líquidas y sólidas incluyen la ionización por electropulverización (inventada por John Fenn) y la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI, inicialmente desarrollada como una técnica similar "Desorción láser suave (SLD)" por K. Tanaka para la cual se otorgó un Premio Nobel y como MALDI por M. Karas y F. Hillenkamp).

Ionización dura e ionización blanda

En espectrometría de masas, la ionización se refiere a la producción de iones en fase gaseosa adecuados para la resolución en el analizador de masas o el filtro de masas. La ionización se produce en la fuente de iones. Hay varias fuentes de iones disponibles; cada uno tiene ventajas y desventajas para aplicaciones particulares. Por ejemplo, la ionización electrónica (EI) proporciona un alto grado de fragmentación, lo que produce espectros de masas muy detallados que, cuando se analizan hábilmente, pueden proporcionar información importante para la elucidación/caracterización estructural y facilitar la identificación de compuestos desconocidos en comparación con bibliotecas de espectros de masas obtenidas en condiciones operativas idénticas.. Sin embargo, EI no es adecuado para acoplarse a HPLC, es decir, LC-MS, ya que a presión atmosférica, los filamentos utilizados para generar electrones se queman rápidamente. Por lo tanto, EI se acopla predominantemente con GC, es decir, GC-MS,

Las técnicas de ionización dura son procesos que imparten grandes cantidades de energía residual en la molécula en cuestión provocando grandes grados de fragmentación (es decir, la ruptura sistemática de enlaces actúa para eliminar el exceso de energía, restaurando la estabilidad del ion resultante). Los iones resultantes tienden a tener m/z más bajo que la masa molecular (excepto en el caso de la transferencia de protones y sin incluir los picos de isótopos). El ejemplo más común de ionización dura es la ionización electrónica (EI).

La ionización suave se refiere a los procesos que imparten poca energía residual a la molécula en cuestión y, como tal, dan como resultado una pequeña fragmentación. Los ejemplos incluyen el bombardeo de átomos rápidos (FAB), la ionización química (CI), la ionización química a presión atmosférica (APCI), la fotoionización a presión atmosférica (APPI), la ionización por electropulverización (ESI), la ionización por electropulverización por desorción (DESI) y el láser asistido por matriz. desorción/ionización (MALDI).

Plasma acoplado inductivamente

Las fuentes de plasma acoplado inductivamente (ICP) se utilizan principalmente para el análisis de cationes de una amplia gama de tipos de muestras. En esta fuente, un plasma que es eléctricamente neutro en general, pero que ha tenido una fracción sustancial de sus átomos ionizados por alta temperatura, se usa para atomizar las moléculas de muestra introducidas y para quitar aún más los electrones externos de esos átomos. El plasma generalmente se genera a partir de gas argón, ya que la primera energía de ionización de los átomos de argón es más alta que la primera de cualquier otro elemento excepto He, F y Ne, pero más baja que la segunda energía de ionización de todos excepto los metales más electropositivos. El calentamiento se logra mediante una corriente de radiofrecuencia que pasa a través de una bobina que rodea el plasma.

Espectrometría de masas de fotoionización

La fotoionización se puede usar en experimentos que buscan usar la espectrometría de masas como un medio para resolver los mecanismos de cinética química y la ramificación de productos isoméricos. En tales casos, se utiliza un fotón de alta energía, ya sea de rayos X o ultravioleta, para disociar moléculas gaseosas estables en un gas portador de He o Ar. En los casos en que se utiliza una fuente de luz de sincrotrón, se puede utilizar una energía de fotón sintonizable para adquirir una curva de eficiencia de fotoionización que se puede usar junto con la relación de carga m/z para las especies iónicas y moleculares de la huella dactilar. Más recientemente, se ha desarrollado la fotoionización a presión atmosférica (APPI) para ionizar moléculas principalmente como efluentes de sistemas LC-MS.

Ionización ambiental

Algunas aplicaciones para la ionización ambiental incluyen aplicaciones ambientales así como aplicaciones clínicas. En estas técnicas, los iones se forman en una fuente de iones fuera del espectrómetro de masas. El muestreo se vuelve fácil ya que las muestras no necesitan separación ni preparación previa. Algunos ejemplos de técnicas de ionización ambiental son DESI, SESI, LAESI, desorción de ionización química a presión atmosférica (DAPCI) y desorción de fotoionización a presión atmosférica DAPPI, entre otras.

Otras técnicas de ionización

Otros incluyen descarga luminiscente, desorción de campo (FD), bombardeo de átomos rápidos (FAB), termospray, desorción/ionización en silicio (DIOS), análisis directo en tiempo real (DART), ionización química a presión atmosférica (APCI), espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS), ionización por chispa e ionización térmica (TIMS).

Selección en masa

Los analizadores de masas separan los iones según su relación masa-carga. Las siguientes dos leyes gobiernan la dinámica de partículas cargadas en campos eléctricos y magnéticos en el vacío:{displaystyle mathbf {F} =Q(mathbf {E} +mathbf {v} times mathbf {B})}(ley de fuerza de Lorentz);{displaystyle mathbf {F} =mmathbf {a} }(La segunda ley de movimiento de Newton en el caso no relativista, es decir, válida sólo a una velocidad de iones mucho más baja que la velocidad de la luz).

Aquí F es la fuerza aplicada al ion, m es la masa del ion, a es la aceleración, Q es la carga del ion, E es el campo eléctrico y v × B es el producto vectorial vectorial de la velocidad del ion y la campo magnético

Igualando las expresiones anteriores para la fuerza aplicada al ion se obtiene:{displaystyle (m/Q)mathbf {a} =mathbf {E} +mathbf {v} times mathbf {B}.}

Esta ecuación diferencial es la ecuación clásica de movimiento para partículas cargadas. Junto con las condiciones iniciales de la partícula, determina completamente el movimiento de la partícula en el espacio y el tiempo en términos de m/Q. Por lo tanto, los espectrómetros de masas podrían considerarse como "espectrómetros de masa a carga". Cuando se presentan datos, es común utilizar (oficialmente) m/z adimensional, donde z es el número de cargas elementales (e) en el ion (z=Q/e). Esta cantidad, aunque informalmente se denomina relación masa-carga, hablando con mayor precisión representa la relación entre el número de masa y el número de carga, z.

Hay muchos tipos de analizadores de masas, que utilizan campos estáticos o dinámicos y campos magnéticos o eléctricos, pero todos funcionan de acuerdo con la ecuación diferencial anterior. Cada tipo de analizador tiene sus puntos fuertes y débiles. Muchos espectrómetros de masas utilizan dos o más analizadores de masas para la espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Además de los analizadores de masas más comunes que se enumeran a continuación, existen otros diseñados para situaciones especiales.

Hay varias características importantes del analizador. El poder de resolución de masa es la medida de la capacidad de distinguir dos picos de m/z ligeramente diferentes. La precisión de la masa es la relación entre el error de medición de m/z y el verdadero m/z. La precisión de la masa generalmente se mide en unidades de ppm o milimasa. El rango de masas es el rango de m/z susceptible de análisis por un analizador dado. El rango dinámico lineal es el rango en el que la señal de iones es lineal con la concentración del analito. La velocidad se refiere al marco de tiempo del experimento y, en última instancia, se utiliza para determinar la cantidad de espectros por unidad de tiempo que se pueden generar.

Instrumentos sectoriales

Un analizador de masas de campo sectorial utiliza un campo eléctrico y/o magnético estático para afectar de alguna manera la trayectoria y/o la velocidad de las partículas cargadas. Como se muestra arriba, los instrumentos sectoriales doblan las trayectorias de los iones a medida que pasan a través del analizador de masas, de acuerdo con sus relaciones masa-carga, desviando más los iones más ligeros, más cargados y de movimiento más rápido. El analizador se puede utilizar para seleccionar un rango estrecho de m/zo para escanear a través de un rango de m/z para catalogar los iones presentes.

Tiempo de vuelo

El analizador de tiempo de vuelo (TOF) utiliza un campo eléctrico para acelerar los iones a través del mismo potencial y luego mide el tiempo que tardan en llegar al detector. Si todas las partículas tienen la misma carga, sus energías cinéticas serán idénticas y sus velocidades dependerán únicamente de sus masas. Los iones con una masa menor llegarán primero al detector.Sin embargo, en realidad, incluso las partículas con el mismo m/z pueden llegar en tiempos diferentes al detector, porque tienen velocidades iniciales diferentes. La velocidad inicial a menudo no depende de la masa del ion TOF-MS y se convertirá en una diferencia en la velocidad final. Debido a esto, los iones con la misma relación m/z llegarán al detector en una variedad de tiempos, lo que amplía los picos que se muestran en el gráfico de conteo frente a m/z, pero generalmente no cambiará la ubicación central de los picos, ya que el la velocidad inicial promedio de los iones en relación con los otros iones analizados generalmente se centra en cero. Para solucionar este problema, se combinó el enfoque con retardo de tiempo/la extracción retardada con TOF-MS.

Filtro de masas cuadrupolo

Los analizadores de masas de cuadrupolo utilizan campos eléctricos oscilantes para estabilizar o desestabilizar selectivamente las rutas de los iones que pasan a través de un campo de cuadrupolo de radiofrecuencia (RF) creado entre cuatro varillas paralelas. Solo los iones en un cierto rango de relación masa/carga pasan a través del sistema en cualquier momento, pero los cambios en los potenciales en las varillas permiten barrer rápidamente un amplio rango de valores m/z, ya sea continuamente o en una sucesión de saltos discretos. Un analizador de masas de cuadrupolo actúa como un filtro selectivo de masas y está estrechamente relacionado con la trampa de iones de cuadrupolo, particularmente la trampa de iones de cuadrupolo lineal, excepto que está diseñada para dejar pasar los iones no atrapados en lugar de recolectar los atrapados, y por esa razón se denomina como un cuadrupolo de transmisión. Un analizador de masas de cuadrupolo mejorado magnéticamente incluye la adición de un campo magnético, ya sea aplicado axial o transversalmente. Este nuevo tipo de instrumento conduce a una mejora adicional del rendimiento en términos de resolución y/o sensibilidad dependiendo de la magnitud y orientación del campo magnético aplicado. Una variación común del cuadrupolo de transmisión es el espectrómetro de masas de triple cuadrupolo. El "cuadruángulo triple" tiene tres etapas de cuadrupolo consecutivas, la primera actúa como un filtro de masa para transmitir un ion entrante particular al segundo cuadrupolo, una cámara de colisión, en la que ese ion se puede romper en fragmentos. El tercer cuadrupolo también actúa como un filtro de masas, para transmitir un ion de fragmento particular al detector. Si se hace que un cuadrupolo realice un ciclo rápido y repetitivo a través de un rango de configuraciones de filtro de masa, se pueden informar espectros completos. Del mismo modo, se puede hacer un quad triple para realizar varios tipos de exploración característicos de la espectrometría de masas en tándem.

Trampas de iones

Trampa de iones cuadripolar tridimensional

La trampa de iones de cuadrupolo funciona con los mismos principios físicos que el analizador de masas de cuadrupolo, pero los iones quedan atrapados y expulsados ​​secuencialmente. Los iones quedan atrapados en un campo de RF principalmente de cuadrupolo, en un espacio definido por un electrodo de anillo (normalmente conectado al potencial de RF principal) entre dos electrodos de tapa final (normalmente conectados a potenciales de CC o CA auxiliares). La muestra se ioniza internamente (por ejemplo, con un haz de electrones o láser) o externamente, en cuyo caso los iones a menudo se introducen a través de una abertura en un electrodo de tapa final.

Hay muchos métodos de separación y aislamiento de masa/carga, pero el más utilizado es el modo de inestabilidad de masa en el que el potencial de RF se eleva de modo que la órbita de los iones con una masa a > b sea estable, mientras que los iones con una masa b se vuelven inestables y son expulsado en el eje z sobre un detector. También existen métodos de análisis no destructivos.

Los iones también pueden ser expulsados ​​por el método de excitación por resonancia, mediante el cual se aplica un voltaje de excitación oscilatorio suplementario a los electrodos de la tapa y se varía la amplitud del voltaje de captura y/o la frecuencia del voltaje de excitación para llevar los iones a una condición de resonancia en orden de masa/ relación de carga

Trampa de iones cilíndrica

El espectrómetro de masas con trampa de iones cilíndrico (CIT) es un derivado de la trampa de iones de cuadrupolo donde los electrodos se forman a partir de anillos planos en lugar de electrodos de forma hiperbólica. La arquitectura se presta bien a la miniaturización porque a medida que se reduce el tamaño de una trampa, la forma del campo eléctrico cerca del centro de la trampa, la región donde se atrapan los iones, adquiere una forma similar a la de una trampa hiperbólica.

Trampa de iones de cuadrupolo lineal

Una trampa de iones de cuadrupolo lineal es similar a una trampa de iones de cuadrupolo, pero atrapa iones en un campo de cuadrupolo bidimensional, en lugar de un campo de cuadrupolo tridimensional como en una trampa de iones de cuadrupolo 3D. El LTQ de Thermo Fisher ("cuadrupolo de trampa lineal") es un ejemplo de trampa de iones lineal.

Una trampa de iones toroidal se puede visualizar como un cuadrupolo lineal curvado y conectado en los extremos o como una sección transversal de una trampa de iones 3D girada en el borde para formar la trampa toroidal en forma de rosquilla. La trampa puede almacenar grandes volúmenes de iones distribuyéndolos por toda la estructura de la trampa en forma de anillo. Esta trampa de forma toroidal es una configuración que permite una mayor miniaturización de un analizador de masas de trampa de iones. Además, todos los iones se almacenan en el mismo campo de captura y se expulsan juntos, lo que simplifica la detección que puede complicarse con las configuraciones de matriz debido a las variaciones en la alineación del detector y el mecanizado de las matrices.

Al igual que con la trampa toroidal, las trampas lineales y las trampas de iones de cuadrupolo 3D son los analizadores de masas miniaturizados más comunes debido a su alta sensibilidad, tolerancia a la presión de mTorr y capacidades para la espectrometría de masas en tándem de un solo analizador (por ejemplo, exploraciones de iones de producto).

Trampa orbital

Los instrumentos Orbitrap son similares a los espectrómetros de masas de resonancia de ciclotrón de iones por transformada de Fourier (consulte el texto a continuación). Los iones quedan atrapados electrostáticamente en una órbita alrededor de un electrodo central en forma de huso. El electrodo confina los iones para que orbiten alrededor del electrodo central y oscilen de un lado a otro a lo largo del eje longitudinal del electrodo central. Esta oscilación genera una imagen de corriente en las placas detectoras que es registrada por el instrumento. Las frecuencias de estas corrientes de imagen dependen de las relaciones masa-carga de los iones. Los espectros de masas se obtienen mediante la transformación de Fourier de las corrientes de imagen registradas.

Las trampas orbitales tienen una alta precisión de masa, alta sensibilidad y un buen rango dinámico.

Resonancia de ciclotrón de iones transformada de Fourier

La espectrometría de masas por transformada de Fourier (FTMS), o más precisamente MS de resonancia de ciclotrón de iones por transformada de Fourier, mide la masa detectando la corriente de imagen producida por el ciclotrón de iones en presencia de un campo magnético. En lugar de medir la desviación de los iones con un detector como un multiplicador de electrones, los iones se inyectan en una trampa de Penning (una trampa de iones magnéticos/eléctricos estáticos) donde efectivamente forman parte de un circuito. Los detectores en posiciones fijas en el espacio miden la señal eléctrica de los iones que pasan cerca de ellos a lo largo del tiempo, produciendo una señal periódica. Dado que la frecuencia del ciclo de un ion está determinada por su relación masa-carga, esto se puede desconvolucionar realizando una transformada de Fourier en la señal. FTMS tiene la ventaja de una alta sensibilidad (ya que cada ion se "cuenta"

La resonancia de ciclotrón de iones (ICR) es una técnica de análisis de masas más antigua similar a FTMS excepto que los iones se detectan con un detector tradicional. Los iones atrapados en una trampa de Penning son excitados por un campo eléctrico de RF hasta que impactan contra la pared de la trampa, donde se encuentra el detector. Los iones de diferente masa se resuelven según el tiempo de impacto.

Detectores

El elemento final del espectrómetro de masas es el detector. El detector registra la carga inducida o la corriente producida cuando un ion pasa o golpea una superficie. En un instrumento de exploración, la señal producida en el detector durante el transcurso de la exploración frente a dónde se encuentra el instrumento en la exploración (a qué m/Q) producirá un espectro de masas, un registro de iones en función de m/Q.

Por lo general, se usa algún tipo de multiplicador de electrones, aunque también se usan otros detectores, incluidas las copas de Faraday y los detectores de iones a fotones. Debido a que el número de iones que salen del analizador de masas en un instante particular suele ser bastante pequeño, a menudo se necesita una amplificación considerable para obtener una señal. Los detectores de placa de microcanal se utilizan comúnmente en instrumentos comerciales modernos. En FTMS y Orbitraps, el detector consta de un par de superficies metálicas dentro de la región del analizador de masas/trampa de iones cerca de la cual los iones solo pasan cuando oscilan. No se produce corriente continua, solo se produce una corriente de imagen de CA débil en un circuito entre los electrodos. También se han utilizado otros detectores inductivos.

Espectrometría de masas en tándem

Un espectrómetro de masas en tándem es capaz de múltiples rondas de espectrometría de masas, generalmente separadas por alguna forma de fragmentación de moléculas. Por ejemplo, un analizador de masas puede aislar un péptido de muchos que entran en un espectrómetro de masas. Luego, un segundo analizador de masas estabiliza los iones peptídicos mientras chocan con un gas, lo que hace que se fragmenten por disociación inducida por colisión (CID). Luego, un tercer analizador de masas clasifica los fragmentos producidos a partir de los péptidos. Tandem MS también se puede realizar en un solo analizador de masas a lo largo del tiempo, como en una trampa de iones de cuadrupolo. Existen varios métodos para fragmentar moléculas para MS en tándem, incluida la disociación inducida por colisión (CID), la disociación por captura de electrones (ECD), la disociación por transferencia de electrones (ETD), la disociación multifotónica infrarroja (IRMPD), la disociación radiativa infrarroja de cuerpo negro (BIRD), disociación por desprendimiento de electrones (EDD) y disociación inducida por superficie (SID). Una aplicación importante de la espectrometría de masas en tándem es la identificación de proteínas.

La espectrometría de masas en tándem permite una variedad de secuencias experimentales. Muchos espectrómetros de masas comerciales están diseñados para acelerar la ejecución de secuencias rutinarias como la monitorización de reacciones seleccionadas (SRM) y la exploración de iones precursores. En SRM, el primer analizador solo permite el paso de una sola masa y el segundo analizador monitorea múltiples iones de fragmentos definidos por el usuario. SRM se usa con mayor frecuencia con instrumentos de escaneo donde el segundo evento de análisis masivo está limitado por el ciclo de trabajo. Estos experimentos se utilizan para aumentar la especificidad de detección de moléculas conocidas, especialmente en estudios farmacocinéticos. El escaneo de iones precursores se refiere al monitoreo de una pérdida específica del ion precursor. Los analizadores de masas primero y segundo escanean a través del espectro dividido por un m/z definido por el usuariovalor. Este experimento se utiliza para detectar motivos específicos dentro de moléculas desconocidas.

Otro tipo de espectrometría de masas en tándem utilizada para la datación por radiocarbono es la espectrometría de masas con acelerador (AMS), que utiliza voltajes muy altos, generalmente en el rango de megavoltios, para acelerar los iones negativos en un tipo de espectrómetro de masas en tándem.

La base de datos de metabolitos y entidades químicas de METLIN es el depósito más grande de datos experimentales de espectrometría de masas en tándem adquiridos a partir de estándares. Los datos de espectrometría de masas en tándem de más de 850 000 estándares moleculares (al 24 de agosto de 2020) se proporcionan para facilitar la identificación de entidades químicas a partir de experimentos de espectrometría de masas en tándem. Además de la identificación de moléculas conocidas, también es útil para identificar incógnitas utilizando su búsqueda/análisis de similitud. Todos los datos de espectrometría de masas en tándem provienen del análisis experimental de estándares en múltiples energías de colisión y en modos de ionización tanto positivos como negativos.

Configuraciones y técnicas comunes de espectrómetros de masas

Cuando una combinación específica de fuente, analizador y detector se vuelve convencional en la práctica, puede surgir un acrónimo compuesto para designarlo sucintamente. Un ejemplo es MALDI-TOF, que se refiere a una combinación de una fuente de desorción/ionización láser asistida por matriz con un analizador de masas de tiempo de vuelo. Otros ejemplos incluyen espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), espectrometría de masas de acelerador (AMS), espectrometría de masas de ionización térmica (TIMS) y espectrometría de masas de fuente de chispa (SSMS).

Ciertas aplicaciones de la espectrometría de masas han desarrollado apodos que, aunque estrictamente hablando parecerían referirse a una aplicación amplia, en la práctica han llegado a connotar configuraciones de instrumentos específicas o limitadas. Un ejemplo de esto es la espectrometría de masas de relación isotópica (IRMS), que en la práctica se refiere al uso de un número limitado de analizadores de masas sectoriales; este nombre se utiliza para referirse tanto a la aplicación como al instrumento utilizado para la aplicación.

Técnicas de separación combinadas con espectrometría de masas

Una mejora importante de las capacidades de resolución y determinación de masas de la espectrometría de masas es su uso junto con la cromatografía y otras técnicas de separación.

Cromatografía de gases

Una combinación común es la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC/MS o GC-MS). En esta técnica, se utiliza un cromatógrafo de gases para separar diferentes compuestos. Esta corriente de compuestos separados se alimenta en línea a la fuente de iones, un filamento metálico al que se aplica voltaje. Este filamento emite electrones que ionizan los compuestos. Luego, los iones pueden fragmentarse aún más, produciendo patrones predecibles. Los iones y fragmentos intactos pasan al analizador del espectrómetro de masas y finalmente se detectan. Sin embargo, las altas temperaturas (300 °C) utilizadas en el puerto de inyección (y el horno) de GC-MS pueden provocar la degradación térmica de las moléculas inyectadas, lo que da como resultado la medición de los productos de degradación en lugar de la(s) molécula(s) real(es) de interés.

Cromatografía líquida

De forma similar a la cromatografía de gases MS (GC-MS), la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC/MS o LC-MS) separa los compuestos cromatográficamente antes de introducirlos en la fuente de iones y el espectrómetro de masas. Se diferencia de GC-MS en que la fase móvil es líquida, normalmente una mezcla de agua y disolventes orgánicos, en lugar de gas. Más comúnmente, se utiliza una fuente de ionización por electropulverización en LC-MS. Otras fuentes de iones LC-MS populares y comercialmente disponibles son la ionización química a presión atmosférica y la fotoionización a presión atmosférica. También hay algunas técnicas de ionización recientemente desarrolladas, como el rociado láser.

Electroforesis capilar-espectrometría de masas

La electroforesis capilar-espectrometría de masas (CE-MS) es una técnica que combina el proceso de separación de líquidos de la electroforesis capilar con la espectrometría de masas. La CE-MS suele estar acoplada a la ionización por electropulverización.

Movilidad de iones

La espectrometría de masas-espectrometría de movilidad iónica (IMS/MS o IMMS) es una técnica en la que los iones se separan primero por tiempo de deriva a través de un gas neutro bajo un gradiente de potencial eléctrico aplicado antes de introducirlos en un espectrómetro de masas. El tiempo de deriva es una medida del radio relativo a la carga del ion. El ciclo de trabajo de IMS (el tiempo durante el cual se lleva a cabo el experimento) es más largo que la mayoría de las técnicas de espectrometría de masas, de modo que el espectrómetro de masas puede tomar muestras a lo largo de la separación de IMS. Esto produce datos sobre la separación IMS y la relación masa-carga de los iones de manera similar a LC-MS.

El ciclo de trabajo de IMS es corto en comparación con las separaciones por cromatografía líquida o cromatografía de gases y, por lo tanto, puede acoplarse a tales técnicas, produciendo modalidades triples como LC/IMS/MS.

Datos y análisis

Representaciones de datos

La espectrometría de masas produce varios tipos de datos. La representación de datos más común es el espectro de masas.

Ciertos tipos de datos de espectrometría de masas se representan mejor como un cromatograma de masas. Los tipos de cromatogramas incluyen monitoreo de iones seleccionados (SIM), corriente de iones totales (TIC) y monitoreo de reacciones seleccionadas (SRM), entre muchos otros.

Otros tipos de datos de espectrometría de masas están bien representados como un mapa de contorno tridimensional. De esta forma, la masa a carga, m/z está en el eje x, la intensidad en el eje y, y un parámetro experimental adicional, como el tiempo, se registra en el eje z.

Análisis de los datos

El análisis de datos de espectrometría de masas es específico del tipo de experimento que produce los datos. Las subdivisiones generales de datos son fundamentales para comprender cualquier dato.

Muchos espectrómetros de masas funcionan en modo de iones negativos o en modo de iones positivos. Es muy importante saber si los iones observados tienen carga negativa o positiva. Esto suele ser importante para determinar la masa neutra, pero también indica algo sobre la naturaleza de las moléculas.

Diferentes tipos de fuentes de iones dan como resultado diferentes conjuntos de fragmentos producidos a partir de las moléculas originales. Una fuente de ionización de electrones produce muchos fragmentos y en su mayoría radicales de una sola carga (1-) (número impar de electrones), mientras que una fuente de electropulverización generalmente produce iones cuasimoleculares no radicales que con frecuencia tienen carga múltiple. La espectrometría de masas en tándem produce deliberadamente fragmentos de iones después de la fuente y puede cambiar drásticamente el tipo de datos obtenidos por un experimento.

El conocimiento del origen de una muestra puede proporcionar información sobre las moléculas componentes de la muestra y sus fragmentaciones. Una muestra de un proceso de síntesis/fabricación probablemente contenga impurezas relacionadas químicamente con el componente objetivo. Una muestra biológica preparada en forma tosca probablemente contendrá una cierta cantidad de sal, que puede formar aductos con las moléculas del analito en ciertos análisis.

Los resultados también pueden depender en gran medida de la preparación de la muestra y de cómo se ejecutó/introdució. Un ejemplo importante es la cuestión de qué matriz se usa para la detección de MALDI, ya que gran parte de la energía del evento de desorción/ionización está controlada por la matriz en lugar de la potencia del láser. A veces, las muestras se enriquecen con sodio u otra especie portadora de iones para producir aductos en lugar de una especie protonada.

La espectrometría de masas puede medir la masa molar, la estructura molecular y la pureza de la muestra. Cada una de estas preguntas requiere un procedimiento experimental diferente; por lo tanto, la definición adecuada del objetivo experimental es un requisito previo para recopilar los datos adecuados e interpretarlos con éxito.

Interpretación de espectros de masas

Dado que la estructura precisa o la secuencia peptídica de una molécula se descifra a través del conjunto de masas de los fragmentos, la interpretación de los espectros de masas requiere el uso combinado de varias técnicas. Por lo general, la primera estrategia para identificar un compuesto desconocido es comparar su espectro de masas experimental con una biblioteca de espectros de masas. Si la búsqueda no da como resultado ninguna coincidencia, se debe realizar una interpretación manual o una interpretación asistida por software de los espectros de masas. La simulación por computadora de los procesos de ionización y fragmentación que ocurren en el espectrómetro de masas es la herramienta principal para asignar la estructura o la secuencia peptídica a una molécula. Una información estructural a priori se fragmenta in silicoy el patrón resultante se compara con el espectro observado. Dicha simulación suele estar respaldada por una biblioteca de fragmentación que contiene patrones publicados de reacciones de descomposición conocidas. Se ha desarrollado software que aprovecha esta idea tanto para moléculas pequeñas como para proteínas.

El análisis de espectros de masas también puede ser espectros con masa precisa. Un valor de relación masa-carga (m/z) con solo una precisión entera puede representar un número inmenso de estructuras iónicas teóricamente posibles; sin embargo, las cifras de masa más precisas reducen significativamente el número de fórmulas moleculares candidatas. Un algoritmo informático llamado generador de fórmulas calcula todas las fórmulas moleculares que teóricamente se ajustan a una masa determinada con una tolerancia especificada.

Una técnica reciente para la elucidación de estructuras en espectrometría de masas, denominada huella dactilar de iones precursores, identifica piezas individuales de información estructural realizando una búsqueda de los espectros en tándem de la molécula que se investiga contra una biblioteca de espectros de iones producto de iones precursores estructuralmente caracterizados.

Aplicaciones

La espectrometría de masas tiene usos tanto cualitativos como cuantitativos. Estos incluyen identificar compuestos desconocidos, determinar la composición isotópica de elementos en una molécula y determinar la estructura de un compuesto al observar su fragmentación. Otros usos incluyen la cuantificación de la cantidad de un compuesto en una muestra o el estudio de los fundamentos de la química de iones en fase gaseosa (la química de iones y neutros en el vacío). La MS ahora se usa comúnmente en laboratorios analíticos que estudian las propiedades físicas, químicas o biológicas de una gran variedad de compuestos.

Como técnica analítica, posee claras ventajas, tales como: Mayor sensibilidad sobre la mayoría de las otras técnicas analíticas porque el analizador, como filtro de carga de masa, reduce la interferencia de fondo. Excelente especificidad a partir de patrones de fragmentación característicos para identificar desconocidos o confirmar la presencia de compuestos sospechosos. Información sobre el peso molecular, Información sobre la abundancia isotópica de elementos, Datos químicos resueltos temporalmente.

Algunas de las desventajas del método son que a menudo falla en distinguir entre los isómeros ópticos y geométricos y las posiciones de los sustituyentes en las posiciones o-, m- y p- en un anillo aromático. Además, su alcance es limitado en la identificación de hidrocarburos que producen iones fragmentados similares.

Relación de isótopos MS: datación y rastreo de isótopos

La espectrometría de masas también se utiliza para determinar la composición isotópica de elementos dentro de una muestra. Las diferencias de masa entre los isótopos de un elemento son muy pequeñas y los isótopos menos abundantes de un elemento suelen ser muy raros, por lo que se requiere un instrumento muy sensible. Estos instrumentos, a veces denominados espectrómetros de masas de relación isotópica (IR-MS), suelen utilizar un solo imán para desviar un haz de partículas ionizadas hacia una serie de copas de Faraday que convierten los impactos de partículas en corriente eléctrica. Se puede realizar un análisis en línea rápido del contenido de deuterio del agua mediante espectrometría de masas de flujo residual, FA-MS. Probablemente el espectrómetro de masas más sensible y preciso para este propósito es el espectrómetro de masas con acelerador (AMS). Esto se debe a que proporciona la máxima sensibilidad,en relación con el isótopo estable principal. Las proporciones de isótopos son marcadores importantes de una variedad de procesos. Algunas proporciones de isótopos se utilizan para determinar la edad de los materiales, por ejemplo, en la datación por carbono. El marcaje con isótopos estables también se utiliza para la cuantificación de proteínas. (ver caracterización de proteínas a continuación)

Espectrometría de masas por introducción de membrana: medición de gases en solución

La espectrometría de masas de introducción de membrana combina la relación de isótopos MS con una cámara/célula de reacción separada por una membrana permeable a los gases. Este método permite el estudio de los gases a medida que evolucionan en solución. Este método ha sido ampliamente utilizado para el estudio de la producción de oxígeno por Photosystem II.

Análisis de gases traza

Varias técnicas utilizan iones creados en una fuente de iones dedicada inyectada en un tubo de flujo o un tubo de deriva: el tubo de flujo de iones seleccionados (SIFT-MS) y la reacción de transferencia de protones (PTR-MS) son variantes de ionización química dedicadas al análisis de gases traza. de aire, aliento o espacio de cabeza líquido utilizando un tiempo de reacción bien definido que permite calcular las concentraciones de analito a partir de la cinética de reacción conocida sin necesidad de un patrón interno o calibración.

Otra técnica con aplicaciones en el campo del análisis de gases traza es la ionización por electropulverización secundaria (SESI-MS), que es una variante de la ionización por electropulverización. SESI consiste en una pluma de electrospray de solvente acidificado puro que interactúa con vapores neutros. Las moléculas de vapor se ionizan a presión atmosférica cuando la carga se transfiere de los iones formados en el electrospray a las moléculas. Una ventaja de este enfoque es que es compatible con la mayoría de los sistemas ESI-MS.

Sonda atómica

Una sonda atómica es un instrumento que combina espectrometría de masas de tiempo de vuelo y microscopía de evaporación de campo para mapear la ubicación de átomos individuales.

Farmacocinética

La farmacocinética a menudo se estudia mediante espectrometría de masas debido a la naturaleza compleja de la matriz (a menudo sangre u orina) y la necesidad de una alta sensibilidad para observar dosis bajas y datos de puntos de tiempo prolongados. La instrumentación más común utilizada en esta aplicación es LC-MS con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo. La espectrometría de masas en tándem generalmente se emplea para mayor especificidad. Las curvas estándar y los estándares internos se utilizan para la cuantificación de un único producto farmacéutico en las muestras. Las muestras representan diferentes puntos de tiempo a medida que se administra un producto farmacéutico y luego se metaboliza o se elimina del cuerpo. Las muestras en blanco o t=0 tomadas antes de la administración son importantes para determinar los antecedentes y garantizar la integridad de los datos con matrices de muestras tan complejas. Se presta mucha atención a la linealidad de la curva estándar;

Actualmente existe un interés considerable en el uso de espectrometría de masas de muy alta sensibilidad para estudios de microdosificación, que se consideran una alternativa prometedora a la experimentación con animales.

Estudios recientes muestran que la ionización por electropulverización secundaria (SESI) es una técnica poderosa para controlar la cinética de fármacos a través del análisis del aliento. Debido a que la respiración se produce naturalmente, se pueden recopilar fácilmente varios puntos de datos. Esto permite aumentar considerablemente el número de puntos de datos recopilados. En estudios con animales, este enfoque SESI puede reducir el sacrificio de animales. En humanos, el análisis no invasivo del aliento SESI-MS puede ayudar a estudiar la cinética de los fármacos a un nivel personalizado.

Caracterización de proteínas

La espectrometría de masas es un método importante para la caracterización y secuenciación de proteínas. Los dos métodos principales para la ionización de proteínas completas son la ionización por electropulverización (ESI) y la desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI). De acuerdo con el rendimiento y el rango de masas de los espectrómetros de masas disponibles, se utilizan dos enfoques para caracterizar las proteínas. En el primero, las proteínas intactas se ionizan mediante cualquiera de las dos técnicas descritas anteriormente y luego se introducen en un analizador de masas. Este enfoque se conoce como estrategia "de arriba hacia abajo" de análisis de proteínas. Sin embargo, el enfoque de arriba hacia abajo se limita en gran medida a estudios de proteína única de bajo rendimiento. En el segundo, las proteínas se digieren enzimáticamente en péptidos más pequeños utilizando proteasas como la tripsina o la pepsina, ya sea en solución o en gel después de la separación electroforética. También se utilizan otros agentes proteolíticos. La colección de productos peptídicos a menudo se separa mediante cromatografía antes de introducirlos en el analizador de masas. Cuando se utiliza el patrón característico de péptidos para la identificación de la proteína, el método se denomina huella dactilar de masa peptídica (PMF), si la identificación se realiza utilizando los datos de secuencia determinados en el análisis MS en tándem, se denomina secuenciación peptídica de novo. Estos procedimientos de análisis de proteínas también se denominan enfoque "ascendente" y también se han utilizado para analizar la distribución y posición de modificaciones postraduccionales como la fosforilación en proteínas. Cuando se utiliza el patrón característico de péptidos para la identificación de la proteína, el método se denomina huella dactilar de masa peptídica (PMF), si la identificación se realiza utilizando los datos de secuencia determinados en el análisis MS en tándem, se denomina secuenciación peptídica de novo. Estos procedimientos de análisis de proteínas también se denominan enfoque "ascendente" y también se han utilizado para analizar la distribución y posición de modificaciones postraduccionales como la fosforilación en proteínas. Cuando se utiliza el patrón característico de péptidos para la identificación de la proteína, el método se denomina huella dactilar de masa peptídica (PMF), si la identificación se realiza utilizando los datos de secuencia determinados en el análisis MS en tándem, se denomina secuenciación peptídica de novo. Estos procedimientos de análisis de proteínas también se denominan enfoque "ascendente" y también se han utilizado para analizar la distribución y posición de modificaciones postraduccionales como la fosforilación en proteínas.También se está comenzando a utilizar un tercer enfoque, este enfoque intermedio "medio hacia abajo" implica analizar péptidos proteolíticos que son más grandes que el péptido tríptico típico.

Exploración espacial

Como método estándar de análisis, los espectrómetros de masas han llegado a otros planetas y lunas. Dos fueron llevados a Marte por el programa Viking. A principios de 2005, la misión Cassini-Huygens envió un instrumento GC-MS especializado a bordo de la sonda Huygens a través de la atmósfera de Titán, la luna más grande del planeta Saturno. Este instrumento analizó muestras atmosféricas a lo largo de su trayectoria de descenso y pudo vaporizar y analizar muestras de la superficie congelada cubierta de hidrocarburos de Titán una vez que la sonda había aterrizado. Estas medidas comparan la abundancia de isótopos de cada partícula en comparación con la abundancia natural de la Tierra.También a bordo de la nave espacial Cassini-Huygens había un espectrómetro de iones y masas neutras que había estado tomando medidas de la composición atmosférica de Titán, así como la composición de las plumas de Encelado. Un espectrómetro de masas Thermal and Evolved Gas Analyzer fue transportado por el Mars Phoenix Lander lanzado en 2007.

Los espectrómetros de masas también se utilizan ampliamente en misiones espaciales para medir la composición de los plasmas. Por ejemplo, la nave espacial Cassini llevaba el espectrómetro de plasma Cassini (CAPS), que midió la masa de iones en la magnetosfera de Saturno.

Monitor de gas respirado

Los espectrómetros de masas se utilizaron en hospitales para el análisis de gases respiratorios desde alrededor de 1975 hasta finales de siglo. Es probable que algunos todavía estén en uso, pero ninguno se está fabricando actualmente.

Encontrados principalmente en el quirófano, formaban parte de un sistema complejo, en el que las muestras de gas respirado de pacientes sometidos a anestesia se introducen en el instrumento a través de un mecanismo de válvula diseñado para conectar secuencialmente hasta 32 salas al espectrómetro de masas. Una computadora dirigía todas las operaciones del sistema. Los datos recopilados del espectrómetro de masas se entregaron a las habitaciones individuales para que los usara el anestesiólogo.

La singularidad de este espectrómetro de masas de sector magnético puede haber sido el hecho de que un plano de detectores, cada uno posicionado a propósito para recolectar todas las especies de iones que se esperaba que estuvieran en las muestras, permitió que el instrumento informara simultáneamente todos los gases respirados por el paciente.. Aunque el rango de masas se limitó a un poco más de 120 u, la fragmentación de algunas de las moléculas más pesadas anuló la necesidad de un límite de detección más alto.

Espectrometría de masas preparativa

La función principal de la espectrometría de masas es como una herramienta para los análisis químicos basados ​​en la detección y cuantificación de iones según su relación masa-carga. Sin embargo, la espectrometría de masas también se muestra prometedora para la síntesis de materiales. El aterrizaje suave de iones se caracteriza por la deposición de especies intactas sobre superficies a bajas energías cinéticas, lo que impide la fragmentación de las especies incidentes. La técnica de aterrizaje suave se informó por primera vez en 1977 para la reacción de iones que contienen azufre de baja energía en una superficie de plomo.