Daño del ADN

El daño del ADN es claramente diferente de la mutación, aunque ambos son tipos de errores en el ADN. El daño del ADN es una estructura química anormal en el ADN, mientras que una mutación es un cambio en la secuencia de pares de bases. Los daños en el ADN provocan cambios en la estructura del material genético e impiden que el mecanismo de replicación funcione y funcione correctamente.

El daño y la mutación del ADN tienen diferentes consecuencias biológicas. Si bien la mayoría de los daños en el ADN pueden repararse, dicha reparación no es 100% eficiente. Los daños en el ADN no reparados se acumulan en las células que no se replican, como las células del cerebro o los músculos de los mamíferos adultos, y pueden provocar el envejecimiento. (Consulte también la teoría del envejecimiento del daño del ADN). En las células que se replican, como las células que recubren el colon, se producen errores en la replicación después de daños en la hebra molde de ADN o durante la reparación de daños en el ADN. Estos errores pueden dar lugar a mutaciones o alteraciones epigenéticas. Ambos tipos de alteración pueden replicarse y transmitirse a generaciones de células posteriores. Estas alteraciones pueden cambiar la función de los genes o la regulación de la expresión de genes y posiblemente contribuir a la progresión del cáncer.

A lo largo del ciclo celular existen varios puntos de control para asegurar que la célula está en buenas condiciones para progresar a la mitosis. Los tres puntos de control principales están en G1/s, G2/m y en el punto de control del ensamblaje del huso que regula la progresión a través de la anafase. Los puntos de control G1 y G2 implican escanear el ADN dañado. Durante la fase S, la célula es más vulnerable al daño del ADN que cualquier otra parte del ciclo celular. El punto de control G2 verifica el ADN dañado y la replicación completa del ADN. Daño en el ADNes una alteración en la estructura química del ADN, como una ruptura en una hebra de ADN, una base que falta en la columna vertebral del ADN o una base modificada químicamente, como 8-OHdG. El daño al ADN puede ocurrir de forma natural o a través de factores ambientales. La respuesta al daño del ADN (DDR) es una vía de transducción de señales compleja que reconoce cuando el ADN está dañado e inicia la respuesta celular al daño.

Tipos

El daño al ADN que ocurre naturalmente puede resultar de procesos metabólicos o hidrolíticos. El metabolismo libera compuestos que dañan el ADN, incluidas especies reactivas de oxígeno, especies reactivas de nitrógeno, especies reactivas de carbonilo, productos de peroxidación de lípidos y agentes alquilantes, entre otros, mientras que la hidrólisis escinde los enlaces químicos en el ADN. Los daños oxidativos del ADN que ocurren naturalmente surgen al menos 10 000 veces por célula por día en humanos y hasta 100 000 por célula por día en ratas, como se documenta a continuación.

El daño oxidativo del ADN puede producir más de 20 tipos de bases alteradas, así como roturas de una sola hebra.

Otros tipos de daños endógenos en el ADN, que se indican a continuación con sus frecuencias de aparición, incluyen despurinaciones, despirimidinaciones, roturas de doble cadena, O6-metilguaninas y desaminación de citosina.

El ADN también puede dañarse a través de factores ambientales. Agentes ambientales como la luz ultravioleta, la radiación ionizante y los productos químicos genotóxicos. Las horquillas de replicación pueden detenerse debido al ADN dañado y las roturas de doble cadena también son una forma de daño en el ADN.

Frecuencias

La siguiente lista muestra algunas frecuencias con las que surgen nuevos daños naturales en el ADN por día, debido a procesos celulares endógenos.

• daños oxidativos
  • Humanos, por célula por día
    • 10.00011.5002.800 daños específicos 8-oxoGua, 8-oxodG más 5-HMUra2.800 daños específicos 8-oxoGua, 8-oxodG más 5-HMUra
  • Ratas, por celda por día
    • 74.00086.000100.000
  • Ratones, por celda por día
    • 34.000 daños específicos 8-oxoGua, 8-oxodG más 5-HMUra47.000 daños específicos oxo8dG en hígado de ratón28.000 daños específicos 8-oxoGua, 8-oxodG, 5-HMUra
• depuraciones
  • Células de mamífero, por célula por día
    • 2.000 a 10.0009.00012.00013.920
• despirimidinaciones
  • Células de mamífero, por célula por día
    • 600696
• Roturas de una sola hebra
  • Células de mamífero, por célula por día
    • 55,200
• Roturas de doble hebra
  • Células humanas, por ciclo celular
    • 1050
• O6-metilguaninas
  • Células de mamífero, por célula por día
    • 3,120
• desaminación de citosina
  • Células de mamífero, por célula por día
    • 192

Otro daño endógeno importante en el ADN es M1dG, abreviatura de (3-(2'-desoxi-beta-D-eritropentofuranosil)-pirimido[1,2-a]-purina-10(3H)-ona). La excreción en la orina (que probablemente refleja la tasa de aparición) de M1dG puede ser hasta 1000 veces menor que la de 8-oxodG. Sin embargo, una medida más importante puede ser el nivel de estado estacionario en el ADN, que refleja tanto la tasa de ocurrencia como la tasa de reparación del ADN. El nivel de estado estacionario de M1dG es mayor que el de 8-oxodG. Esto indica que algunos daños en el ADN producidos a un ritmo bajo pueden ser difíciles de reparar y permanecer en el ADN en un nivel elevado de estado estacionario. Tanto M1dG como 8-oxodG son mutagénicos.

Niveles de estado estacionario

Los niveles de estado estacionario de los daños en el ADN representan el equilibrio entre la formación y la reparación. Se han caracterizado más de 100 tipos de daños oxidativos en el ADN, y el 8-oxodG constituye aproximadamente el 5 % de los daños oxidativos en estado estacionario en el ADN. Helbock et al. estimó que había 24.000 aductos de ADN oxidativo en estado estacionario por célula en ratas jóvenes y 66.000 aductos por célula en ratas viejas. Esto refleja la acumulación de daño en el ADN con la edad. La acumulación de daño en el ADN con la edad se describe con más detalle en la teoría del envejecimiento del daño en el ADN.

Swenberg et al. cantidades medias medidas de daños seleccionados en el ADN endógeno en estado estacionario en células de mamíferos. Los siete daños más comunes que evaluaron se muestran en la Tabla 1.

Al evaluar los daños en estado estacionario en tejidos específicos de la rata, Nakamura y Swenberg indicaron que el número de sitios abásicos variaba desde aproximadamente 50 000 por célula en hígado, riñón y pulmón hasta aproximadamente 200 000 por célula en el cerebro.

Vías biomoleculares

Las proteínas que promueven el daño endógeno del ADN se identificaron en un artículo de 2019 como proteínas de "daño" del ADN (DDP). Los mecanismos DDP se dividen en 3 grupos:

• aumento de oxígeno reactivo por transportadores transmembrana,
• pérdida de cromosomas por unión de replisoma,
• estancamiento de la replicación por factores de transcripción.

Los homólogos humanos de DDP están sobrerrepresentados en los impulsores de cáncer conocidos, y sus ARN en los tumores predicen una fuerte mutagénesis y un mal pronóstico.

Reparación del ADN dañado

En presencia de daño en el ADN, la célula puede reparar el daño o inducir la muerte celular si el daño no se puede reparar.

Tipos

En esta tabla se muestran los siete tipos principales de reparación del ADN y una vía de tolerancia al daño, las lesiones que abordan y la precisión de la reparación (o tolerancia). Para obtener una breve descripción de los pasos en la reparación, consulte los mecanismos de reparación del ADN o consulte cada vía individual.

Envejecimiento y cáncer

El diagrama esquemático indica las funciones de la reparación insuficiente del ADN en el envejecimiento y el cáncer, y la función de la apoptosis en la prevención del cáncer. Un exceso de daño natural en el ADN, debido a deficiencias hereditarias en enzimas de reparación del ADN en particular, puede provocar un envejecimiento prematuro o un mayor riesgo de cáncer (ver trastorno por deficiencia en la reparación del ADN). Por otro lado, la capacidad de desencadenar la apoptosis en presencia de un exceso de daño en el ADN no reparado es fundamental para la prevención del cáncer.

Apoptosis y prevención del cáncer

Las proteínas de reparación del ADN a menudo se activan o inducen cuando el ADN ha sufrido daños. Sin embargo, un daño excesivo en el ADN puede iniciar la apoptosis (es decir, muerte celular programada) si el nivel de daño en el ADN supera la capacidad de reparación. La apoptosis puede evitar que las células con exceso de daño en el ADN sufran mutagénesis y progresen a cáncer.

La inflamación a menudo es causada por una infección, como la del virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC) o Helicobacter pylori. La inflamación crónica también es una característica central de la obesidad. Tal inflamación causa daño oxidativo en el ADN. Esto se debe a la inducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) por varios mediadores inflamatorios intracelulares. Las infecciones por VHB y VHC, en particular, provocan aumentos de 10.000 y 100.000 veces en la producción de ROS intracelular, respectivamente. Las ROS inducidas por la inflamación que causan daño en el ADN pueden desencadenar la apoptosis, pero también pueden causar cáncer si los procesos de reparación y apoptosis no son lo suficientemente protectores.

Los ácidos biliares, almacenados en la vesícula biliar, se liberan en el intestino delgado en respuesta a la grasa en la dieta. Los niveles más altos de grasa provocan una mayor liberación. Los ácidos biliares causan daños en el ADN, incluido el daño oxidativo del ADN, roturas de ADN de doble cadena, aneuploidía y rotura de cromosomas. Los niveles normales altos del ácido biliar ácido desoxicólico causan apoptosis en las células del colon humano, pero también pueden provocar cáncer de colon si la reparación y las defensas apoptóticas son insuficientes.

La apoptosis sirve como un mecanismo de protección contra la tumorigénesis. Previene el aumento de la mutagénesis que podría causar el exceso de daño en el ADN, tras la replicación.

Al menos 17 proteínas de reparación del ADN, distribuidas en cinco vías de reparación del ADN, tienen una "doble función" en respuesta al daño del ADN. Con niveles moderados de daño en el ADN, estas proteínas inician o contribuyen a la reparación del ADN. Sin embargo, cuando hay niveles excesivos de daño en el ADN, desencadenan la apoptosis.

Respuesta al daño del ADN

El empaquetamiento del ADN eucariótico en la cromatina es una barrera para todos los procesos basados ​​en el ADN que requieren la acción de una enzima. Para la mayoría de los procesos de reparación del ADN, la cromatina debe remodelarse. En eucariotas, los complejos de remodelación de cromatina dependientes de ATP y las enzimas modificadoras de histonas son dos factores que actúan para lograr este proceso de remodelación después de que se produce el daño del ADN. Por lo general, siguen otros pasos de reparación del ADN, que involucran múltiples enzimas. A continuación se describen algunas de las primeras respuestas al daño del ADN, junto con su momento. Se presentan descripciones más completas de las vías de reparación del ADN en los artículos que describen cada vía. Al menos 169 enzimas están involucradas en las vías de reparación del ADN.

Reparación de escisión de base

Las bases oxidadas en el ADN se producen en células tratadas con colorante Hoechst seguido de microirradiación con luz de 405 nm. Dichas bases oxidadas pueden repararse mediante reparación por escisión de base.

Cuando la luz de 405 nm se enfoca a lo largo de una línea estrecha dentro del núcleo de una célula, aproximadamente 2,5 segundos después de la irradiación, la enzima de remodelación de la cromatina Alc1 logra la mitad del reclutamiento máximo en la microlínea irradiada. La línea de cromatina que fue irradiada luego se relaja, expandiéndose de lado a lado durante los siguientes 60 segundos.

Dentro de los 6 segundos de la irradiación con luz de 405 nm, hay un reclutamiento medio máximo de OGG1 en la línea irradiada. OGG1 es una enzima que elimina el daño oxidativo del ADN 8-oxo-dG del ADN. La eliminación de 8-oxo-dG, durante la reparación por escisión de base, ocurre con una vida media de 11 minutos.

Reparación por escisión de nucleótidos

La luz ultravioleta (UV) induce la formación de daños en el ADN, incluidos los dímeros de pirimidina (como los dímeros de timina) y los fotoproductos 6,4. Estos tipos de daños "voluminosos" se reparan mediante la reparación por escisión de nucleótidos.

Después de la irradiación con luz ultravioleta, DDB2, en un complejo con DDB1, la proteína ubiquitina ligasa CUL4A y la proteína de dedo RING ROC1, se asocia con sitios de daño dentro de la cromatina. La mitad de la asociación máxima se produce en 40 segundos. PARP1 también se asocia dentro de este período. La proteína PARP1 se une tanto a DDB1 como a DDB2 y luego se PARila (crea una cadena de poli-ADP ribosa) en DDB2 que atrae a la proteína de remodelación de ADN ALC1. ALC1 relaja la cromatina en los sitios de daño UV al ADN. Además, el complejo de ubiquitina E3 ligasa DDB1-CUL4A lleva a cabo la ubiquitinación de las histonas centrales H2A, H3 y H4, así como la proteína de reparación XPC, que ha sido atraída al sitio del daño en el ADN. XPC, tras la ubiquitinación, se activa e inicia la vía de reparación por escisión de nucleótidos. Un poco más tarde, 30 minutos después del daño por UV, el complejo de remodelación de cromatina INO80 se recluta en el sitio del daño en el ADN, y esto coincide con la unión de más proteínas de reparación por escisión de nucleótidos, incluida ERCC1.

Reparación recombinante homóloga

Pueden inducirse roturas de doble cadena (DSB) en sitios específicos mediante la transfección de células con un plásmido que codifica endonucleasa I-SceI (una endonucleasa dirigida). Pueden inducirse múltiples DSB irradiando células sensibilizadas (marcadas con 5'-bromo-2'-desoxiuridina y con colorante Hoechst) con luz de 780 nm. Estos DSB pueden repararse mediante la reparación recombinatoria homóloga precisa o mediante la vía de reparación de unión de extremos no homóloga menos precisa. Aquí describimos los primeros pasos en la reparación recombinacional homóloga (HRR).

Después de tratar las células para introducir DSB, la proteína quinasa activada por estrés, la quinasa N-terminal c-Jun (JNK), fosforila SIRT6 en la serina 10. Esta modificación postraduccional facilita la movilización de SIRT6 a los sitios dañados del ADN con un reclutamiento medio máximo en menos de un segundo. Se requiere SIRT6 en el sitio para el reclutamiento eficiente de la poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1) en un sitio de ruptura de ADN y para la reparación eficiente de DSB. La proteína PARP1 comienza a aparecer en los DSB en menos de un segundo, con la mitad de la acumulación máxima dentro de los 1,6 segundos posteriores al daño. Esto permite entonces la mitad del reclutamiento máximo de las enzimas de reparación del ADN MRE11 en 13 segundos y NBS1 en 28 segundos. MRE11 y NBS1 llevan a cabo los primeros pasos de la vía HRR.

γH2AX, la forma fosforilada de H2AX, también participa en los primeros pasos de la reparación de DSB. La variante de histona H2AX constituye aproximadamente el 10% de las histonas H2A en la cromatina humana. El γH2AX (H2AX fosforilado en la serina 139) se puede detectar tan pronto como 20 segundos después de la irradiación de las células (con la formación de roturas de doble cadena de ADN), y la mitad de la acumulación máxima de γH2AX se produce en un minuto. La extensión de la cromatina con γH2AX fosforilada es de aproximadamente dos millones de pares de bases en el sitio de una ruptura de doble cadena de ADN. γH2AX no provoca, por sí mismo, la descondensación de la cromatina, pero dentro de los 30 segundos posteriores a la irradiación, la proteína RNF8 se puede detectar en asociación con γH2AX. RNF8 media la descondensación extensa de la cromatina, a través de su posterior interacción con CHD4,un componente del complejo de remodelación de nucleosomas y desacetilasa NuRD.

Pausa para la reparación del ADN

Después de la remodelación rápida de la cromatina, los puntos de control del ciclo celular pueden activarse para permitir que se complete la reparación del ADN antes de que progrese el ciclo celular. Primero, dos quinasas, ATM y ATR, se activan dentro de los 5 o 6 minutos posteriores al daño del ADN. A esto le sigue la fosforilación de la proteína del punto de control del ciclo celular Chk1, iniciando su función, aproximadamente 10 minutos después de que se dañe el ADN.

Papel del daño oxidativo de la guanina en la regulación génica

El daño del ADN 8-oxo-dG no ocurre al azar en el genoma. En fibroblastos embrionarios de ratón, se encontró un enriquecimiento de 2 a 5 veces de 8-oxo-dG en las regiones de control genético, incluidos los promotores, las regiones 5' no traducidas y las regiones 3' no traducidas en comparación con los niveles de 8-oxo-dG encontrados en el gen. cuerpos y en regiones intergénicas. En células endoteliales de arteria pulmonar de rata, cuando se examinaron 22 414 genes codificadores de proteínas para localizar ubicaciones de 8-oxo-dG, la mayoría de 8-oxo-dG (cuando estaban presentes) se encontraron en regiones promotoras en lugar de dentro de cuerpos genéticos. Entre cientos de genes cuyos niveles de expresión se vieron afectados por la hipoxia, aquellos con el promotor 8-oxo-dGs recién adquirido estaban regulados al alza, y aquellos genes cuyos promotores perdieron 8-oxo-dGs estaban casi todos regulados a la baja.

Según lo revisado por Wang et al., la guanina oxidada parece tener múltiples funciones reguladoras en la expresión génica. En particular, cuando el estrés oxidativo produce 8-oxo-dG en el promotor de un gen, el estrés oxidativo también puede inactivar OGG1, una enzima que se dirige a 8-oxo-dG y normalmente inicia la reparación del daño por 8-oxo-dG. El OGG1 inactivo, que ya no escinde 8-oxo-dG, sin embargo, se dirige y forma complejos con 8-oxo-dG, y provoca una curva pronunciada (~70) en el ADN. Esto permite el ensamblaje de un complejo de iniciación transcripcional que regula al alza la transcripción del gen asociado.

Cuando se forma 8-oxo-dG en una secuencia potencialmente formadora de G-quadruplex (PQS) rica en guanina en la hebra codificante de un promotor, la OGG1 activa escinde la 8-oxo-dG y genera un sitio apurínico/apirimidínico (sitio AP). El sitio AP permite la fusión del dúplex para desenmascarar el PQS, adoptando un pliegue G-quadruplex (estructura/motivo G4) que tiene un papel regulador en la activación de la transcripción.

Cuando 8-oxo-dG se compleja con OGG1 activo, puede reclutar remodeladores de cromatina para modular la expresión génica. La proteína 4 de unión al ADN de cromodominio helicasa (CHD4), un componente del complejo (NuRD), es reclutada por OGG1 a los sitios de daño oxidativo del ADN. CHD4 luego atrae ADN y enzimas de metilación de histonas que reprimen la transcripción de genes asociados.

Papel del daño del ADN en la formación de la memoria

Oxidación de guanina

La oxidación de guanina, particularmente dentro de los sitios CpG, puede ser especialmente importante en el aprendizaje y la memoria. La metilación de las citosinas ocurre en 60 a 90% de los sitios CpG, según el tipo de tejido. En el cerebro de los mamíferos, ~62 % de las CpG están metiladas. La metilación de los sitios CpG tiende a silenciar genes de forma estable. Más de 500 de estos sitios CpG se desmetilan en el ADN de las neuronas durante la formación y consolidación de la memoria en el hipocampo y las regiones de la corteza cingulada del cerebro. Como se indica a continuación, el primer paso en la desmetilación de la citosina metilada en un sitio CpG es la oxidación de la guanina para formar 8-oxo-dG.

Papel de la guanina oxidada en la desmetilación del ADN

La figura de esta sección muestra un sitio CpG donde la citosina se metila para formar 5-metilcitosina (5 mC) y la guanina se oxida para formar 8-oxo-2'-desoxiguanosina (en la figura esto se muestra en la forma tautomérica 8- OHdG). Cuando se forma esta estructura, la enzima de reparación por escisión de base OGG1 se dirige a 8-OHdG y se une a la lesión sin escisión inmediata. OGG1, presente en un sitio 5mCp-8-OHdG recluta a TET1, y TET1 oxida los 5mC adyacentes al 8-OHdG. Esto inicia la desmetilación de 5mC. TET1 es una enzima clave implicada en la desmetilación de 5mCpG. Sin embargo, TET1 solo puede actuar sobre 5mCpG si la guanina se oxidó primero para formar 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OHdG o su tautómero 8-oxo-dG), lo que da como resultado un dinucleótido 5mCp-8-OHdG (ver figura en esta sección). Esto inicia la vía de desmetilación en la citosina metilada, lo que finalmente da como resultado una citosina no metilada (consulte Oxidación del ADN para conocer más pasos en la formación de citosina no metilada).

La expresión alterada de proteínas en las neuronas, debido a cambios en la metilación del ADN (probablemente controlada por la desmetilación dependiente de 8-oxo-dG de los sitios CpG en los promotores de genes dentro del ADN de las neuronas) se ha establecido como fundamental para la formación de la memoria.

Papel de las rupturas de doble cadena en la formación de la memoria

Generación de DSB relacionados con la actividad neuronal

Las roturas de doble cadena (DSB) en regiones del ADN relacionadas con la actividad neuronal se producen mediante una variedad de mecanismos dentro y alrededor del genoma. La enzima topoisomerasa II, o TOPIIβ, juega un papel clave en la formación de DSB al ayudar en la desmetilación o aflojamiento de las histonas envueltas alrededor de la doble hélice para promover la transcripción. Una vez que se abre la estructura de la cromatina, es más probable que se acumulen DSB; sin embargo, esto normalmente lo repara TOPIIβ a través de su capacidad de religación intrínseca que vuelve a unir los extremos de ADN cortados.

La falla de TOPIIβ en la religasa puede tener consecuencias drásticas en la síntesis de proteínas, donde se estima que "bloquear la actividad de TOPIIβ altera la expresión de casi un tercio de todos los genes regulados por el desarrollo", como los genes neurales tempranos inmediatos (IEG) involucrados en la consolidación de la memoria.. Se ha observado una expresión rápida de egr-1, c-Fos y Arc IEG en respuesta al aumento de la actividad neuronal en la región del hipocampo del cerebro donde tiene lugar el procesamiento de la memoria.Como medida preventiva contra la falla de TOPIIβ, las moléculas de reparación de DSB se reclutan a través de dos vías diferentes: factores de la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ), que realizan una función de religación similar a la de TOPIIβ, y la vía de recombinación homóloga (HR), que utiliza la cadena hermana no rota como plantilla para reparar la cadena dañada de ADN.

La estimulación de la actividad neuronal, como se mencionó anteriormente en la expresión de IEG, es otro mecanismo a través del cual se generan los DSB. Los cambios en el nivel de actividad se han utilizado en estudios como biomarcadores para rastrear la superposición entre los DSB y el aumento de la metilación de la histona H3K4 en las regiones promotoras de los IEG. Otros estudios han indicado que los elementos transponibles (TE) pueden causar DSB a través de la actividad endógena que implica el uso de enzimas endonucleasas para insertar y escindir el ADN objetivo en sitios aleatorios.

DSB y reconsolidación de memoria

Si bien la acumulación de DSB generalmente inhibe la consolidación de la memoria a largo plazo, el proceso de reconsolidación, por el contrario, depende de DSB. La reconsolidación de la memoria implica la modificación de los recuerdos existentes almacenados en la memoria a largo plazo. La investigación que involucra a NPAS4, un gen que regula la neuroplasticidad en el hipocampo durante el aprendizaje contextual y la formación de la memoria, ha revelado un vínculo entre las deleciones en la región de codificación y las deficiencias en el recuerdo de los recuerdos del miedo en ratas transgénicas. Además, la enzima H3K4me3, que cataliza la desmetilación de la histona H3K4, se incrementó en la región promotora del gen NPAS4 durante el proceso de reconsolidación, mientras que la caída (caída del gen) de la misma enzima impidió la reconsolidación.Se observó un efecto similar en TOPIIβ, donde la caída también afectó la respuesta de memoria de miedo en ratas, lo que indica que los DSB, junto con las enzimas que los regulan, influyen en la formación de memoria en múltiples etapas.

DSB y neurodegeneración

La acumulación de DSB conduce más ampliamente a la degeneración de las neuronas, lo que dificulta la función de la memoria y los procesos de aprendizaje. Debido a su falta de división celular y alta actividad metabólica, las neuronas son especialmente propensas a sufrir daños en el ADN. Además, un desequilibrio de DSB y moléculas de reparación de ADN para genes de actividad neuronal se ha relacionado con el desarrollo de varias enfermedades neurodegenerativas humanas, incluida la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). En pacientes con enfermedad de Alzheimer, los DSB se acumulan en las neuronas en etapas tempranas y son la fuerza impulsora detrás de la pérdida de memoria, una característica clave de la enfermedad.Otros factores externos que provocan un aumento de los niveles de DSB dependientes de la actividad en personas con EA son el daño oxidativo de las neuronas, que puede dar lugar a más DSB cuando se producen lesiones múltiples cerca unas de otras. Los factores ambientales, como los virus y una dieta alta en grasas, también se han asociado con la función interrumpida de las moléculas de reparación del ADN.

Una terapia dirigida para el tratamiento de pacientes con EA implicó la supresión del gen BRCA1 en cerebros humanos, inicialmente probada en ratones transgénicos, donde se observó que los niveles de DSB aumentaron y se produjo pérdida de memoria, lo que sugiere que BRCA1 podría "servir como un objetivo terapéutico para AD y demencia relacionada con AD”. De manera similar, la proteína ATM involucrada en la reparación del ADN y las modificaciones epigenéticas del genoma se correlaciona positivamente con la pérdida neuronal en los cerebros con EA, lo que indica que la proteína es otro componente clave en los procesos intrínsecamente vinculados de neurodegeneración, producción de DSB y formación de memoria.

Rol de ATR y ATM

La mayoría de los daños se pueden reparar sin activar el sistema de respuesta a daños; sin embargo, los daños más complejos activan ATR y ATM, proteínas quinasas clave en el sistema de respuesta a daños. El daño del ADN inhibe las M-CDK, que son un componente clave de la progresión hacia la mitosis.

En todas las células eucariotas, ATR y ATM son proteínas quinasas que detectan daños en el ADN. Se unen a sitios dañados en el ADN y activan Chk1, Chk2 y, en células animales, p53. Juntas, estas proteínas forman el sistema de respuesta al daño del ADN. Algunos daños en el ADN no requieren el reclutamiento de ATR y ATM, solo son daños difíciles y extensos que requieren ATR y ATM. ATM y ATR son necesarios para la reparación de NHEJ, HR, ICL y NER, así como para la estabilidad de la horquilla de replicación durante la replicación del ADN sin perturbaciones y en respuesta a los bloques de replicación.

ATR se recluta para diferentes formas de daño, como daño de nucleótidos, horquillas de replicación estancadas y roturas de doble cadena. ATM es específicamente para la respuesta al daño a roturas de doble hebra. El complejo MRN (compuesto por Mre11, Rad50 y Nbs1) se forma inmediatamente en el sitio de rotura de la doble hebra. Este complejo MRN recluta ATM al sitio del daño. ATR y ATM fosforilan varias proteínas que contribuyen al sistema de reparación de daños. La unión de ATR y ATM a sitios dañados en el ADN conduce al reclutamiento de Chk1 y Chk2. Estas proteínas quinasas envían señales de daño al sistema de control del ciclo celular para retrasar la progresión del ciclo celular.

Funciones Chk1 y Chk2

Chk1 conduce a la producción de enzimas reparadoras del ADN. Chk2 conduce a la detención reversible del ciclo celular. Chk2, así como ATR/ATM, puede activar p53, lo que conduce a la detención permanente del ciclo celular oa la apoptosis.

Papel de p53 en el sistema de reparación de daños en el ADN

Cuando hay demasiado daño, se desencadena la apoptosis para proteger al organismo de células potencialmente dañinas.7 p53, también conocido como gen supresor de tumores, es una proteína reguladora importante en el sistema de respuesta al daño del ADN que se une directamente a los promotores de sus genes diana. p53 actúa principalmente en el punto de control G1 (que controla la transición de G1 a S), donde bloquea la progresión del ciclo celular. La activación de p53 puede desencadenar la muerte celular o la detención permanente del ciclo celular. p53 también puede activar ciertas vías de reparación, como NER.

Regulación de p53

En ausencia de daño en el ADN, p53 está regulado por Mdm2 y se degrada constantemente. Cuando hay daño en el ADN, Mdm2 se fosforila, muy probablemente causado por ATM. La fosforilación de Mdm2 conduce a una reducción de la actividad de Mdm2, evitando así la degradación de p53. Las células normales, sin daños, generalmente tienen niveles bajos de p53, mientras que las células bajo estrés y daño en el ADN tendrán niveles altos de p53.

P53 sirve como factor de transcripción para bax y p21

p53 sirve como factor de transcripción tanto para bax, una proteína proapoptótica como para p21, un inhibidor de CDK. Los inhibidores de CDK dan como resultado la detención del ciclo celular. Detener la célula proporciona tiempo a la célula para reparar el daño y, si el daño es irreparable, p53 recluta a bax para desencadenar la apoptosis.

Función de DDR y p53 en el cáncer

p53 es un jugador clave importante en el crecimiento de células cancerosas. Las células de ADN dañadas con p53 mutado tienen un mayor riesgo de volverse cancerosas. Los tratamientos de quimioterapia comunes son genotóxicos. Estos tratamientos son ineficaces en tumores cancerosos que tienen p53 mutado, ya que no tienen un p53 funcional para detener o matar la célula dañada.

Un gran problema para la vida.

Una indicación de que los daños en el ADN son un problema importante para la vida es que se han encontrado procesos de reparación del ADN para hacer frente a los daños del ADN en todos los organismos celulares en los que se ha investigado la reparación del ADN. Por ejemplo, en bacterias, se ha encontrado en muchas especies bacterianas una red reguladora destinada a reparar daños en el ADN (llamada respuesta SOS en Escherichia coli). E. coli RecA, una enzima clave en la vía de respuesta SOS, es el miembro definitorio de una clase ubicua de proteínas de intercambio de cadenas de ADN que son esenciales para la recombinación homóloga, una vía que mantiene la integridad genómica al reparar el ADN roto. Genes homólogos a RecAy a otros genes centrales en la vía de respuesta SOS se encuentran en casi todos los genomas bacterianos secuenciados hasta la fecha, cubriendo una gran cantidad de filos, lo que sugiere tanto un origen antiguo como una ocurrencia generalizada de reparación recombinacional del daño del ADN. Las recombinasas eucariotas que son homólogas de RecA también están muy extendidas en los organismos eucariotas. Por ejemplo, en la levadura de fisión y en los seres humanos, los homólogos de RecA promueven el intercambio de cadenas de ADN dúplex-dúplex necesario para la reparación de muchos tipos de lesiones de ADN.

Otra indicación de que los daños en el ADN son un problema importante para la vida es que las células hacen grandes inversiones en los procesos de reparación del ADN. Como señaló Hoeijmakers, la reparación de una sola rotura de doble cadena podría requerir más de 10 000 moléculas de ATP, que se utilizan para señalar la presencia del daño, la generación de focos de reparación y la formación (en humanos) del nucleofilamento RAD51 (un intermedio en la reparación recombinante homóloga). (RAD51 es un homólogo de RecA bacteriano). Si la modificación estructural ocurre durante la fase G1 de la replicación del ADN, el punto de control G1-S detiene o pospone el desarrollo del ciclo celular antes de que el producto entre en la fase S.

Consecuencias

Las células somáticas diferenciadas de los mamíferos adultos generalmente se replican con poca frecuencia o no se replican en absoluto. Tales células, incluidas, por ejemplo, las neuronas cerebrales y los miocitos musculares, tienen poco o ningún recambio celular. Las células que no se replican generalmente no generan mutaciones debido a errores de replicación inducidos por daños en el ADN. Estas células que no se replican no suelen dar lugar al cáncer, pero con el tiempo acumulan daños en el ADN que probablemente contribuyan al envejecimiento (). En una célula que no se replica, una rotura de una sola hebra u otro tipo de daño en la hebra de ADN transcrita puede bloquear la transcripción catalizada por la ARN polimerasa II. Esto interferiría con la síntesis de la proteína codificada por el gen en el que se produjo el bloqueo.

Brasnjevic et al. resumió la evidencia que muestra que las roturas de una sola hebra se acumulan con la edad en el cerebro (aunque la acumulación difiere en diferentes regiones del cerebro) y que las roturas de una sola hebra son los daños de ADN en estado estacionario más frecuentes en el cerebro. Como se discutió anteriormente, se esperaría que estas roturas acumuladas de una sola hebra bloqueen la transcripción de genes. De acuerdo con esto, según lo revisado por Hetman et al., se identificaron 182 genes y se demostró que tenían una transcripción reducida en los cerebros de personas mayores de 72 años, en comparación con la transcripción en los cerebros de personas menores de 43 años. Cuando se evaluaron 40 proteínas particulares en un músculo de ratas, la mayoría de las proteínas mostraron disminuciones significativas durante el envejecimiento desde los 18 meses (rata madura) hasta los 30 meses (rata envejecida) de edad.

Se demostró que otro tipo de daño en el ADN, la ruptura de la doble hebra, causa la muerte celular (pérdida de células) a través de la apoptosis. Este tipo de daño en el ADN no se acumularía con la edad, ya que una vez que una célula se pierde por apoptosis, su daño de doble cadena se perdería con ella. Por lo tanto, los segmentos de ADN dañados socavan la maquinaria de replicación del ADN porque estas secuencias alteradas de ADN no pueden utilizarse como verdaderas plantillas para producir copias del material genético de uno.

Genes RAD y la respuesta del ciclo celular al daño del ADN en Saccharomyces cerevisiae

Cuando se daña el ADN, la célula responde de varias maneras para reparar el daño y minimizar los efectos en la célula. Una de esas respuestas, específicamente en las células eucariotas, es retrasar la división celular: la célula se detiene durante algún tiempo en la fase G2 antes de avanzar por el resto del ciclo celular. Se han realizado varios estudios para dilucidar el propósito de esta detención de G2 que es inducida por daño en el ADN. Los investigadores han descubierto que las células que son forzadas prematuramente a salir del retraso tienen una viabilidad celular más baja y tasas más altas de cromosomas dañados en comparación con las células que pueden sufrir una detención completa de G2, lo que sugiere que el propósito del retraso es darle tiempo a la célula para reparar los cromosomas dañados antes de continuar con el ciclo celular. Esto asegura el correcto funcionamiento de la mitosis.

Varias especies de animales exhiben mecanismos similares de retraso celular en respuesta al daño del ADN, que puede ser causado por la exposición a la radiación x. La levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae se ha estudiado específicamente porque la progresión a través del ciclo celular se puede seguir con facilidad a través de la morfología nuclear. Mediante el estudio de Saccharomyces cerevisiae, los investigadores han podido aprender más sobre los genes sensibles a la radiación (RAD) y el efecto que las mutaciones de RAD pueden tener en la típica respuesta de retraso inducida por daños en el ADN celular. Específicamente, el gen RAD9 juega un papel crucial en la detección de daños en el ADN y la detención de la célula en G2 hasta que se repara el daño.

A través de extensos experimentos, los investigadores han podido iluminar el papel que juegan los genes RAD en el retraso de la división celular en respuesta al daño del ADN. Cuando las células en crecimiento de tipo salvaje se exponen a varios niveles de radiación x durante un período de tiempo determinado y luego se analizan con un ensayo de microcolonia, se pueden observar diferencias en la respuesta del ciclo celular en función de qué genes están mutados en las células. Por ejemplo, mientras que las células no irradiadas progresarán normalmente a través del ciclo celular, las células que están expuestas a la radiación X se detienen permanentemente (se vuelven inviables) o se retrasan en la fase G2 antes de continuar dividiéndose en mitosis, lo que corrobora aún más la idea de que el retraso G2 es crucial para la reparación del ADN. Sin embargo, las cepas de rad, que son deficientes en la reparación del ADN, exhiben una respuesta marcadamente diferente. Por ejemplo, las células rad52, que no pueden reparar roturas de ADN de doble cadena, tienden a detenerse permanentemente en G2 cuando se exponen incluso a niveles muy bajos de radiación x, y rara vez terminan progresando a través de las últimas etapas del ciclo celular. Esto se debe a que las células no pueden reparar el daño del ADN y, por lo tanto, no entran en mitosis. Varios otros mutantes de rad exhiben respuestas similares cuando se exponen a la radiación x.

Sin embargo, la cepa rad9 exhibe un efecto completamente diferente. Estas células no se retrasan en la fase G2 cuando se exponen a la radiación x y terminan progresando a través del ciclo celular sin ser perturbadas, antes de morir. Esto sugiere que el gen RAD9, a diferencia de otros genes RAD, juega un papel crucial en el inicio de la detención de G2. Para investigar más a fondo estos hallazgos, se analizaron los ciclos celulares de cepas mutantes dobles. Una cepa mutante rad52 rad9, que es defectuosa tanto en la reparación del ADN como en la detención de G2, no logra detener el ciclo celular cuando se expone a la radiación x. Esto sugiere que incluso si el daño del ADN no puede repararse, si RAD9 no está presente, el ciclo celular no se retrasará. Por lo tanto, el daño del ADN no reparado es la señal que le dice a RAD9 que detenga la división y detenga el ciclo celular en G2. Además, existe una respuesta dependiente de la dosis;

Otra forma, y ​​quizás más útil, de visualizar este efecto es mirar diapositivas de fotomicroscopía. Inicialmente, los portaobjetos de células haploides RAD+ y rad9 en la fase exponencial de crecimiento muestran células simples e individuales que son indistinguibles entre sí. Sin embargo, los portaobjetos tienen un aspecto muy diferente después de haber sido expuestos a la radiación x durante 10 horas. Las diapositivas RAD+ ahora muestran células RAD+ que existen principalmente como microcolonias de dos yemas, lo que sugiere que se ha detenido la división celular. Por el contrario, las diapositivas de rad9 muestran que las células rad9 existen principalmente como colonias de 3 a 8 brotes, y parecen más pequeñas que las células RAD+. Esta es una prueba más de que las células RAD mutantes continuaron dividiéndose y son deficientes en la detención de G2.

Sin embargo, hay evidencia de que aunque el gen RAD9 es necesario para inducir la detención de G2 en respuesta al daño del ADN, dando tiempo a la célula para reparar el daño, en realidad no juega un papel directo en la reparación del ADN. Cuando las células rad9 se detienen artificialmente en G2 con MBC, un veneno de microtúbulos que impide la división celular, y luego se tratan con radiación x, las células pueden reparar su ADN y eventualmente progresar a través del ciclo celular, dividiéndose en células viables. Por lo tanto, el gen RAD9 no juega ningún papel en la reparación del ADN dañado; simplemente detecta el ADN dañado y responde retrasando la división celular. El retraso, entonces, está mediado por un mecanismo de control, en lugar del ADN dañado físicamente.

Por otro lado, es posible que existan mecanismos de respaldo que cumplan el rol de RAD9 cuando no está presente. De hecho, algunos estudios han encontrado que RAD9 juega un papel fundamental en la reparación del ADN. En un estudio, se expusieron células mutantes y normales de rad9 en la fase exponencial de crecimiento a la radiación ultravioleta y se sincronizaron en fases específicas del ciclo celular. Después de incubarse para permitir la reparación del ADN, se evaluó el grado de dimerización de la pirimidina (que es indicativa del daño del ADN) utilizando técnicas de extensión de cebadores sensibles. Se encontró que la eliminación de fotolesiones de ADN fue mucho menos eficiente en las células mutantes rad9 que en las células normales, lo que proporciona evidencia de que RAD9 está involucrado en la reparación del ADN. Por lo tanto, el papel de RAD9 en la reparación del daño en el ADN sigue sin estar claro.

De todos modos, está claro que RAD9 es necesario para detectar daños en el ADN y detener la división celular. Se ha sugerido que RAD9 posee actividad de exonucleasa de 3' a 5', por lo que quizás desempeña un papel en la detección de daños en el ADN. Cuando se daña el ADN, se plantea la hipótesis de que RAD9 forma un complejo con RAD1 y HUS1, y este complejo se recluta en los sitios de daño en el ADN. Es de esta manera que RAD9 puede ejercer sus efectos.

Aunque la función de RAD9 se ha estudiado principalmente en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae, muchos de los mecanismos de control del ciclo celular son similares entre especies. Por lo tanto, podemos concluir que es probable que RAD9 también desempeñe un papel fundamental en la respuesta al daño del ADN en humanos.