Crecimiento celular

Crecimiento celular se refiere a un aumento en la masa total de una célula, incluido el volumen citoplasmático, nuclear y de orgánulos. El crecimiento celular ocurre cuando la tasa general de biosíntesis celular (producción de biomoléculas o anabolismo) es mayor que la tasa general de degradación celular (la destrucción de biomoléculas a través del proteasoma, lisosoma o autofagia o catabolismo).

El crecimiento celular no debe confundirse con la división celular o el ciclo celular, que son procesos distintos que pueden ocurrir junto con el crecimiento celular durante el proceso de proliferación celular, donde una célula, conocida como célula madre, crece y se divide para producir dos células hijas. Es importante destacar que el crecimiento y la división celular también pueden ocurrir de forma independiente el uno del otro. Durante el desarrollo embrionario temprano (escisión del cigoto para formar una mórula y un blastodermo), las divisiones celulares ocurren repetidamente sin crecimiento celular. Por el contrario, algunas células pueden crecer sin división celular o sin ninguna progresión del ciclo celular, como el crecimiento de las neuronas durante la búsqueda de rutas axonales en el desarrollo del sistema nervioso.

En los organismos multicelulares, el crecimiento de tejido rara vez ocurre únicamente a través del crecimiento celular sin división celular, pero con mayor frecuencia ocurre a través de la proliferación celular. Esto se debe a que una sola célula con una sola copia del genoma en el núcleo celular puede realizar la biosíntesis y, por tanto, experimentar un crecimiento celular a sólo la mitad del ritmo de dos células. Por lo tanto, dos células crecen (acumulan masa) al doble de la velocidad de una sola célula, y cuatro células crecen a 4 veces la velocidad de una sola célula. Este principio conduce a un aumento exponencial de la tasa de crecimiento del tejido (acumulación de masa) durante la proliferación celular, debido al aumento exponencial del número de células.

El tamaño de las células depende tanto del crecimiento como de la división celular, con un aumento desproporcionado en la tasa de crecimiento celular que conduce a la producción de células más grandes y un aumento desproporcionado en la tasa de división celular que conduce a la producción de muchas células más pequeñas. La proliferación celular generalmente implica tasas equilibradas de crecimiento y división celular que mantienen un tamaño celular aproximadamente constante en la población de células que prolifera exponencialmente.

Algunas células especiales pueden crecer hasta tamaños muy grandes a través de un ciclo celular de endorreplicación inusual en el que el genoma se replica durante la fase S pero no hay mitosis posterior (fase M) ni división celular (citocinesis). Estas grandes células endorreplicantes tienen muchas copias del genoma, por lo que son altamente poliploides.

Los ovocitos pueden ser células inusualmente grandes en especies cuyo desarrollo embrionario tiene lugar fuera del cuerpo de la madre, dentro de un óvulo que se deposita externamente. El gran tamaño de algunos óvulos se puede lograr bombeando componentes citosólicos desde células adyacentes a través de puentes citoplasmáticos llamados canales anulares (Drosophila) o mediante internalización de gránulos de almacenamiento de nutrientes (gránulos de yema) mediante endocitosis (ranas)..

Mecanismos de control del crecimiento celular

Las células pueden crecer aumentando la tasa general de biosíntesis celular de modo que la producción de biomoléculas exceda la tasa general de degradación celular de biomoléculas a través del proteasoma, lisosoma o autofagia.

La biosíntesis de biomoléculas se inicia mediante la expresión de genes que codifican ARN y/o proteínas, incluidas enzimas que catalizan la síntesis de lípidos y carbohidratos.

Los genes individuales generalmente se expresan mediante la transcripción en ARN mensajero (ARNm) y la traducción en proteínas, y la expresión de cada gen ocurre en varios niveles diferentes de una manera específica para el tipo de célula (en respuesta a las redes reguladoras de genes).

Para impulsar el crecimiento celular, la tasa global de expresión genética se puede aumentar mejorando la tasa general de transcripción mediante la ARN polimerasa II (para genes activos) o la tasa general de traducción del ARNm en proteínas aumentando la abundancia de ribosomas y ARNt., cuya biogénesis depende de la ARN polimerasa I y la ARN polimerasa III. El factor de transcripción Myc es un ejemplo de una proteína reguladora que puede inducir la actividad general de la ARN polimerasa I, la ARN polimerasa II y la ARN polimerasa III para impulsar la transcripción y traducción global y, por tanto, el crecimiento celular.

Además, se puede aumentar la actividad de los ribosomas individuales para aumentar la eficiencia global de la traducción de mRNA mediante la regulación de los factores de iniciación de la traducción, incluyendo el complejo "factor de iniciación de la elongación translacional 4E" (eIF4E), que se une al extremo de 5' de mRNAs. La proteína TOR, parte del complejo TORC1, es un importante regulador de la iniciación de la traducción, así como la biogénesis ribosoma. TOR es una kinasa serina/troonina que puede fosforilar directamente e inactivar un inhibidor general de la eIF4E, llamada proteína de unión 4E (4E-BP), para promover la eficiencia de la traducción. TOR también fosforilatos directos y activa la proteína costosomal S6-kinase (S6K), que promueve la biogénesis ribosoma.

Para inhibir el crecimiento celular, se puede disminuir la tasa global de expresión genética o aumentar la tasa global de degradación biomolecular aumentando la tasa de autofagia. Normalmente, TOR inhibe directamente la función de la quinasa inductora de autofagia Atg1/ULK1. Por lo tanto, la reducción de la actividad de TOR reduce la tasa global de traducción y aumenta el grado de autofagia para reducir el crecimiento celular.

Regulación del crecimiento celular en animales

Muchas de las moléculas de señal que controlan el crecimiento celular se denominan factores de crecimiento, muchas de las cuales inducen la transducción de señales a través de la vía PI3K/AKT/mTOR, que incluye la lípido quinasa PI3K aguas arriba y la proteína quinasa serina/treonina Akt aguas abajo, que es capaz de activar otra proteína quinasa TOR, que promueve la traducción e inhibe la autofagia para impulsar el crecimiento celular.

La disponibilidad de nutrientes influye en la producción de factores de crecimiento de la familia Insulina/IGF-1, que circulan como hormonas en los animales para activar la vía PI3K/AKT/mTOR en las células para promover la actividad TOR de modo que cuando los animales estén bien alimentados crezcan. rápidamente y cuando no sean capaces de recibir suficientes nutrientes reducirán su tasa de crecimiento. Recientemente también se ha demostrado que el metabolismo del bicarbonato celular, responsable del crecimiento celular, puede regularse mediante la señalización de mTORC1.

Además, la disponibilidad de aminoácidos para las células individuales también promueve directamente la actividad TOR, aunque este modo de regulación es más importante en organismos unicelulares que en organismos multicelulares como los animales que siempre mantienen una abundancia de aminoácidos en circulación..

Una teoría controvertida propone que muchas células de mamíferos diferentes experimentan transiciones dependientes del tamaño durante el ciclo celular. Estas transiciones están controladas por la quinasa Cdk1 dependiente de ciclina. Aunque se conocen bien las proteínas que controlan Cdk1, su conexión con los mecanismos que monitorean el tamaño celular sigue siendo difícil de alcanzar.

Un modelo postulado para el control del tamaño de los mamíferos sitúa la masa como la fuerza impulsora del ciclo celular. Una célula no puede crecer hasta alcanzar un tamaño anormalmente grande porque, a partir de cierto tamaño o masa celular, se inicia la fase S. La fase S inicia la secuencia de eventos que conducen a la mitosis y la citocinesis. Una célula no puede volverse demasiado pequeña porque los eventos posteriores del ciclo celular, como S, G2 y M, se retrasan hasta que la masa aumenta lo suficiente para comenzar la fase S.

Población celular

Las poblaciones celulares atraviesan un tipo particular de crecimiento exponencial llamado duplicación o proliferación celular. Así, cada generación de células debe ser el doble de numerosa que la generación anterior. Sin embargo, el número de generaciones sólo da una cifra máxima ya que no todas las células sobreviven en cada generación. Las células pueden reproducirse en la etapa de Mitosis, donde se duplican y se dividen en dos células genéticamente iguales.

Tamaño de celda

El tamaño de las células es muy variable entre los organismos, y algunas algas como Caulerpa taxifolia son una sola célula de varios metros de longitud. Las células vegetales son mucho más grandes que las células animales, y los protistas como el Paramecium pueden medir 330 μm de largo, mientras que una célula humana típica puede medir 10 μm. Cómo estas células "deciden" qué tamaño deben tener antes de dividirse es una cuestión abierta. Se sabe que los gradientes químicos son en parte responsables y se plantea la hipótesis de que está implicada la detección de estrés mecánico por parte de las estructuras citoesqueléticas. El trabajo sobre el tema generalmente requiere un organismo cuyo ciclo celular esté bien caracterizado.

Regulación del tamaño de las células de levadura

La relación entre el tamaño celular y la división celular se ha estudiado ampliamente en la levadura. Para algunas células, existe un mecanismo por el cual la división celular no se inicia hasta que la célula ha alcanzado un cierto tamaño. Si se restringe el suministro de nutrientes (después del tiempo t = 2 en el diagrama a continuación) y se ralentiza la tasa de aumento del tamaño celular, el período de tiempo entre divisiones celulares aumenta. Se aislaron mutantes del tamaño de células de levadura que comienzan la división celular antes de alcanzar un tamaño normal/regular (mutantes wee).

La proteína Wee1 es una tirosina quinasa que normalmente fosforila la proteína reguladora del ciclo celular Cdc2 (el homólogo de CDK1 en humanos), una quinasa dependiente de ciclina, en un residuo de tirosina. Cdc2 impulsa la entrada en la mitosis fosforilando una amplia gama de objetivos. Esta modificación covalente de la estructura molecular de Cdc2 inhibe la actividad enzimática de Cdc2 y previene la división celular. Wee1 actúa para mantener inactivo a Cdc2 durante las primeras etapas de G2, cuando las células aún son pequeñas. Cuando las células han alcanzado un tamaño suficiente durante G2, la fosfatasa Cdc25 elimina la fosforilación inhibidora y, por lo tanto, activa Cdc2 para permitir la entrada mitótica. El sistema de control de entrada mitótica coordina el equilibrio de la actividad de Wee1 y Cdc25 con cambios en el tamaño celular. Se ha demostrado en mutantes Wee1, células con actividad Wee1 debilitada, que Cdc2 se activa cuando la célula es más pequeña. Por tanto, la mitosis se produce antes de que la levadura alcance su tamaño normal. Esto sugiere que la división celular puede regularse en parte mediante la dilución de la proteína Wee1 en las células a medida que crecen.

Vincular Cdr2 a Wee1

La proteína quinasa Cdr2 (que regula negativamente Wee1) y la quinasa Cdr1 relacionada con Cdr2 (que fosforila e inhibe directamente Wee1 in vitro) se localizan en una banda de ganglios corticales en medio de la interfase. células. Después de la entrada en la mitosis, los factores de citocinesis como la miosina II se reclutan en ganglios similares; estos nodos eventualmente se condensan para formar el anillo citocinético. Se descubrió que una proteína previamente no caracterizada, Blt1, se colocaliza con Cdr2 en los ganglios de la interfase medial. Las células knockout Blt1 tenían una mayor longitud en el momento de la división, lo que es consistente con un retraso en la entrada mitótica. Este hallazgo conecta una ubicación física, una banda de nodos corticales, con factores que se ha demostrado que regulan directamente la entrada mitótica, a saber, Cdr1, Cdr2 y Blt1.

Experimentos adicionales con proteínas marcadas con GFP y proteínas mutantes indican que los ganglios corticales mediales están formados por el ensamblaje ordenado, dependiente de Cdr2, de múltiples proteínas que interactúan durante la interfase. Cdr2 está en la cima de esta jerarquía y funciona en sentido ascendente de Cdr1 y Blt1. La mitosis es promovida por la regulación negativa de Wee1 por Cdr2. También se ha demostrado que Cdr2 recluta a Wee1 en el nodo cortical medial. El mecanismo de este reclutamiento aún no se ha descubierto. Un mutante de la quinasa Cdr2, que es capaz de localizarse adecuadamente a pesar de una pérdida de función en la fosforilación, interrumpe el reclutamiento de Wee1 en la corteza medial y retrasa la entrada en la mitosis. Por lo tanto, Wee1 se localiza con su red inhibidora, lo que demuestra que la mitosis se controla mediante la regulación negativa de Wee1 dependiente de Cdr2 en los ganglios corticales mediales.

Factores de polaridad celular

Los factores de polaridad celular ubicados en las puntas de las células proporcionan señales espaciales para limitar la distribución de Cdr2 al centro de la célula. En la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe (S. Pombe), las células se dividen en un tamaño definido y reproducible durante la mitosis debido a la actividad regulada de Cdk1. La proteína quinasa de polaridad celular Pom1, un miembro de la familia de quinasas quinasas reguladas por fosforilación de tirosina (DYRK) de especificidad dual, se localiza en los extremos de las células. En las células knockout de Pom1, Cdr2 ya no estaba restringido al centro de la célula, sino que se veía de forma difusa en la mitad de la célula. A partir de estos datos se hace evidente que Pom1 proporciona señales inhibidoras que confinan a Cdr2 en el centro de la célula. Se ha demostrado además que las señales dependientes de Pom1 conducen a la fosforilación de Cdr2. También se demostró que las células knockout de Pom1 se dividen en un tamaño más pequeño que las de tipo salvaje, lo que indica una entrada prematura en la mitosis.

Pom1 forma gradientes polares que alcanzan su punto máximo en los extremos de la célula, lo que muestra un vínculo directo entre los factores de control del tamaño y una ubicación física específica en la célula. A medida que una célula aumenta de tamaño, crece un gradiente en Pom1. Cuando las células son pequeñas, Pom1 se distribuye de forma difusa por todo el cuerpo celular. A medida que la célula aumenta de tamaño, la concentración de Pom1 disminuye en el medio y se concentra en los extremos de la célula. Las células pequeñas en G2 temprano que contienen niveles suficientes de Pom1 en toda la célula tienen Cdr2 inactivo y no pueden entrar en mitosis. No es hasta que las células crecen hasta llegar a G2, cuando Pom1 se limita a los extremos de las células, que Cdr2 en los ganglios corticales mediales se activa y puede iniciar la inhibición de Wee1. Este hallazgo muestra cómo el tamaño celular juega un papel directo en la regulación del inicio de la mitosis. En este modelo, Pom1 actúa como un vínculo molecular entre el crecimiento celular y la entrada mitótica a través de una vía Cdr2-Cdr1-Wee1-Cdk1. El gradiente polar Pom1 transmite con éxito información sobre el tamaño y la geometría de las células al sistema regulador Cdk1. A través de este gradiente, la célula se asegura de haber alcanzado un tamaño definido y suficiente para entrar en la mitosis.

Otros sistemas experimentales para el estudio de la regulación del tamaño celular

Un medio común para producir células muy grandes es mediante la fusión celular para formar sincitios. Por ejemplo, las células del músculo esquelético muy largas (varias pulgadas) se forman mediante la fusión de miles de miocitos. Los estudios genéticos de la mosca de la fruta Drosophila han revelado varios genes necesarios para la formación de células musculares multinucleadas mediante la fusión de mioblastos. Algunas de las proteínas clave son importantes para la adhesión celular entre miocitos y algunas están involucradas en la transducción de señales de célula a célula dependiente de la adhesión que permite una cascada de eventos de fusión celular.

El aumento en el tamaño de las células vegetales se complica por el hecho de que casi todas las células vegetales están dentro de una pared celular sólida. Bajo la influencia de ciertas hormonas vegetales, la pared celular puede remodelarse, permitiendo aumentos en el tamaño de las células que son importantes para el crecimiento de algunos tejidos vegetales.

La mayoría de los organismos unicelulares son de tamaño microscópico, pero hay algunas bacterias y protozoos gigantes que son visibles a simple vista. (Ver Tabla de tamaños de células: poblaciones densas de una bacteria gigante de azufre en los sedimentos de la plataforma de Namibia; grandes protistas del género Chaos, estrechamente relacionados con el género Amoeba).

En las bacterias con forma de bastón E. coli, Caulobacter crescentus y B. subtilis el tamaño celular está controlado por mecanismos simples en los que la división celular ocurre después de que se ha agregado un volumen constante desde la división anterior. Al crecer siempre en la misma cantidad, las células que nacen más pequeñas o más grandes que el promedio convergen naturalmente a un tamaño promedio equivalente a la cantidad agregada durante cada generación.

División celular

La reproducción celular es asexual. Para la mayoría de los constituyentes de la célula, el crecimiento es un proceso constante y continuo, que se interrumpe sólo brevemente en la fase M, cuando el núcleo y luego la célula se dividen en dos.

El proceso de división celular, llamado ciclo celular, tiene cuatro partes principales llamadas fases. La primera parte, llamada fase G₁, está marcada por la síntesis de varias enzimas necesarias para la replicación del ADN. La segunda parte del ciclo celular es la fase S, donde la replicación del ADN produce dos conjuntos idénticos de cromosomas. La tercera parte es la fase G₂ en la que se produce una importante síntesis de proteínas, que implica principalmente la producción de microtúbulos que se requieren durante el proceso de división, llamado mitosis. La cuarta fase, fase M, consiste en la división nuclear (cariocinesis) y la división citoplasmática (citocinesis), acompañadas de la formación de una nueva membrana celular. Esta es la división física de las células madre e hija. La fase M se ha dividido en varias fases distintas, conocidas secuencialmente como profase, prometafase, metafase, anafase y telofase que conducen a la citocinesis.

La división celular es más compleja en los eucariotas que en otros organismos. Las células procarióticas, como las bacterias, se reproducen mediante fisión binaria, un proceso que incluye la replicación del ADN, la segregación cromosómica y la citocinesis. La división de las células eucariotas implica mitosis o un proceso más complejo llamado meiosis. La mitosis y la meiosis a veces se denominan los dos procesos de división nuclear. La fisión binaria es similar a la reproducción de células eucariotas que implica mitosis. Ambos conducen a la producción de dos células hijas con el mismo número de cromosomas que la célula parental. La meiosis se utiliza para un proceso especial de reproducción celular de organismos diploides. Produce cuatro células hijas especiales (gametos) que tienen la mitad de la cantidad celular normal de ADN. Luego, un gameto masculino y uno femenino pueden combinarse para producir un cigoto, una célula que nuevamente tiene la cantidad normal de cromosomas.

El resto de este artículo es una comparación de las características principales de los tres tipos de reproducción celular que involucran fisión binaria, mitosis o meiosis. El siguiente diagrama muestra las similitudes y diferencias de estos tres tipos de reproducción celular.

Comparación de los tres tipos de división celular

El contenido de ADN de una célula se duplica al inicio del proceso de reproducción celular. Antes de la replicación del ADN, el contenido de ADN de una célula se puede representar como la cantidad Z (la célula tiene cromosomas Z). Después del proceso de replicación del ADN, la cantidad de ADN en la célula es 2Z (multiplicación: 2 x Z = 2Z). Durante la fisión binaria y la mitosis, el contenido de ADN duplicado de la célula parental en reproducción se separa en dos mitades iguales que están destinadas a terminar en las dos células hijas. La parte final del proceso de reproducción celular es la división celular, cuando las células hijas se separan físicamente de una célula parental. Durante la meiosis, hay dos pasos de división celular que juntos producen las cuatro células hijas.

Después de completar la fisión binaria o la reproducción celular que implica mitosis, cada célula hija tiene la misma cantidad de ADN (Z) que tenía la célula parental antes de replicar su ADN. Estos dos tipos de reproducción celular produjeron dos células hijas que tienen la misma cantidad de cromosomas que la célula parental. Los cromosomas se duplican antes de la división celular cuando se forman nuevas células de la piel para la reproducción. Después de la reproducción de las células meióticas, las cuatro células hijas tienen la mitad del número de cromosomas que tenía originalmente la célula parental. Esta es la cantidad haploide de ADN, a menudo simbolizada como N. Los organismos diploides utilizan la meiosis para producir gametos haploides. En un organismo diploide como el organismo humano, la mayoría de las células del cuerpo tienen la cantidad diploide de ADN, 2N. Usando esta notación para contar cromosomas, decimos que las células somáticas humanas tienen 46 cromosomas (2N = 46), mientras que los espermatozoides y los óvulos humanos tienen 23 cromosomas (N = 23). Los humanos tenemos 23 tipos distintos de cromosomas, los 22 autosomas y la categoría especial de cromosomas sexuales. Hay dos cromosomas sexuales distintos, el cromosoma X y el cromosoma Y. Una célula humana diploide tiene 23 cromosomas del padre de esa persona y 23 de la madre. Es decir, tu cuerpo tiene dos copias del cromosoma humano número 2, una de cada uno de tus padres.

Inmediatamente después de la replicación del ADN, una célula humana tendrá 46 "cromosomas dobles". En cada cromosoma doble hay dos copias de la molécula de ADN de ese cromosoma. Durante la mitosis, los cromosomas dobles se dividen para producir 92 "cromosomas simples", la mitad de los cuales van a cada célula hija. Durante la meiosis, hay dos pasos de separación de los cromosomas que aseguran que cada una de las cuatro células hijas obtenga una copia de cada uno de los 23 tipos de cromosomas.

Reproducción sexual

Aunque la reproducción celular que utiliza la mitosis puede reproducir células eucariotas, los eucariotas se molestan con el proceso más complicado de la meiosis porque la reproducción sexual como la meiosis confiere una ventaja selectiva. Observe que cuando comienza la meiosis, las dos copias de los cromatados hermana número 2 están adyacentes entre sí. Durante este tiempo, puede haber eventos de recombinación genética. La información del cromosoma 2 ADN obtenido de un padre (rojo) se transferirá a la molécula de ADN cromosoma 2 que fue recibida del otro padre (verde). Observe que en la mitosis las dos copias del cromosoma número 2 no interactúan. Recombination of genetic information between homologous chromosomes during meiosis is a process for repairing DNA damages. Este proceso también puede producir nuevas combinaciones de genes, algunos de los cuales pueden ser adaptablemente beneficiosos e influir en el curso de la evolución. Sin embargo, en organismos con más de un conjunto de cromosomas en la etapa principal del ciclo de vida, el sexo también puede proporcionar una ventaja porque, bajo el apareamiento aleatorio, produce homozygotes y heterocigotes según la relación Hardy-Weinberg.

Trastornos

Pueden producirse una serie de trastornos del crecimiento a nivel celular y, en consecuencia, sustentan gran parte del curso posterior del cáncer, en el que un grupo de células muestra un crecimiento y una división descontrolados más allá de los límites normales, invasión (intrusión y destrucción de tejidos adyacentes) y, a veces, metástasis (diseminación a otras partes del cuerpo a través de la linfa o la sangre). Varios determinantes clave del crecimiento celular, como la ploidía y la regulación del metabolismo celular, suelen verse alterados en los tumores. Por lo tanto, el crecimiento celular heterogéneo y el pleomorfismo es una de las primeras características de la progresión del cáncer. A pesar de la prevalencia del pleomorfismo en la patología humana, su papel en la progresión de la enfermedad no está claro. En los tejidos epiteliales, la mala regulación del tamaño celular puede inducir defectos de empaquetamiento y dispersar células aberrantes. Pero se desconocen las consecuencias del crecimiento celular atípico en otros tejidos animales.

Métodos de medición

El crecimiento celular se puede detectar mediante una variedad de métodos. El crecimiento del tamaño de las células se puede visualizar mediante microscopía, utilizando tinciones adecuadas. Pero el aumento del número de células suele ser más significativo. Se puede medir mediante el recuento manual de células bajo observación microscópica, utilizando el método de exclusión de colorante (es decir, azul tripano) para contar sólo las células viables. Los métodos menos exigentes y escalables incluyen el uso de citómetros, mientras que la citometría de flujo permite combinar recuentos de células ('eventos') con otros parámetros específicos: sondas fluorescentes para membranas, citoplasma o núcleos permiten distinguir células muertas/viables, células tipos, diferenciación celular, expresión de un biomarcador como Ki67.

Además del aumento del número de células, se puede evaluar el crecimiento de la actividad metabólica, es decir, el CFDA y la calceína-AM miden (fluorimétricamente) no sólo la funcionalidad de la membrana (retención de colorante), sino también la funcionalidad de las enzimas citoplasmáticas. (esterasas). Los ensayos MTT (colorimétricos) y el ensayo de resazurina (fluorimétrico) dosifican el potencial redox mitocondrial.

Todos estos ensayos pueden correlacionarse bien o no, dependiendo de las condiciones de crecimiento celular y los aspectos deseados (actividad, proliferación). La tarea es aún más complicada con poblaciones de diferentes células, además cuando se combinan interferencias en el crecimiento celular o toxicidad.

Libros

• Morgan, David O. (2007). El ciclo celular: principios de control. Londres: Sunderland, Mass. ISBN 978-0-9539181-2-6.