Ensayo MTT

El ensayo MTT es un ensayo colorimétrico para evaluar la actividad metabólica celular. Las enzimas oxidorreductasa celular dependientes de NAD(P)H pueden, en condiciones definidas, reflejar el número de células viables presentes. Estas enzimas son capaces de reducir el colorante de tetrazolio MTT, que químicamente es bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, a su formazán insoluble, que tiene un color morado. Otros colorantes de tetrazolio estrechamente relacionados, incluidos XTT, MTS y WST, se utilizan junto con el aceptor de electrones intermedio, metosulfato de 1-metoxifenazina (PMS). Con WST-1, que es impermeable a las células, la reducción se produce fuera de la célula mediante el transporte de electrones por la membrana plasmática. Sin embargo, esta explicación tradicionalmente asumida se cuestiona actualmente, ya que también se han encontrado pruebas de la reducción de MTT a formazán en estructuras celulares lipídicas sin participación aparente de oxidorreductasas.

Los ensayos de colorante de tetrazolio también se pueden utilizar para medir la citotoxicidad (pérdida de células viables) o la actividad citostática (cambio de proliferación a inactividad) de posibles agentes medicinales y materiales tóxicos. Los ensayos de MTT normalmente se realizan en la oscuridad ya que el reactivo de MTT es sensible a la luz.

MTT y sales de tetrazolio relacionadas

MTT, un tetrazol amarillo, se reduce a formazán púrpura en las células vivas. Se agrega una solución de solubilización (generalmente dimetilsulfóxido, una solución de etanol acidificada o una solución del detergente dodecilsulfato de sodio en ácido clorhídrico diluido) para disolver el producto de formazán púrpura insoluble en una solución coloreada. La absorbancia de esta solución coloreada se puede cuantificar midiendo a una determinada longitud de onda (normalmente entre 500 y 600 nm) con un espectrofotómetro. El grado de absorción de luz depende del grado de concentración de formazán acumulada dentro de la célula y en la superficie celular. Cuanto mayor es la concentración de formazán, más intenso es el color púrpura y, por tanto, mayor es la absorbancia.

XTT (2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida) para reemplazar el MTT, lo que produce una mayor sensibilidad. y un rango dinámico más alto. El colorante de formazán formado es soluble en agua, evitando una etapa final de solubilización.

Las sales de tetrazolio solubles en agua son alternativas más recientes al MTT: se desarrollaron introduciendo cargas positivas o negativas y grupos hidroxi en el anillo de fenilo de la sal de tetrazolio, o mejor con grupos sulfonato añadidos directa o indirectamente al anillo de fenilo.

MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio), en presencia de metosulfato de fenazina (PMS), produce un producto de formazán que tiene una absorbancia máxima a 490 nm en solución salina tamponada con fosfato. El ensayo MTS a menudo se describe como una prueba de "un solo paso". Ensayo MTT, que ofrece la comodidad de agregar el reactivo directamente al cultivo celular sin los pasos intermitentes requeridos en el ensayo MTT. Sin embargo, esta comodidad hace que el ensayo MTS sea susceptible a interferencias colorimétricas, ya que los pasos intermitentes del ensayo MTT eliminan trazas de compuestos coloreados, mientras que estos permanecen en la placa de microtitulación en el ensayo MTS de un solo paso. Se necesitan precauciones para garantizar la precisión al utilizar este ensayo y existen argumentos sólidos para confirmar los resultados de MTS mediante observaciones cualitativas bajo un microscopio. (Esto, sin embargo, es prudente para todos los ensayos colorimétricos).

WST (sales de tetrazolio solubles en agua) son una serie de otros colorantes solubles en agua para ensayos de MTT, desarrollados para proporcionar diferentes espectros de absorción de los formazanos formados. WST-1 y en particular WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio), son ventajosos sobre MTT en que se reducen fuera de las células, se combinan con el mediador electrónico PMS y producen un formazán soluble en agua. Finalmente, los ensayos WST (1) se pueden leer directamente (a diferencia del MTT que necesita un paso de solubilización), (2) dan una señal más efectiva que el MTT y (3) disminuyen la toxicidad para las células (a diferencia del MTT permeable a las células y sus compuestos insolubles). formazán que se acumulan en el interior de las células).

Importancia

Generalmente se supone que la reducción del colorante de tetrazolio depende de las enzimas oxidorreductasa dependientes de NAD(P)H, en gran medida en el compartimento citosólico de la célula. Por lo tanto, la reducción de MTT y otros colorantes de tetrazolio depende de la actividad metabólica celular debido al flujo de NAD(P)H. Las células con un metabolismo bajo, como los timocitos y los esplenocitos, reducen muy poco MTT. Por el contrario, las células que se dividen rápidamente exhiben altas tasas de reducción de MTT. Es importante tener en cuenta que las condiciones del ensayo pueden alterar la actividad metabólica y, por tanto, la reducción del colorante de tetrazolio sin afectar la viabilidad celular. Además, el mecanismo de reducción de los colorantes de tetrazolio, es decir intracelular (MTT, MTS) vs. extracelular (WST-1), también determinará la cantidad de producto. Además, se han aportado pruebas de la reducción espontánea de MTT en compartimentos/estructuras celulares lipídicas, sin que intervenga catálisis enzimática. Sin embargo, incluso bajo este paradigma alternativo, el ensayo MTT todavía evalúa el potencial de reducción de una célula (es decir, la disponibilidad de compuestos reductores para impulsar la energía celular). Como tal, la interpretación final de la viabilidad celular permanece sin cambios.

Al estudiar la viabilidad de las células sembradas en armazones fibrosos 3D, el grosor de los armazones puede influir en los resultados del ensayo MTT.

Metodología

1. Inocular células en una placa de 96 pocillos a 2.500-5.000 células/pocillo en un volumen de 100 l. Incubar durante la noche a 37 °C con 5 % de CO₂ para permitir la adhesión celular.

2. Añadir solución de MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5 difeniltetrazolio] (10 µl, 5 mg/ml) a cada pocillo e incubar durante 3 h a 37 °C con 5 % de CO₂.

3. Retire el medio de cultivo y los cristales de formazán MTT de cada pocillo utilizando 100 ml de isopropanol acidificado (HCl 0,04 N en isopropanol al 70%). Agite suavemente la placa durante 1 minuto y aspire el contenido por completo con una pipeta multicanal.

4. Transfiera la placa a una nueva placa de 96 pocillos que contenga 100 l de NaOH 0,1 N por pocillo y agite suavemente durante 15 minutos en una plataforma agitadora orbital fijada a baja velocidad (<100 rpm).

5. Aspire completamente el contenido de cada pocillo y transfiera 50 l de la solución de cada pocillo a nuevas placas de 96 pocillos.

6. Leer la absorbancia a 550 nm.

7. La cantidad de formazán producida es directamente proporcional a la cantidad de células vivas presentes en el cultivo y puede usarse para calcular la viabilidad celular. Este ensayo tiene varias ventajas sobre otros métodos para medir la viabilidad celular, incluida su simplicidad, velocidad y sensibilidad. Además, el ensayo MTT se puede adaptar fácilmente para aplicaciones de detección de alto rendimiento.

Observación

La densidad óptica (OD) a 550 nm se utilizará para calcular el porcentaje de resultados de viabilidad utilizando la siguiente ecuación:

% de viabilidad = 100 x OD550e/OD 550b

Donde, OD550e: valor medio de la densidad óptica medida del elemento de prueba.

OD550b – Valor medio de la densidad óptica medida del control negativo.