Electroforesis en gel de poliacrilamida

Imagen de un SDS-PAGE. Los marcadores moleculares (la escalera) están en el carril izquierdo

electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) es una técnica muy utilizada en bioquímica, química forense, genética, biología molecular y biotecnología para separar macromoléculas biológicas, normalmente proteínas o ácidos nucleicos., según su movilidad electroforética. La movilidad electroforética es una función de la longitud, conformación y carga de la molécula. La electroforesis en gel de poliacrilamida es una poderosa herramienta utilizada para analizar muestras de ARN. Cuando el gel de poliacrilamida se desnaturaliza después de la electroforesis, proporciona información sobre la composición de la muestra de las especies de ARN.

La hidratación del acrilonitrilo da como resultado la formación de moléculas de acrilamida (C₃H₅NO) por la nitrilo hidratasa. El monómero de acrilamida se encuentra en estado de polvo antes de la adición de agua. La acrilamida es tóxica para el sistema nervioso humano, por lo que se deben seguir todas las medidas de seguridad al trabajar con ella. La acrilamida es soluble en agua y tras la adición de iniciadores de radicales libres se polimeriza dando como resultado la formación de poliacrilamida. Es útil hacer gel de poliacrilamida a través de la hidratación de acrilamida porque se puede regular el tamaño de los poros. El aumento de las concentraciones de acrilamida da como resultado una disminución del tamaño de los poros después de la polimerización. El gel de poliacrilamida con poros pequeños ayuda a examinar mejor las moléculas más pequeñas, ya que las moléculas pequeñas pueden entrar en los poros y viajar a través del gel, mientras que las moléculas grandes quedan atrapadas en las aberturas de los poros.

Al igual que con todas las formas de electroforesis en gel, las moléculas se pueden procesar en su estado nativo, conservando las moléculas' estructura de orden superior. Este método se llama Native-PAGE. Alternativamente, se puede agregar un desnaturalizante químico para eliminar esta estructura y convertir la molécula en una molécula no estructurada cuya movilidad depende solo de su longitud (porque la proteína-SDS compleja todo tienen una relación masa-carga similar). Este procedimiento se llama SDS-PAGE. La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) es un método de separación de moléculas basado en la diferencia de su peso molecular. Al pH al que se lleva a cabo la electroforesis en gel, las moléculas de SDS tienen carga negativa y se unen a las proteínas en una proporción establecida, aproximadamente una molécula de SDS por cada 2 aminoácidos. De esta forma, el detergente proporciona a todas las proteínas una relación carga-masa uniforme. Al unirse a las proteínas, el detergente destruye su estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria desnaturalizándolas y convirtiéndolas en cadenas polipeptídicas lineales cargadas negativamente. Cuando se someten a un campo eléctrico en PAGE, las cadenas polipeptídicas cargadas negativamente viajan hacia el ánodo con diferente movilidad. Su movilidad, o la distancia recorrida por las moléculas, es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Al comparar la relación relativa de la distancia recorrida por cada proteína con la longitud del gel (Rf), se pueden sacar conclusiones sobre el peso molecular relativo de las proteínas, donde la longitud del gel está determinada por la distancia recorrida por una molécula pequeña. como un tinte de seguimiento.

Para los ácidos nucleicos, la urea es el desnaturalizante más utilizado. Para las proteínas, el dodecilsulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que se aplica a las muestras de proteínas para recubrirlas con el fin de impartir dos cargas negativas (de cada molécula de SDS) a cada dos aminoácidos de la proteína desnaturalizada. El 2-mercaptoetanol también se puede usar para romper los enlaces disulfuro que se encuentran entre los complejos proteicos, lo que ayuda a desnaturalizar aún más la proteína. En la mayoría de las proteínas, la unión de SDS a las cadenas polipeptídicas imparte una distribución uniforme de la carga por unidad de masa, lo que da como resultado un fraccionamiento por tamaño aproximado durante la electroforesis. Las proteínas que tienen un mayor contenido hidrofóbico (por ejemplo, muchas proteínas de membrana y aquellas que interactúan con los tensioactivos en su entorno nativo) son intrínsecamente más difíciles de tratar con precisión con este método, debido a la mayor variabilidad en la proporción de SDS unido. Desde el punto de vista del procedimiento, el uso conjunto de Native y SDS-PAGE se puede utilizar para purificar y separar las distintas subunidades de la proteína. Native-PAGE mantiene intacta la forma oligomérica y mostrará una banda en el gel que es representativa del nivel de actividad. SDS-PAGE desnaturalizará y separará la forma oligomérica en sus monómeros, mostrando bandas representativas de sus pesos moleculares. Estas bandas se pueden utilizar para identificar y evaluar la pureza de la proteína.

Procedimiento

Preparación de muestras

Las muestras pueden ser cualquier material que contenga proteínas o ácidos nucleicos. Estos pueden derivarse biológicamente, por ejemplo, de células, tejidos, virus, muestras ambientales o proteínas purificadas procarióticas o eucarióticas. En el caso de células o tejidos sólidos, a menudo primero se descomponen mecánicamente usando una licuadora (para volúmenes de muestra más grandes), usando un homogeneizador (volúmenes más pequeños), sonicador o usando ciclos de alta presión, y una combinación de bioquímicos y Se pueden utilizar técnicas mecánicas, incluidos varios tipos de filtración y centrifugación, para separar diferentes compartimentos celulares y orgánulos antes de la electroforesis. También pueden usarse como analitos biomoléculas sintéticas tales como oligonucleótidos.

Reducción de un vínculo disulfuro típico por DTT a través de dos reacciones de intercambio secuencial de disulfuro.

La muestra a analizar se mezcla opcionalmente con un desnaturalizante químico si así se desea, generalmente SDS para proteínas o urea para ácidos nucleicos. SDS es un detergente aniónico que desnaturaliza las estructuras secundarias y terciarias no unidas por disulfuro y, además, aplica una carga negativa a cada proteína en proporción a su masa. La urea rompe los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases del ácido nucleico, lo que hace que las hebras constituyentes se separen. Calentar las muestras a al menos 60 °C promueve aún más la desnaturalización.

Además de SDS, las proteínas pueden calentarse brevemente hasta casi hervir en presencia de un agente reductor, como ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol (beta-mercaptoetanol/BME), que desnaturaliza aún más las proteínas al reducir enlaces disulfuro, superando así algunas formas de plegamiento de proteínas terciarias y rompiendo la estructura de proteínas cuaternarias (subunidades oligoméricas). Esto se conoce como reducción de SDS-PAGE.

Se puede agregar un tinte de seguimiento a la solución. Por lo general, tiene una movilidad electroforética más alta que los analitos para permitir que el experimentador siga el progreso de la solución a través del gel durante la ejecución electroforética.

Preparación de geles de acrilamida

Los geles normalmente constan de acrilamida, bisacrilamida, el desnaturalizante opcional (SDS o urea) y un tampón con un pH ajustado. La solución se puede desgasificar al vacío para evitar la formación de burbujas de aire durante la polimerización. Alternativamente, se puede agregar butanol al gel de resolución (para proteínas) después de verterlo, ya que el butanol elimina las burbujas y suaviza la superficie. Se agrega una fuente de radicales libres y un estabilizador, como persulfato de amonio y TEMED para iniciar la polimerización. La reacción de polimerización crea un gel debido a la bisacrilamida añadida, que puede formar enlaces cruzados entre dos moléculas de acrilamida. La proporción de bisacrilamida a acrilamida se puede variar para propósitos especiales, pero generalmente es de aproximadamente 1 parte en 35. La concentración de acrilamida del gel también se puede variar, generalmente en el rango de 5% a 25%. Los geles con porcentajes más bajos son mejores para resolver moléculas de peso molecular muy alto, mientras que se necesitan porcentajes mucho más altos de acrilamida para resolver proteínas más pequeñas. El diámetro de poro promedio de los geles de poliacrilamida está determinado por la concentración total de acrilamidas (% T con T = concentración total de acrilamida y bisacrilamida) y la concentración del reticulante bisacrilamida (% C con C = concentración de bisacrilamida). El tamaño de poro se reduce recíprocamente al %T. En cuanto al %C, una concentración del 5% produce los poros más pequeños, ya que la influencia de la bisacrilamida en el tamaño del poro tiene forma de parábola con un vértice al 5%.

Los geles generalmente se polimerizan entre dos placas de vidrio en una rueda de gel, con un peine insertado en la parte superior para crear los pocillos de muestra. Después de polimerizar el gel, se puede quitar el peine y el gel está listo para la electroforesis.

Electroforesis

Se utilizan varios sistemas de tampones en PAGE según la naturaleza de la muestra y el objetivo experimental. Los tampones utilizados en el ánodo y el cátodo pueden ser iguales o diferentes.

Se aplica un campo eléctrico a través del gel, lo que hace que las proteínas o los ácidos nucleicos con carga negativa migren a través del gel alejándose del electrodo negativo (que es el cátodo, dado que se trata de una celda electrolítica en lugar de galvánica) y hacia el positivo. electrodo (el ánodo). Dependiendo de su tamaño, cada biomolécula se mueve de manera diferente a través de la matriz del gel: las moléculas pequeñas pasan más fácilmente a través de los poros del gel, mientras que las más grandes tienen más dificultad. El gel se ejecuta por lo general durante unas pocas horas, aunque esto depende del voltaje aplicado a través del gel; la migración se produce más rápidamente con voltajes más altos, pero estos resultados suelen ser menos precisos que con voltajes más bajos. Después de la cantidad de tiempo establecida, las biomoléculas han migrado diferentes distancias según su tamaño. Las biomoléculas más pequeñas viajan más abajo en el gel, mientras que las más grandes permanecen más cerca del punto de origen. Por lo tanto, las biomoléculas pueden separarse aproximadamente según el tamaño, que depende principalmente del peso molecular en condiciones de desnaturalización, pero también depende de la conformación de orden superior en condiciones nativas. La movilidad del gel se define como la tasa de migración recorrida con un gradiente de voltaje de 1 V/cm y tiene unidades de cm²/seg/V. Para fines analíticos, la movilidad relativa de las biomoléculas, R_f, la relación entre la distancia que la molécula viajó en el gel y la distancia total de viaje de un colorante de rastreo se representa frente a el peso molecular de la molécula (o, a veces, el logaritmo de MW, o más bien el M_r, radio molecular). Estos gráficos típicamente lineales representan los marcadores estándar o las curvas de calibración que se usan ampliamente para la estimación cuantitativa de una variedad de tamaños biomoleculares.

Sin embargo, ciertas glicoproteínas se comportan de forma anómala en los geles SDS. Además, también se informa que el análisis de proteínas más grandes que van desde 250.000 a 600.000 Da es problemático debido al hecho de que tales polipéptidos se mueven incorrectamente en los sistemas de gel que se usan normalmente.

Procesamiento posterior

Dos SDS-PAGE-gels después de una carrera completa

Después de la electroforesis, el gel se puede teñir (para proteínas, más comúnmente con azul brillante de Coomassie R-250 o autorradiografía; para ácidos nucleicos, bromuro de etidio o tinción de plata), lo que permite la visualización de las proteínas separadas, o procesado adicionalmente (p. ej., Western blot). Después de la tinción, las biomoléculas de diferentes especies aparecen como bandas distintas dentro del gel. Es común ejecutar marcadores de tamaño de peso molecular de peso molecular conocido en un carril separado en el gel para calibrar el gel y determinar la masa molecular aproximada de biomoléculas desconocidas comparando la distancia recorrida en relación con el marcador.

Para las proteínas, SDS-PAGE suele ser la primera opción como ensayo de pureza debido a su fiabilidad y facilidad. La presencia de SDS y el paso de desnaturalización hacen que las proteínas se separen, aproximadamente en función del tamaño, pero puede ocurrir una migración aberrante de algunas proteínas. Diferentes proteínas también pueden teñirse de manera diferente, lo que interfiere con la cuantificación por tinción. PAGE también se puede utilizar como técnica preparatoria para la purificación de proteínas. Por ejemplo, la electroforesis en gel de poliacrilamida nativa continua preparativa cuantitativa (QPNC-PAGE) es un método para separar metaloproteínas nativas en matrices biológicas complejas.

Ingredientes químicos y sus funciones

gel de poliacrilamida (PAG) se conocía como un medio de inclusión potencial para seccionar tejidos desde 1964, y dos grupos independientes emplearon PAG en electroforesis en 1959. Posee varias características electroforéticamente deseables que lo convierten en un medio versátil. Es un gel sintético, termoestable, transparente, fuerte, químicamente relativamente inerte y puede prepararse con una amplia gama de tamaños de poro promedio. El tamaño de poro de un gel y la reproducibilidad en el tamaño de poro del gel están determinados por tres factores, la cantidad total de acrilamida presente (%T) (T = Concentración total de monómero de acrilamida y bisacrilamida), la cantidad de reticulante (%C) (C = concentración de bisacrilamida), y el tiempo de polimerización de la acrilamida (cf. QPNC-PAGE). El tamaño de los poros disminuye al aumentar el %T; con reticulación, 5%C da el tamaño de poro más pequeño. Cualquier aumento o disminución en %C desde 5% aumenta el tamaño de poro, ya que el tamaño de poro con respecto a %C es una función parabólica con vértice en 5%C. Esto parece deberse a la agrupación no homogénea de las hebras de polímero dentro del gel. Este material de gel también puede soportar gradientes de alto voltaje, es apto para varios procedimientos de tinción y decoloración, y puede digerirse para extraer fracciones separadas o secarse para autorradiografía y registro permanente.

Componentes

Los geles de poliacrilamida están compuestos por un gel de apilamiento y un gel separador. Los geles de apilamiento tienen una mayor porosidad en relación con el gel de separación y permiten que las proteínas migren en un área concentrada. Además, los geles de apilamiento suelen tener un pH de 6,8, ya que las moléculas neutras de glicina permiten una movilidad de proteínas más rápida. Los geles separadores tienen un pH de 8,8, donde la glicina aniónica ralentiza la movilidad de las proteínas. Los geles separadores permiten la separación de proteínas y tienen una porosidad relativamente menor. Aquí, las proteínas se separan según el tamaño (en SDS-PAGE) y el tamaño/carga (PAGE nativa).

El tampón químico estabiliza el valor de pH al valor deseado dentro del propio gel y en el tampón de electroforesis. La elección del tampón también afecta la movilidad electroforética de los contraiones del tampón y, por lo tanto, la resolución del gel. El tampón también debe ser no reactivo y no modificar ni reaccionar con la mayoría de las proteínas. Se pueden usar diferentes tampones como tampones de cátodo y ánodo, respectivamente, según la aplicación. Se pueden usar múltiples valores de pH dentro de un solo gel, por ejemplo, en electroforesis DISC. Los tampones comunes en PAGE incluyen Tris, Bis-Tris o imidazol.

El contraión equilibra la carga intrínseca del ion tampón y también afecta la fuerza del campo eléctrico durante la electroforesis. Los iones altamente cargados y móviles a menudo se evitan en los tampones de cátodo SDS-PAGE, pero se pueden incluir en el propio gel, donde migra antes que la proteína. En aplicaciones como DISC SDS-PAGE, los valores de pH dentro del gel pueden variar para cambiar la carga promedio de los contraiones durante la ejecución para mejorar la resolución. Los contraiones populares son la glicina y la tricina. La glicina se ha utilizado como fuente de iones arrastrados o iones lentos porque su pKa es 9,69 y la movilidad del glicinato es tal que la movilidad efectiva se puede establecer en un valor inferior al de las proteínas más lentas conocidas de carga negativa neta en el rango de pH. El pH mínimo de este rango es de aproximadamente 8,0.

Acrilamida (C₃H₅ NO; mW: 71,08) cuando se disuelve en agua, tiene lugar una autopolimerización espontánea y lenta de la acrilamida, que une las moléculas en forma de cabeza sobre cola para formar polímeros monocatenarios largos. La presencia de un sistema generador de radicales libres acelera en gran medida la polimerización. Este tipo de reacción se conoce como polimerización por adición de vinilo. Una solución de estas cadenas de polímeros se vuelve viscosa pero no forma un gel, porque las cadenas simplemente se deslizan unas sobre otras. La formación de gel requiere la unión de varias cadenas entre sí. La acrilamida es cancerígena, una neurotoxina y una toxina reproductiva. También es esencial almacenar la acrilamida en un lugar fresco, oscuro y seco para reducir la autopolimerización y la hidrólisis.

Bisacrilamida (N,N′-metilenbisacrilamida) (C₇H₁₀N₂O₂; mW: 154.17) es el agente reticulante más utilizado para geles de poliacrilamida. Químicamente se puede considerar como dos moléculas de acrilamida acopladas cabeza a cabeza en sus extremos no reactivos. La bisacrilamida puede entrecruzar dos cadenas de poliacrilamida entre sí, dando como resultado un gel.

Dodecil sulfato de sodio (SDS) (C₁₂H ₂₅NaO₄S; mW: 288,38) (solo se usa en geles de proteínas desnaturalizantes) es un agente detergente fuerte que se usa para desnaturalizar proteínas a polipéptidos individuales. Esta desnaturalización, que se conoce como desnaturalización reconstructiva, no se logra mediante la linealización total de la proteína, sino a través de un cambio conformacional a una combinación de estructuras secundarias de espiral aleatoria y hélice α. Cuando una mezcla de proteínas se calienta a 100 °C en presencia de SDS, el detergente envuelve el esqueleto del polipéptido. Se une a polipéptidos en una relación de peso constante de 1,4 g SDS/g de polipéptido. En este proceso, las cargas intrínsecas de los polipéptidos se vuelven insignificantes en comparación con las cargas negativas aportadas por SDS. Por lo tanto, los polipéptidos después del tratamiento se convierten en estructuras similares a varillas que poseen una densidad de carga uniforme, es decir, la misma carga negativa neta por unidad de peso. La movilidad electroforética de estas proteínas es una función lineal de los logaritmos de sus pesos moleculares. Sin SDS, diferentes proteínas con pesos moleculares similares migrarían de manera diferente debido a las diferencias en la relación masa-carga, ya que cada proteína tiene un punto isoeléctrico y un peso molecular particular a su estructura primaria. Esto se conoce como PÁGINA nativa. La adición de SDS resuelve este problema, ya que se une a la proteína y la desdobla, dando una carga negativa casi uniforme a lo largo del polipéptido.

Urea (CO(NH₂)₂; mW: 60,06) es un agente caotrópico que aumenta la entropía del sistema al interferir con las interacciones intramoleculares mediadas por fuerzas no covalentes como los enlaces de hidrógeno y las fuerzas de van der Waals. La estructura macromolecular depende del efecto neto de estas fuerzas, por lo tanto, se deduce que un aumento en los solutos caotrópicos desnaturaliza las macromoléculas,

Persulfato de amonio (APS) (N₂H₈ S₂O₈; mW: 228,2) es una fuente de radicales libres y se usa a menudo como iniciador para la formación de gel. Una fuente alternativa de radicales libres es la riboflavina, que genera radicales libres en una reacción fotoquímica.

TEMED (N, N, N′, N′-tetrametiletilendiamina) (C₆H₁₆N₂; mW: 116,21) estabiliza los radicales libres y mejora la polimerización. La velocidad de polimerización y las propiedades del gel resultante dependen de las concentraciones de radicales libres. El aumento de la cantidad de radicales libres da como resultado una disminución en la longitud promedio de la cadena del polímero, un aumento en la turbidez del gel y una disminución en la elasticidad del gel. Disminuir la cantidad muestra el efecto inverso. Se deben utilizar las concentraciones catalíticas más bajas que permitan la polimerización en un período de tiempo razonable. APS y TEMED se utilizan típicamente en concentraciones aproximadamente equimolares en el rango de 1 a 10 mM.

Químicos para procesamiento y visualización

PAGE de proteínas rotavirus manchadas con Coomassie azul

Los siguientes productos químicos y procedimientos se utilizan para procesar el gel y las muestras de proteínas visualizadas en él.

Tinte de seguimiento; Como las proteínas y los ácidos nucleicos son en su mayoría incoloros, no se puede seguir fácilmente su progreso a través del gel durante la electroforesis. Por lo tanto, los colorantes aniónicos de una movilidad electroforética conocida se incluyen normalmente en el tampón de muestra PAGE. Un tinte de seguimiento muy común es el azul de bromofenol (BPB, 3', 3', 5', 5' tetrabromofenolsulfonftaleína). Este colorante se colorea a pH alcalino y neutro y es una pequeña molécula cargada negativamente que se mueve hacia el ánodo. Al ser una molécula altamente móvil, se adelanta a la mayoría de las proteínas. Cuando alcanza el extremo anódico del medio de electroforesis, se detiene la electroforesis. Puede unirse débilmente a algunas proteínas e impartir un color azul. Otros tintes de seguimiento comunes son el cianol de xileno, que tiene una movilidad más baja, y el Orange G, que tiene una movilidad más alta.

Ayuda de carga; la mayoría de los sistemas PAGE se cargan desde arriba en pozos dentro del gel. Para garantizar que la muestra se hunda hasta el fondo del gel, el tampón de muestra se complementa con aditivos que aumentan la densidad de la muestra. Estos aditivos deben ser no iónicos y no reactivos con las proteínas para evitar interferir con la electroforesis. Los aditivos comunes son el glicerol y la sacarosa.

Azul brillante Coomassie R-250 (CBB)(C₄₅H₄₄N₃NaO₇S₂; mW: 825,97) es la tinción de proteína más popular. Es un colorante aniónico, que no se une específicamente a las proteínas. La estructura de CBB es predominantemente no polar y generalmente se usa en solución metanólica acidificada con ácido acético. Las proteínas del gel se fijan con ácido acético y se tiñen simultáneamente. El exceso de tinte incorporado en el gel se puede eliminar decolorando con la misma solución sin el tinte. Las proteínas se detectan como bandas azules sobre un fondo claro. Como SDS también es aniónico, puede interferir con el proceso de tinción. Por lo tanto, se recomienda un gran volumen de solución de tinción, al menos diez veces el volumen del gel.

El bromuro de etidio (EtBr) es una tinción de ácido nucleico popular. EtBr permite visualizar fácilmente el ADN o el ARN en un gel, ya que EtBr muestra un color naranja fluorescente bajo la luz ultravioleta. El bromuro de etidio se une a las cadenas de ácido nucleico a través del proceso de intercalación. Si bien el bromuro de etidio es una tinción popular, es importante tener cuidado al usar EtBr, ya que es un carcinógeno conocido. Debido a este hecho, muchos investigadores optan por usar colorantes como SYBR Green y SYBR Safe, que son alternativas más seguras al EtBr. EtBr se usa simplemente agregándolo a la mezcla de gel. Una vez que el gel se ha corrido, el gel se puede ver mediante el uso de un sistema de documentación fotográfica.

La tinción con plata se usa cuando se necesita un método de detección más sensible, ya que la tinción clásica con azul brillante de Coomassie generalmente puede detectar una banda de proteína de 50 ng, la tinción con plata aumenta la sensibilidad normalmente entre 10 y 100 veces más. Esto se basa en la química del revelado fotográfico. Las proteínas se fijan al gel con una solución diluida de metanol y luego se incuban con una solución ácida de nitrato de plata. Los iones de plata se reducen a su forma metálica mediante formaldehído a pH alcalino. Una solución ácida, como el ácido acético, detiene el desarrollo. Kerenyi y Gallyas introdujeron la tinción con plata como un procedimiento sensible para detectar trazas de proteínas en geles. La técnica se ha extendido al estudio de otras macromoléculas biológicas que se han separado en diversos soportes. Muchas variables pueden influir en la intensidad del color y cada proteína tiene sus propias características de tinción; cristalería limpia, reactivos puros y agua de la más alta pureza son los puntos clave para una tinción exitosa. La tinción con plata se desarrolló en el siglo XIV para colorear la superficie del vidrio. Se ha utilizado ampliamente para este propósito desde el siglo XVI. El color producido por las primeras manchas de plata oscilaba entre un amarillo claro y un rojo anaranjado. Camillo Golgi perfeccionó la tinción de plata para el estudio del sistema nervioso. El método de Golgi tiñe un número limitado de células al azar en su totalidad.

La autorradiografía, también utilizada para la detección de bandas de proteínas después de la electroforesis en gel, utiliza isótopos radiactivos para marcar las proteínas, que luego se detectan mediante el uso de una película de rayos X.

La transferencia Western es un proceso mediante el cual las proteínas separadas en el gel de acrilamida se transfieren electroforéticamente a una membrana estable y manipulable, como una membrana de nitrocelulosa, nailon o PVDF. Entonces es posible aplicar técnicas inmunoquímicas para visualizar las proteínas transferidas, así como identificar con precisión aumentos o disminuciones relativas de la proteína de interés.