Cromatografía de capa fina

La cromatografía en capa fina (TLC) es una técnica de cromatografía que separa componentes en mezclas no volátiles.

Se realiza sobre una placa TLC compuesta por un sólido no reactivo recubierto con una fina capa de material adsorbente. Esto se llama fase estacionaria. La muestra se deposita en la placa, que se eluye con un disolvente o mezcla de disolventes conocida como fase móvil (o eluyente). Este disolvente luego sube por la placa mediante acción capilar. Como ocurre con toda cromatografía, algunos compuestos se sienten más atraídos por la fase móvil, mientras que otros se sienten más atraídos por la fase estacionaria. Por lo tanto, diferentes compuestos suben por la placa de TLC a diferentes velocidades y se separan. Para visualizar compuestos incoloros, la placa se observa bajo luz ultravioleta o se tiñe. A menudo es necesario probar diferentes fases estacionarias y móviles para obtener puntos bien definidos y separados.

La TLC es rápida, sencilla y proporciona una alta sensibilidad a un coste relativamente bajo. Puede monitorear el progreso de la reacción, identificar compuestos en una mezcla, determinar la pureza o purificar pequeñas cantidades de compuestos.

Procedimiento

El proceso de TLC es similar a la cromatografía en papel, pero proporciona ejecuciones más rápidas, mejores separaciones y la posibilidad de elegir entre diferentes fases estacionarias. Las placas se pueden etiquetar antes o después del proceso de cromatografía con un lápiz u otro instrumento que no interfiera con el proceso.

Hay cuatro etapas principales para ejecutar una placa de cromatografía de capa fina:

Preparación de la placa: Usando un tubo capilar, se deposita una pequeña cantidad de una solución concentrada de la muestra cerca del borde inferior de una placa de TLC. Se deja que el disolvente se evapore completamente antes del siguiente paso. Puede ser necesaria una cámara de vacío para disolventes no volátiles. Para asegurarse de que haya suficiente compuesto para obtener un resultado visible, se puede repetir el procedimiento de manchado. Dependiendo de la aplicación, se pueden colocar varias muestras diferentes en una fila a la misma distancia del borde inferior; cada muestra subirá por la placa en su propio "carril".

Preparación de la cámara de desarrollo: El disolvente de desarrollo o la mezcla de disolventes se coloca en un recipiente transparente (cámara de separación/revelado) a una profundidad de menos de 1 centímetro. También se coloca una tira de papel de filtro (también conocido como "mecha") a lo largo de la pared del recipiente. Este papel de filtro debe tocar el disolvente y casi llegar a la parte superior del recipiente. El recipiente se cubre con una tapa y se deja que los vapores del disolvente saturen la atmósfera del recipiente. De lo contrario, se producirá una separación deficiente y resultados no reproducibles.

Desarrollo: La placa de TLC se coloca en el recipiente de manera que los puntos de muestra no queden sumergidos en la fase móvil. El recipiente está tapado para evitar la evaporación del disolvente. El disolvente migra hacia arriba por la placa por acción capilar, se encuentra con la mezcla de muestra y la transporta hacia arriba por la placa (eluye la muestra). La placa se retira del recipiente antes de que el disolvente llegue a la parte superior de la placa; de lo contrario, los resultados serán engañosos. Está marcado el frente del disolvente, la marca más alta que ha recorrido el disolvente a lo largo de la placa.

Visualización: El disolvente se evapora de la placa. Los métodos de visualización incluyen luz ultravioleta, tinción y muchos más.

Proceso y principio de separación

La separación de compuestos se debe a las diferencias en su atracción hacia la fase estacionaria y a las diferencias en la solubilidad en el disolvente. Como resultado, los compuestos y la fase móvil compiten por los sitios de unión en la fase estacionaria. Diferentes compuestos en la mezcla de muestra viajan a diferentes velocidades debido a las diferencias en sus coeficientes de partición. Diferentes solventes, o diferentes mezclas de solventes, dan una separación diferente. El factor de retardo (R_f), o factor de retención, cuantifica los resultados. Es la distancia recorrida por una sustancia determinada dividida por la distancia recorrida por la fase móvil.

En la TLC de fase normal, la fase estacionaria es polar. El gel de sílice es muy común en la TLC de fase normal. Los compuestos más polares en una mezcla de muestra interactúan más fuertemente con la fase estacionaria polar. Como resultado, los compuestos más polares se mueven menos (lo que resulta en un R_f más pequeño) mientras que los compuestos menos polares se mueven más arriba en la placa (un R_f). Una fase móvil más polar también se une más fuertemente a la placa, compitiendo más con el compuesto por los sitios de unión; una fase móvil más polar también disuelve más los compuestos polares. Como tal, todos los compuestos en la placa de TLC se mueven hacia arriba en la placa en mezclas de solventes polares. "Fuerte" los disolventes mueven los compuestos más arriba en la placa, mientras que los disolventes "débiles" los disolventes los mueven menos.

Si la fase estacionaria no es polar, como las placas de sílice funcionalizadas con C18, se denomina TLC de fase inversa. En este caso, los compuestos no polares se mueven menos y los polares se mueven más. La mezcla de disolventes también será mucho más polar que en la TLC de fase normal.

Elección de disolvente

Una serie eluotrópica, que ordena los disolventes según cuánto mueven los compuestos, puede ayudar a seleccionar una fase móvil. Los disolventes también se dividen en grupos de selectividad de disolventes. El uso de disolventes con diferentes fuerzas de elución o diferentes grupos de selectividad a menudo puede dar resultados muy diferentes. Si bien las fases móviles de un solo solvente a veces pueden dar una buena separación, algunos casos pueden requerir mezclas de solventes.

En la TLC de fase normal, las mezclas de disolventes más comunes incluyen acetato de etilo/hexanos (EtOAc/Hex) para compuestos menos polares y metanol/diclorometano (MeOH/DCM) para compuestos más polares. Diferentes mezclas de solventes y proporciones de solventes pueden ayudar a lograr una mejor separación. En la TLC de fase inversa, las mezclas de disolventes suelen ser agua con un disolvente menos polar: las opciones típicas son agua con tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo (ACN) o metanol.

Análisis

Como los productos químicos que se separan pueden ser incoloros, existen varios métodos para visualizar las manchas:

• Colocar la placa bajo luz negra (366 nm) hace brillar compuestos fluorescentes
• Las placas TLC que contienen una pequeña cantidad de compuesto fluorescente (generalmente silicato de zinc activado por manganeso) en la capa adsorbente permiten la visualización de algunos compuestos bajo luz UV-C (254 nm). La capa adsorbente fluoresce luz verde, mientras que los puntos que contienen compuestos que absorben la luz UV-C no lo harán.
• Colocar la placa en un recipiente lleno de vapores de yodo mancha temporalmente los puntos. Normalmente se convierten en un color amarillo o marrón.
• La placa TLC puede ser tapada o rociada con una mancha y a veces calentada dependiendo de la mancha utilizada. Existen muchas manchas para una gran variedad de gemidos químicos, pero algunos ejemplos incluyen:
  • Permanganato de potasio (sin calefacción, para grupos oxidables)
  • Ninhydrin (calor, aminas y aminoácidos)
  • Vanillina acidica (calor, reactivo general)
  • Ácido fosfomolíbdico (sin calefacción, reactivo general)
• En el caso de los lípidos, el croatograma puede ser transferido a una membrana fluoruro de poliviniloideno y luego sometido a análisis adicionales, por ejemplo, espectrometría de masas. Esta técnica se conoce como lotería lejana.

Producción de planchas

Las placas TLC suelen estar disponibles comercialmente, con rangos de tamaño de partículas estándar para mejorar la reproducibilidad. Se preparan mezclando el adsorbente, como el gel de sílice, con una pequeña cantidad de aglutinante inerte como sulfato de calcio (yeso) y agua. Esta mezcla se esparce como una suspensión espesa sobre una lámina portadora no reactiva, generalmente vidrio, papel de aluminio grueso o plástico. La placa resultante se seca y activa calentándola en un horno durante treinta minutos a 110 °C. El espesor de la capa absorbente suele ser de alrededor de 0,1 a 0,25 mm para fines analíticos y de alrededor de 0,5 a 2,0 mm para TLC preparativa. Otros recubrimientos adsorbentes incluyen óxido de aluminio (alúmina) o celulosa.

Aplicaciones

Monitoreo y caracterización de reacciones

TLC es una herramienta útil para el seguimiento de reacciones. Para ello, la placa normalmente contiene una mancha de material de partida, una mancha de la mezcla de reacción y una mancha conjunta (o mancha cruzada) que contiene ambas. El análisis mostrará si el material de partida desapareció y si aparecieron nuevos productos. Esto proporciona una forma rápida y sencilla de estimar hasta dónde ha avanzado una reacción. En un estudio, la TLC se aplicó en la detección de reacciones orgánicas. Los investigadores hacen reaccionar un alcohol y un catalizador directamente en el co-punto de una placa TLC antes de desarrollarla. Esto proporciona pruebas rápidas y sencillas a pequeña escala de diferentes reactivos.

La caracterización de compuestos con TLC también es posible y es similar al monitoreo de reacciones. Sin embargo, en lugar de manchar con el material de partida y la mezcla de reacción, es con un compuesto desconocido y conocido. Pueden ser el mismo compuesto si ambos puntos tienen el mismo R_f y se ven iguales según el método de visualización elegido. Sin embargo, la coelución complica tanto el seguimiento como la caracterización de la reacción. Esto se debe a que diferentes compuestos se moverán al mismo lugar de la placa. En tales casos, diferentes mezclas de disolventes pueden proporcionar una mejor separación.

Pureza y purificación

TLC ayuda a mostrar la pureza de una muestra. Una muestra pura solo debe contener una mancha según TLC. La TLC también es útil para la purificación a pequeña escala. Debido a que los compuestos separados estarán en diferentes áreas de la placa, un científico puede raspar las partículas de la fase estacionaria que contienen el compuesto deseado y disolverlas en un solvente apropiado. Una vez que todo el compuesto se disuelve en el solvente, filtran las partículas de sílice y luego evaporan el solvente para aislar el producto. Las grandes placas preparativas de TLC con recubrimientos gruesos de gel de sílice pueden separar más de 100 mg de material.

Para la purificación y el aislamiento a mayor escala, la TLC es útil para probar rápidamente mezclas de disolventes antes de realizar una cromatografía flash en columna en un lote grande de material impuro. Un compuesto eluye de una columna cuando la cantidad de disolvente recogido es igual a 1/R_f. El eluyente de la cromatografía en columna flash se recoge en varios recipientes (por ejemplo, tubos de ensayo) llamados fracciones. La TLC ayuda a mostrar qué fracciones contienen impurezas y cuáles contienen compuesto puro.

Además, la TLC bidimensional puede ayudar a comprobar si un compuesto es estable en una fase estacionaria concreta. Esta prueba requiere dos corridas en una placa TLC de forma cuadrada. La placa se gira 90º antes de la segunda pasada. Si el compuesto objetivo aparece en la diagonal del cuadrado, es estable en la fase estacionaria elegida. De lo contrario, se va descomponiendo en el plato. Si este es el caso, una fase estacionaria alternativa puede evitar esta descomposición.

La TLC también es un método analítico para la separación directa de enantiómeros y el control de la pureza enantiomérica, p.e. ingredientes farmacéuticos activos (API) que son quirales.

• Separación de materia vegetal verde en espinacas (nota que las imágenes de los pasos 1-6 se amplían al fondo de la placa)
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  Paso 1
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  Paso 2
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  Paso 3
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  Paso 4
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  Paso 5
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  Paso 6
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  Paso 7