Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad es un método de separación de una biomolécula de una mezcla, basado en una interacción de unión macromolecular altamente específica entre la biomolécula y otra sustancia. El tipo específico de interacción de unión depende de la biomolécula de interés; Las interacciones de unión de antígeno y anticuerpo, enzima y sustrato, receptor y ligando, o proteína y ácido nucleico se explotan con frecuencia para el aislamiento de diversas biomoléculas. La cromatografía de afinidad es útil por su alta selectividad y resolución de separación, en comparación con otros métodos cromatográficos.

Principio

La cromatografía de afinidad tiene la ventaja de interacciones de unión específicas entre el analito de interés (normalmente disuelto en la fase móvil) y un compañero de unión o ligando (inmovilizado en la fase estacionaria). En un experimento típico de cromatografía de afinidad, el ligando se une a una matriz sólida e insoluble (generalmente un polímero como agarosa o poliacrilamida) modificada químicamente para introducir grupos funcionales reactivos con los que el ligando puede reaccionar, formando enlaces covalentes estables. La fase estacionaria se carga primero en una columna a la que se introduce la fase móvil. Las moléculas que se unen al ligando permanecerán asociadas a la fase estacionaria. Luego se aplica un tampón de lavado para eliminar las biomoléculas no objetivo interrumpiendo sus interacciones más débiles con la fase estacionaria, mientras que las biomoléculas de interés permanecerán unidas. Luego, las biomoléculas objetivo se pueden eliminar aplicando el llamado tampón de elución, que interrumpe las interacciones entre las biomoléculas objetivo unidas y el ligando. La molécula objetivo se recupera así en la solución eluyente.

La cromatografía de afinidad no requiere que se conozca el peso molecular, la carga, la hidrofobicidad u otras propiedades físicas del analito de interés, aunque el conocimiento de sus propiedades de unión es útil en el diseño de un protocolo de separación. En la siguiente tabla se resumen los tipos de interacciones de unión comúnmente explotadas en los procedimientos de cromatografía de afinidad.

Configuración de lotes y columnas

La unión a la fase sólida se puede lograr mediante cromatografía de columna por la cual el medio sólido se empaqueta en una columna, la mezcla inicial se ejecuta a través de la columna para permitir el asentamiento, un tampón de lavado que se ejecuta a través de la columna y el tampón de elución se aplica posteriormente al columna y recolectado. Estos pasos generalmente se realizan a presión ambiente. Alternativamente, la unión se puede lograr utilizando un tratamiento por lotes, por ejemplo, agregando la mezcla inicial a la fase sólida en un vaso, mezclando, separando la fase sólida, eliminando la fase líquida, lavado, recentrifugado, agregando el tampón de elución, volver a centrar y eliminar el eludo.

A veces se emplea un método híbrido de tal manera que la unión se realiza mediante el método por lotes, pero la fase sólida con el límite de la molécula objetivo se empaqueta en una columna y el lavado y la elución se realiza en la columna.

Los ligandos utilizados en la cromatografía de afinidad se obtienen de fuentes orgánicas e inorgánicas. Ejemplos de fuentes biológicas son proteínas séricas, lectinas y anticuerpos. Las fuentes inorgánicas son ácido morónico, quelatos de metal y tintes de triazina.

Un tercer método, también se ha desarrollado una absorción de lecho ampliada, que combina las ventajas de los dos métodos mencionados anteriormente. Las partículas de fase sólida se colocan en una columna donde se bombea la fase líquida desde la parte inferior y sale en la parte superior. La gravedad de las partículas asegura que la fase sólida no salga de la columna con la fase líquida.

Las columnas de afinidad se pueden eluir cambiando las concentraciones de sal, pH, PI, carga y resistencia iónica directamente o mediante un gradiente para resolver las partículas de interés.

Más recientemente, se han desarrollado configuraciones que emplean más de una columna en series. La ventaja en comparación con las configuraciones de una sola columna es que el material de resina se puede cargar completamente ya que el producto no vinculante se transmite directamente a una columna consecutiva con material de columna fresca. Estos procesos cromatográficos se conocen como cromatografía periódica de contracorriente (PCC). Los costos de resina por cantidad de producto producido pueden reducirse drásticamente. Dado que una columna siempre se puede eluir y regenerar mientras se carga la otra columna, ya dos columnas son suficientes para hacer uso completo de las ventajas. Las columnas adicionales pueden brindar flexibilidad adicional para los tiempos de elución y regeneración, a costa de equipos adicionales y costos de resina.

usos específicos

se puede usar en una serie de aplicaciones, incluida la purificación de ácido nucleico, la purificación de proteínas de los extractos libres de células y la purificación de la sangre.

Al usar la cromatografía de afinidad, se pueden separar proteínas que se unen a un cierto fragmento de proteínas que no se unen a ese fragmento específico. Debido a que esta técnica de purificación se basa en las propiedades biológicas de la proteína necesaria, es una técnica útil y las proteínas pueden purificarse muchos pliegues en un solo paso.

Varios medios de afinidad

Existen muchos medios de afinidad diferentes para una variedad de usos posibles. Brevemente, se activan/funcionalizan (generalizados) que funcionan como un espaciador funcional, una matriz de soporte y elimina el manejo de reactivos tóxicos.

Los medios de aminoácidos se usan con una variedad de proteínas séricas, proteínas, péptidos y enzimas, así como rRNA y dsDNA. Avidin Biotin Media se usa en el proceso de purificación de biotina/avidina y sus derivados.

la unión de carbohidratos se usa con mayor frecuencia con glucoproteínas o cualquier otra sustancia que contenga carbohidratos; El carbohidrato se usa con lectinas, glucoproteínas o cualquier otra proteína de metabolito de carbohidratos. Dye Ligand Media es inespecífico, pero imita sustratos y proteínas biológicas. El glutatión es útil para la separación de proteínas recombinantes etiquetadas con GST. La heparina es un ligando de afinidad generalizada, y es más útil para la separación de proteínas de coagulación en plasma, junto con enzimas y lipasas de ácido nucleico

Los medios de interacción hidrofóbicos se usan más comúnmente para apuntar a grupos carboxilo libres y proteínas.

Inmunoafinity Media (detallado a continuación) utiliza antígenos ' y anticuerpos ' alta especificidad para separar; La cromatografía de afinidad metálica inmovilizada se detalla más a continuación y utiliza interacciones entre iones metálicos y proteínas (generalmente especialmente etiquetadas) para separarse; Nucleótidos/coenzima que funciona para separar las deshidrogenasas, quinasas y transaminasas.

Los ácidos nucleicos funcionan para atrapar ARNm, ADN, rRNA y otros ácidos nucleicos/oligonucleótidos. El método de proteína A/G se usa para purificar las inmunoglobulinas.

Los medios especializados están diseñados para una clase o tipo de proteína/enzima específica; Este tipo de medios solo funcionará para separar una proteína o coenzima específica.

inmunoafinidad

Otro uso para el procedimiento es la purificación de afinidad de los anticuerpos del suero sanguíneo. Si se sabe que el suero contiene anticuerpos contra un antígeno específico (por ejemplo, si el suero proviene de un organismo inmunizado contra el antígeno en cuestión), entonces puede usarse para la purificación de afinidad de ese antígeno. Esto también se conoce como cromatografía de inmunoafinidad. Por ejemplo, si un organismo se inmuniza contra una proteína de fusión GST, producirá anticuerpos contra la fusión-proteína, y posiblemente también anticuerpos contra la etiqueta GST. La proteína se puede acoplar covalentemente a un soporte sólido como la agarosa y usarse como ligando de afinidad en purificaciones de anticuerpos del suero inmune.

Para la minuciosidad, la proteína GST y la proteína de fusión GST pueden acoplarse por separado. Inicialmente, el suero se une a la matriz de afinidad GST. Esto eliminará los anticuerpos contra la parte GST de la proteína de fusión. Luego, el suero se separa del soporte sólido y se deja unirse a la matriz de proteína de fusión GST. Esto permite que cualquier anticuerpos que reconozca el antígeno se capturen en el soporte sólido. La elución de los anticuerpos de interés se logra con mayor frecuencia utilizando un tampón de pH bajo como la glicina pH 2.8. El eluato se recoge en un tris neutro o tampón fosfato, para neutralizar el tampón de elución de pH bajo y detener cualquier degradación de la actividad del anticuerpo. Este es un buen ejemplo, ya que la purificación de afinidad se usa para purificar la proteína de fusión GST inicial, para eliminar los anticuerpos anti-GST indeseables del suero y para purificar el anticuerpo objetivo.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden seleccionar para unirse a las proteínas con gran especificidad, donde la proteína se libera en condiciones bastante suaves. Esto puede ser utilizado para futuras investigaciones en el futuro.

A menudo se emplea una estrategia simplificada para purificar los anticuerpos generados contra los antígenos péptidos. Cuando los antígenos peptídicos se producen sintéticamente, se agrega un residuo terminal de cisteína en el extremo N o C del péptido. Este residuo de cisteína contiene un grupo funcional de sulfhidrilo que permite que el péptido se conjuga fácilmente con una proteína portadora (por ejemplo, hemocianina del lápiz de seguridad de la cerradura (KLH)). El mismo péptido que contiene cisteína también se inmoviliza en una resina de agarosa a través del residuo de cisteína y luego se usa para purificar el anticuerpo.

La mayoría de los anticuerpos monoclonales han sido purificados usando cromatografía afinidad basada en la proteína A o Proteína G específica de inmunoglobulina, derivada de bacterias.

La cromatografía de inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales inmovilizados en una columna monolítica se ha utilizado con éxito para capturar vesículas extracelulares (p. ej., exosomas y exómeros) del plasma sanguíneo humano dirigiéndose a las tetraspaninas e integrinas que se encuentran en la superficie de los vehículos eléctricos.

La cromatografía de inmunoafinidad es también la base de las tiras de prueba inmunocromatográfico (TIC), que proporcionan un rápido medio de diagnóstico en el cuidado de los pacientes. Utilizando TIC, un técnico puede hacer una determinación en la cabecera de un paciente, sin necesidad de un laboratorio. La detección de TIC es muy específica para el microbio causando una infección.

Cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados

La cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) se basa en el vínculo covalente específico de los aminoácidos, en particular la histidina, a los metales. Esta técnica funciona permitiendo que las proteínas con una afinidad para los iones de metal se mantengan en una columna que contiene iones de metal inmovilizados, como el cobalto, el níquel o el cobre para la purificación de proteínas o péptidos que contienen histidina, hierro, zinc o gaslio para la purificación de proteínas o péptidos fosforados. Muchas proteínas naturales no tienen una afinidad para iones de metal, por lo tanto la tecnología de ADN recombinante se puede utilizar para introducir tal etiqueta de proteína en el gen pertinente. Los métodos utilizados para eludir la proteína de interés incluyen cambiar el pH, o agregar una molécula competitiva, como el imidazol.

Proteínas recombinantes

Posiblemente el uso más común de la cromatografía de afinidad sea para la purificación de proteínas recombinantes. Las proteínas con una afinidad conocida se etiquetan con el fin de ayudar a su purificación. La proteína puede haber sido modificada genéticamente para permitir su selección por afinidad de unión; esto se conoce como proteína de fusión. Las etiquetas de proteínas incluyen hexahistidina (His), glutatión-S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa (MBP) y la etiqueta CL7 variante colicina E7. Las etiquetas de histidina tienen afinidad por los iones de níquel, cobalto, zinc, cobre y hierro que han sido inmovilizados formando enlaces covalentes coordinados con un quelante incorporado en la fase estacionaria. Para la elución se utiliza una cantidad excesiva de un compuesto capaz de actuar como ligando de un ion metálico, como por ejemplo imidazol. GST tiene afinidad por el glutatión que está disponible comercialmente inmovilizado como glutatión agarosa. Durante la elución, se utiliza un exceso de glutatión para desplazar la proteína marcada. CL7 tiene afinidad y especificidad por la proteína de inmunidad 7 (Im7), que está disponible comercialmente inmovilizada como resina de agarosa Im7. Para la elución, se aplica una proteasa activa y específica del sitio a la resina Im7 para liberar la proteína sin etiquetas.

Lectinas

La cromatografía de afinidad con lectinas es una forma de cromatografía de afinidad en la que se utilizan lectinas para separar componentes dentro de la muestra. Las lectinas, como la concanavalina A, son proteínas que pueden unirse a moléculas de carbohidratos específicas de alfa-D-manosa y alfa-D-glucosa. Algunas moléculas de carbohidratos comunes que se utilizan en la cromatografía de afinidad de lectinas son Con A-Sepharose y WGA-agarosa. Otro ejemplo de lectina es la aglutinina de germen de trigo que se une a la D-N-acetil-glucosamina. La aplicación más común es separar glicoproteínas de proteínas no glicosiladas, o una glicoforma de otra glicoforma. Aunque existen varias formas de realizar cromatografía de afinidad de lectinas, el objetivo es extraer un ligando de azúcar de la proteína deseada.

Especialidad

Otro uso de la cromatografía de afinidad es la purificación de proteínas específicas utilizando una matriz de gel que es exclusiva de una proteína específica. Por ejemplo, la purificación de la β-galactosidasa de E. coli se logra mediante cromatografía de afinidad usando p-aminobenil-1-tio-β-D-galactopiranosil agarosa como matriz de afinidad. La p-aminobenil-1-tio-β-D-galactopiranosil agarosa se utiliza como matriz de afinidad porque contiene un grupo galactopiranosilo, que sirve como un buen sustrato análogo para la β-galactosidasa de E. coli. Esta propiedad permite que la enzima se una a la fase estacionaria de la matriz de afinidad y la β-galactosidasa se eluya agregando concentraciones crecientes de sal a la columna.

Fosfatasa alcalina

La fosfatasa alcalina de E. coli se puede purificar utilizando una matriz de DEAE-celulosa. A. fosfatasa tiene una ligera carga negativa, lo que le permite unirse débilmente a los grupos amino cargados positivamente en la matriz. Luego, la enzima se puede eluir añadiendo tampón con concentraciones de sal más altas.

Cromatografía de afinidad con boronato

La cromatografía de afinidad con boronato consiste en utilizar ácido borónico o boronatos para eluir y cuantificar cantidades de glicoproteínas. Las adaptaciones clínicas han aplicado este tipo de cromatografía para determinar la evaluación a largo plazo de pacientes diabéticos mediante el análisis de su hemoglobina glucosilada.

Purificación de albúmina sérica

La purificación por afinidad de la contaminación por albúmina y macroglobulina es útil para eliminar el exceso de albúmina y la contaminación por α₂-macroglobulina al realizar espectrometría de masas. En la purificación por afinidad de albúmina sérica, el material estacionario utilizado para recolectar o atraer proteínas séricas puede ser Cibacron Blue-Sepharose. Luego, las proteínas séricas se pueden eluir del adsorbente con un tampón que contiene tiocianato (SCN^-).

Cromatografía de afinidad débil

La cromatografía de afinidad débil ( wac ) es una técnica de cromatografía de afinidad para la detección de afinidad en el desarrollo de fármacos. WAC es una técnica cromatográfica líquida basada en la afinidad que separa los compuestos químicos en función de sus diferentes afinidades débiles a un objetivo inmovilizado. Cuanta mayor afinidad tiene un compuesto hacia el objetivo, cuanto más tiempo permanezca en la unidad de separación, y esto se expresará como un tiempo de retención más largo. La medida de afinidad y la clasificación de la afinidad se pueden lograr procesando los tiempos de retención obtenidos de los compuestos analizados. La cromatografía de afinidad es parte de un mayor conjunto de técnicas utilizadas en la identificación del objetivo del fármaco basado en la quimioproteómica.

La tecnología WAC se demuestra contra varios objetivos de proteínas diferentes (proteasas, quinasas, chaperonas y objetivos de interacción proteína -proteína (PPI). Se ha demostrado que WAC es más efectivo que los métodos establecidos para la detección basada en fragmentos.

Historia

La cromatografía de afinidad fue concebida y desarrollada por primera vez por Pedro Cuatrecasas y Meir Wilchek.