Clonación molecular

La clonación molecular es un conjunto de métodos experimentales en biología molecular que se utilizan para ensamblar moléculas de ADN recombinante y para dirigir su replicación dentro de los organismos huéspedes. El uso de la palabra clonación se refiere al hecho de que el método involucra la replicación de una molécula para producir una población de células con moléculas de ADN idénticas. La clonación molecular generalmente usa secuencias de ADN de dos organismos diferentes: la especie que es la fuente del ADN que se va a clonar y la especie que servirá como huésped vivo para la replicación del ADN recombinante. Los métodos de clonación molecular son fundamentales para muchas áreas contemporáneas de la biología y la medicina modernas.

En un experimento de clonación molecular convencional, el ADN que se va a clonar se obtiene de un organismo de interés y luego se trata con enzimas en el tubo de ensayo para generar fragmentos de ADN más pequeños. Posteriormente, estos fragmentos se combinan con el vector de ADN para generar moléculas de ADN recombinante. A continuación, el ADN recombinante se introduce en un organismo huésped (normalmente, una cepa de laboratorio benigna y fácil de cultivar de la bacteria E. coli). Esto generará una población de organismos en los que las moléculas de ADN recombinante se replican junto con el ADN del huésped. Debido a que contienen fragmentos de ADN extraños, estos son microorganismos transgénicos o genéticamente modificados (OGM).Este proceso aprovecha el hecho de que se puede inducir a una sola célula bacteriana para que absorba y replique una sola molécula de ADN recombinante. Esta única célula se puede expandir exponencialmente para generar una gran cantidad de bacterias, cada una de las cuales contiene copias de la molécula recombinante original. Por lo tanto, tanto la población bacteriana resultante como la molécula de ADN recombinante se denominan comúnmente "clones". Estrictamente hablando, el ADN recombinante se refiere a moléculas de ADN, mientras que la clonación molecularse refiere a los métodos experimentales utilizados para ensamblarlos. Surgió la idea de que diferentes secuencias de ADN podrían insertarse en un plásmido y que estas secuencias extrañas serían transportadas a bacterias y digeridas como parte del plásmido. Es decir, estos plásmidos podrían servir como vectores de clonación para transportar genes.

Prácticamente cualquier secuencia de ADN se puede clonar y amplificar, pero existen algunos factores que pueden limitar el éxito del proceso. Ejemplos de secuencias de ADN que son difíciles de clonar son repeticiones invertidas, orígenes de replicación, centrómeros y telómeros. También hay menos posibilidades de éxito cuando se insertan secuencias de ADN de gran tamaño. Las inserciones de más de 10 kpb tienen un éxito muy limitado, pero los bacteriófagos como el bacteriófago λ se pueden modificar para insertar con éxito una secuencia de hasta 40 kpb.

Historia

Antes de la década de 1970, la comprensión de la genética y la biología molecular se vio gravemente obstaculizada por la incapacidad de aislar y estudiar genes individuales de organismos complejos. Esto cambió drásticamente con la llegada de los métodos de clonación molecular. Los microbiólogos, que buscaban comprender los mecanismos moleculares a través de los cuales las bacterias restringían el crecimiento de bacteriófagos, aislaron endonucleasas de restricción, enzimas que podían escindir moléculas de ADN solo cuando se encontraban secuencias de ADN específicas.Demostraron que las enzimas de restricción escindían moléculas de ADN de longitud cromosómica en lugares específicos, y que secciones específicas de la molécula más grande podían purificarse mediante fraccionamiento por tamaño. Usando una segunda enzima, la ADN ligasa, los fragmentos generados por las enzimas de restricción podrían unirse en nuevas combinaciones, denominadas ADN recombinante. Mediante la recombinación de segmentos de ADN de interés con ADN vector, como bacteriófagos o plásmidos, que se replican naturalmente dentro de las bacterias, se podrían producir grandes cantidades de moléculas de ADN recombinante purificado en cultivos bacterianos. Las primeras moléculas de ADN recombinante se generaron y estudiaron en 1972.

Visión general

La clonación molecular aprovecha el hecho de que la estructura química del ADN es fundamentalmente la misma en todos los organismos vivos. Por lo tanto, si cualquier segmento de ADN de cualquier organismo se inserta en un segmento de ADN que contiene las secuencias moleculares necesarias para la replicación del ADN, y el ADN recombinante resultante se introduce en el organismo del que se obtuvieron las secuencias de replicación, el ADN extraño se replicará. junto con el ADN de la célula huésped en el organismo transgénico.

La clonación molecular es similar a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en que permite la replicación de la secuencia de ADN. La diferencia fundamental entre los dos métodos es que la clonación molecular implica la replicación del ADN en un microorganismo vivo, mientras que la PCR replica el ADN en una solución in vitro, libre de células vivas.

Clonación y simulaciones in silico

Antes de que los experimentos de clonación reales se realicen en el laboratorio, la mayoría de los experimentos de clonación se planifican en una computadora, utilizando un software especializado. Aunque la planificación detallada de la clonación se puede realizar en cualquier editor de texto, junto con las utilidades en línea para, por ejemplo, el diseño de cebadores de PCR, existe un software dedicado para este fin. El software para este fin incluye, por ejemplo, ApE [1] (código abierto), DNAStrider [2] (código abierto), Serial Cloner [3] (gratis), Collagene [4] (código abierto) y SnapGene (comercial). Estos programas permiten simular reacciones de PCR, digestos de restricción, ligaduras, etc., es decir, todos los pasos que se describen a continuación.

Pasos

En los experimentos estándar de clonación molecular, la clonación de cualquier fragmento de ADN implica esencialmente siete pasos: (1) Elección del organismo huésped y el vector de clonación, (2) Preparación del vector de ADN, (3) Preparación del ADN que se va a clonar, (4) Creación de ADN recombinante, (5) Introducción de ADN recombinante en el organismo huésped, (6) Selección de organismos que contienen ADN recombinante, (7) Selección de clones con insertos de ADN deseados y propiedades biológicas.

En particular, la creciente capacidad y fidelidad de las plataformas de síntesis de ADN permite diseños cada vez más complejos en ingeniería molecular. Estos proyectos pueden incluir hebras muy largas de nuevas secuencias de ADN y/o probar bibliotecas completas simultáneamente, en lugar de secuencias individuales. Estos cambios introducen una complejidad que requiere que el diseño se aleje de la representación plana basada en nucleótidos y se dirija hacia un mayor nivel de abstracción. Ejemplos de tales herramientas son GenoCAD, Teselagen [5] (gratis para académicos) o GeneticConstructor [6] (gratis para académicos).

Elección del organismo huésped y del vector de clonación

Aunque se utiliza un gran número de organismos huéspedes y vectores de clonación molecular, la gran mayoría de los experimentos de clonación molecular comienzan con una cepa de laboratorio de la bacteria E. coli (Escherichia coli) y un vector de clonación de plásmido. Los vectores de E. coli y plásmidos son de uso común porque son técnicamente sofisticados, versátiles, ampliamente disponibles y ofrecen un crecimiento rápido de organismos recombinantes con un equipo mínimo. Si el ADN que se va a clonar es excepcionalmente grande (de cientos de miles a millones de pares de bases), a menudo se elige un cromosoma artificial bacteriano o un vector cromosómico artificial de levadura.

Las aplicaciones especializadas pueden requerir sistemas de vector de host especializados. Por ejemplo, si los experimentadores desean recolectar una proteína particular del organismo recombinante, entonces se elige un vector de expresión que contenga señales apropiadas para la transcripción y traducción en el organismo huésped deseado. Alternativamente, si se desea la replicación del ADN en diferentes especies (por ejemplo, transferencia de ADN de bacterias a plantas), entonces se puede seleccionar un vector de variedad de huéspedes múltiples (también denominado vector lanzadera). Sin embargo, en la práctica, los experimentos de clonación molecular especializada suelen comenzar con la clonación en un plásmido bacteriano, seguido de la subclonación en un vector especializado.

Cualquiera que sea la combinación de huésped y vector que se utilice, el vector casi siempre contiene cuatro segmentos de ADN que son de importancia crítica para su función y utilidad experimental:

• El origen de la replicación del ADN es necesario para que el vector (y sus secuencias recombinantes vinculadas) se replique dentro del organismo huésped.
• uno o más sitios únicos de reconocimiento de endonucleasas de restricción que sirven como sitios donde se puede introducir ADN extraño
• un gen marcador genético seleccionable que se puede utilizar para permitir la supervivencia de células que han tomado secuencias de vectores
• un gen marcador que se puede usar para detectar células que contienen el ADN extraño

Preparación de vector de ADN

El vector de clonación se trata con una endonucleasa de restricción para escindir el ADN en el sitio donde se insertará el ADN extraño. La enzima de restricción se elige para generar una configuración en el sitio de escisión que sea compatible con los extremos del ADN extraño (ver extremo del ADN). Normalmente, esto se hace cortando el ADN del vector y el ADN extraño con la misma enzima de restricción, por ejemplo, EcoRI. La mayoría de los vectores modernos contienen una variedad de sitios de división convenientes que son únicos dentro de la molécula del vector (por lo que el vector solo puede dividirse en un solo sitio) y están ubicados dentro de un gen (frecuentemente beta-galactosidasa) cuya inactivación puede usarse para distinguir recombinante a partir de organismos no recombinantes en un paso posterior del proceso. Para mejorar la proporción de organismos recombinantes a no recombinantes, el vector cortado se puede tratar con una enzima (fosfatasa alcalina) que desfosforila los extremos del vector. Las moléculas de vector con extremos desfosforilados no pueden replicarse y la replicación solo puede restaurarse si el ADN extraño se integra en el sitio de escisión.

Preparación del ADN a clonar

Para la clonación de ADN genómico, el ADN a clonar se extrae del organismo de interés. Se puede utilizar prácticamente cualquier fuente de tejido (incluso tejidos de animales extinguidos), siempre que el ADN no se degrade en gran medida. Luego, el ADN se purifica utilizando métodos simples para eliminar las proteínas contaminantes (extracción con fenol), el ARN (ribonucleasa) y las moléculas más pequeñas (precipitación y/o cromatografía). Los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizan a menudo para la amplificación de secuencias específicas de ADN o ARN (RT-PCR) antes de la clonación molecular.

El ADN para experimentos de clonación también puede obtenerse a partir de ARN utilizando transcriptasa inversa (clonación de ADN complementario o ADNc), o en forma de ADN sintético (síntesis de genes artificiales). La clonación de ADNc suele utilizarse para obtener clones representativos de la población de ARNm de las células de interés, mientras que el ADN sintético se utiliza para obtener cualquier secuencia precisa definida por el diseñador. Tal secuencia diseñada puede ser necesaria cuando se mueven genes a través de códigos genéticos (por ejemplo, desde la mitocondria hasta el núcleo) o simplemente para aumentar la expresión a través de la optimización de codones.

A continuación, el ADN purificado se trata con una enzima de restricción para generar fragmentos con extremos capaces de unirse a los del vector. Si es necesario, se pueden agregar segmentos cortos de ADN de doble cadena (conectores) que contengan los sitios de restricción deseados para crear estructuras finales que sean compatibles con el vector.

Creación de ADN recombinante con ADN ligasa

La creación de ADN recombinante es, en muchos sentidos, el paso más simple del proceso de clonación molecular. El ADN preparado a partir del vector y la fuente externa simplemente se mezcla en concentraciones apropiadas y se expone a una enzima (ADN ligasa) que une covalentemente los extremos. Esta reacción de unión a menudo se denomina ligadura. La mezcla de ADN resultante que contiene extremos unidos aleatoriamente está lista para su introducción en el organismo huésped.

La ligasa de ADN solo reconoce y actúa en los extremos de las moléculas de ADN lineales, lo que generalmente da como resultado una mezcla compleja de moléculas de ADN con extremos unidos al azar. Los productos deseados (ADN de vector unido covalentemente a ADN extraño) estarán presentes, pero otras secuencias (p. ej., ADN extraño unido a sí mismo, ADN de vector unido a sí mismo y combinaciones de orden superior de ADN de vector y extraño) también suelen estar presentes. Esta mezcla compleja se clasifica en pasos posteriores del proceso de clonación, después de que la mezcla de ADN se introduce en las células.

Introducción de ADN recombinante en el organismo huésped

La mezcla de ADN, previamente manipulada in vitro, se traslada de nuevo a una célula viva, denominada organismo huésped. Los métodos utilizados para obtener ADN en las células son variados, y el nombre que se aplica a este paso en el proceso de clonación molecular a menudo dependerá del método experimental elegido (p. ej., transformación, transducción, transfección, electroporación).

Cuando los microorganismos pueden captar y replicar el ADN de su entorno local, el proceso se denomina transformación, y se dice que las células que se encuentran en un estado fisiológico tal que pueden captar el ADN son competentes. En el cultivo de células de mamíferos, el proceso análogo de introducir ADN en las células se denomina comúnmente transfección. Tanto la transformación como la transfección normalmente requieren la preparación de las células a través de un régimen de crecimiento especial y un proceso de tratamiento químico que variará con las especies específicas y los tipos de células que se utilicen.

La electroporación utiliza pulsos eléctricos de alto voltaje para trasladar el ADN a través de la membrana celular (y la pared celular, si está presente). Por el contrario, la transducción implica el empaquetamiento de ADN en partículas derivadas de virus y el uso de estas partículas similares a virus para introducir el ADN encapsulado en la célula a través de un proceso similar a una infección viral. Aunque la electroporación y la transducción son métodos altamente especializados, pueden ser los métodos más eficientes para mover el ADN a las células.

Selección de organismos que contienen secuencias de vectores

Cualquiera que sea el método que se utilice, la introducción de ADN recombinante en el organismo huésped elegido suele ser un proceso de baja eficiencia; es decir, solo una pequeña fracción de las células captará realmente el ADN. Los científicos experimentales abordan este problema a través de un paso de selección genética artificial, en el que las células que no han absorbido el ADN se eliminan selectivamente, y solo aquellas células que pueden replicar activamente el ADN que contiene el gen marcador seleccionable codificado por el vector pueden sobrevivir.

Cuando se utilizan células bacterianas como organismos huéspedes, el marcador seleccionable suele ser un gen que confiere resistencia a un antibiótico que, de otro modo, mataría las células, normalmente la ampicilina. Las células que albergan el plásmido sobrevivirán cuando se expongan al antibiótico, mientras que aquellas que no hayan podido absorber las secuencias del plásmido morirán. Cuando se utilizan células de mamífero (p. ej., células humanas o de ratón), se utiliza una estrategia similar, excepto que el gen marcador (en este caso, normalmente codificado como parte del casete kanMX) confiere resistencia al antibiótico Geneticina.

Detección de clones con insertos de ADN deseados y propiedades biológicas

Los vectores de clonación bacterianos modernos (p. ej., pUC19 y derivados posteriores, incluidos los vectores pGEM) utilizan el sistema de cribado azul-blanco para distinguir las colonias (clones) de células transgénicas de las que contienen el vector parental (es decir, vector de ADN sin secuencia recombinante insertada). En estos vectores, el ADN extraño se inserta en una secuencia que codifica una parte esencial de la beta-galactosidasa, una enzima cuya actividad da como resultado la formación de una colonia de color azul en el medio de cultivo que se utiliza para este trabajo. La inserción del ADN extraño en la secuencia codificante de la beta-galactosidasa desactiva la función de la enzima, de modo que las colonias que contienen el ADN transformado permanecen incoloras (blancas). Por lo tanto, los experimentadores pueden fácilmente identificar y realizar más estudios sobre clones bacterianos transgénicos,

La población total de clones individuales obtenidos en un experimento de clonación molecular a menudo se denomina biblioteca de ADN. Las bibliotecas pueden ser muy complejas (como cuando se clona el ADN genómico completo de un organismo) o relativamente simples (como cuando se mueve un fragmento de ADN previamente clonado a un plásmido diferente), pero casi siempre es necesario examinar varios clones diferentes para estar seguro. que se obtiene la construcción de ADN deseada. Esto se puede lograr a través de una amplia gama de métodos experimentales, incluido el uso de hibridaciones de ácidos nucleicos, sondas de anticuerpos, reacción en cadena de la polimerasa, análisis de fragmentos de restricción y/o secuenciación de ADN.

Aplicaciones

La clonación molecular proporciona a los científicos una cantidad esencialmente ilimitada de cualquier segmento de ADN individual derivado de cualquier genoma. Este material se puede utilizar para una amplia gama de propósitos, incluidos los de la ciencia biológica básica y aplicada. Algunas de las aplicaciones más importantes se resumen aquí.

Organización del genoma y expresión génica.

La clonación molecular ha conducido directamente a la elucidación de la secuencia de ADN completa de los genomas de un gran número de especies y a la exploración de la diversidad genética dentro de especies individuales, trabajo que se ha realizado principalmente mediante la determinación de la secuencia de ADN de un gran número de muestras aleatorias. fragmentos clonados del genoma y ensamblando las secuencias superpuestas. Además, la clonación se puede utilizar para producir terapias génicas para el tratamiento de indicaciones de enfermedades graves, como la fibrosis quística, el cáncer, el SIDA y otras. Es interesante señalar que la clonación de genes puede ser una posible solución a la escasez de órganos. También juega un papel importante en la síntesis de antibióticos, vitaminas y hormonas.

A nivel de genes individuales, los clones moleculares se utilizan para generar sondas que se utilizan para examinar cómo se expresan los genes y cómo se relaciona esa expresión con otros procesos biológicos, incluido el entorno metabólico, las señales extracelulares, el desarrollo, el aprendizaje, la senescencia y la muerte celular Los genes clonados también pueden proporcionar herramientas para examinar la función biológica y la importancia de genes individuales, al permitir que los investigadores inactiven los genes o realicen mutaciones más sutiles mediante mutagénesis regional o mutagénesis dirigida al sitio. Los genes clonados en vectores de expresión para la clonación funcional proporcionan un medio para detectar genes sobre la base de la función de la proteína expresada.

Producción de proteínas recombinantes

La obtención del clon molecular de un gen puede conducir al desarrollo de organismos que produzcan el producto proteico de los genes clonados, denominado proteína recombinante. En la práctica, con frecuencia es más difícil desarrollar un organismo que produzca una forma activa de la proteína recombinante en cantidades deseables que clonar el gen. Esto se debe a que las señales moleculares para la expresión génica son complejas y variables, y porque el plegamiento, la estabilidad y el transporte de proteínas pueden ser muy desafiantes.

Muchas proteínas útiles están actualmente disponibles como productos recombinantes. Estos incluyen: (1) proteínas médicamente útiles cuya administración puede corregir un gen defectuoso o mal expresado (p. ej., factor VIII recombinante, un factor de coagulación de la sangre deficiente en algunas formas de hemofilia e insulina recombinante, utilizada para tratar algunas formas de diabetes), (2) proteínas que se pueden administrar para ayudar en una emergencia que pone en peligro la vida (p. ej., activador tisular del plasminógeno, utilizado para tratar accidentes cerebrovasculares), (3) vacunas de subunidades recombinantes, en las que se puede usar una proteína purificada para inmunizar a los pacientes contra enfermedades infecciosas, sin exponerlos al propio agente infeccioso (por ejemplo, vacuna contra la hepatitis B), y (4) proteínas recombinantes como material estándar para pruebas de laboratorio de diagnóstico.

Organismos transgénicos

Una vez caracterizados y manipulados para proporcionar señales para la expresión adecuada, los genes clonados pueden insertarse en organismos, generando organismos transgénicos, también denominados organismos genéticamente modificados (OGM). Aunque la mayoría de los OMG se generan con fines de investigación biológica básica (ver, por ejemplo, ratón transgénico), se han desarrollado varios OMG para uso comercial, que van desde animales y plantas que producen productos farmacéuticos u otros compuestos (pharming), cultivos resistentes a herbicidas plantas y peces tropicales fluorescentes (GloFish) para entretenimiento en el hogar.

Terapia de genes

La terapia génica consiste en suministrar un gen funcional a las células que carecen de esa función, con el objetivo de corregir un trastorno genético o una enfermedad adquirida. La terapia génica se puede dividir ampliamente en dos categorías. El primero es la alteración de las células germinales, es decir, los espermatozoides o los óvulos, que se traduce en un cambio genético permanente para todo el organismo y las generaciones posteriores. Muchos consideran que esta “terapia génica de la línea germinal” no es ética en los seres humanos.El segundo tipo de terapia génica, “terapia génica de células somáticas”, es similar a un trasplante de órganos. En este caso, uno o más tejidos específicos son el objetivo del tratamiento directo o mediante la extracción del tejido, la adición del gen o genes terapéuticos en el laboratorio y la devolución de las células tratadas al paciente. Los ensayos clínicos de terapia génica de células somáticas comenzaron a fines de la década de 1990, principalmente para el tratamiento de cánceres y trastornos sanguíneos, hepáticos y pulmonares.

A pesar de una gran cantidad de publicidad y promesas, la historia de la terapia génica humana se ha caracterizado por un éxito relativamente limitado. El efecto de introducir un gen en las células a menudo promueve solo un alivio parcial y/o transitorio de los síntomas de la enfermedad que se está tratando. Algunos pacientes de ensayos de terapia génica han sufrido consecuencias adversas del tratamiento en sí, incluida la muerte. En algunos casos, los efectos adversos resultan de la interrupción de genes esenciales dentro del genoma del paciente por inactivación por inserción. En otros, los vectores virales utilizados para la terapia génica se han contaminado con virus infecciosos. Sin embargo, la terapia génica todavía se considera un área prometedora de la medicina en el futuro, y es un área en la que existe un nivel significativo de actividad de investigación y desarrollo.