Citocromo c oxidasa

La enzima citocromo c oxidasa o Complejo IV (antes EC 1.9.3.1, ahora reclasificado como translocasa EC 7.1.1.9) es un gran complejo proteico transmembrana que se encuentra en bacterias, arqueas y mitocondrias de eucariotas.

Es la última enzima en la cadena de transporte de electrones respiratorios de las células ubicadas en la membrana. Recibe un electrón de cada una de las cuatro moléculas de citocromo c y los transfiere a una molécula de oxígeno y cuatro protones, produciendo dos moléculas de agua. Además de unirse a los cuatro protones de la fase acuosa interna, transporta otros cuatro protones a través de la membrana, lo que aumenta la diferencia transmembrana del potencial electroquímico de protones, que la ATP sintasa utiliza para sintetizar ATP.

Estructura

El complejo

El complejo es una gran proteína de membrana integral compuesta por varios sitios protésicos de metal y 14 subunidades de proteínas en mamíferos. En los mamíferos, once subunidades son de origen nuclear y tres se sintetizan en la mitocondria. El complejo contiene dos hemos, un citocromo a y un citocromo a3, y dos centros de cobre, los centros Cu_A y Cu_B. De hecho, el citocromo a₃ y Cu_B forman un centro binuclear que es el sitio de reducción de oxígeno. El citocromo c, que es reducido por el componente precedente de la cadena respiratoria (complejo del citocromo bc1, complejo III), se acopla cerca del centro binuclear Cu_A y le pasa un electrón, siendo oxidado nuevamente al citocromo c que contiene Fe³⁺. El centro binuclear Cu_A reducido ahora pasa un electrón al citocromo a, que a su vez pasa un electrón al citocromo a₃>-Cu_{B< /sub> centro binuclear. Los dos iones metálicos en este centro binuclear están separados por 4.5 Å y coordinan un ion hidróxido en el estado completamente oxidado.}

Los estudios cristalográficos de la citocromo c oxidasa muestran una modificación postraduccional inusual, que vincula el C6 de Tyr(244) y el ε-N de His(240) (numeración de enzimas bovinas). Desempeña un papel vital al permitir que el centro binuclear citocromo a₃-Cu_B acepte cuatro electrones en la reducción del oxígeno molecular y cuatro protones en agua. Anteriormente se pensaba que el mecanismo de reducción involucraba un intermedio de peróxido, que se creía que conducía a la producción de superóxido. Sin embargo, el mecanismo actualmente aceptado implica una reducción rápida de cuatro electrones que implica la ruptura inmediata del enlace oxígeno-oxígeno, evitando cualquier intermediario que pueda formar superóxido.

Las subunidades conservadas

Montaje

El ensamblaje de COX en la levadura es un proceso complejo que no se comprende por completo debido a la agregación rápida e irreversible de subunidades hidrofóbicas que forman el complejo holoenzimático, así como la agregación de subunidades mutantes con parches hidrofóbicos expuestos. Las subunidades COX están codificadas tanto en el genoma nuclear como en el mitocondrial. Las tres subunidades que forman el núcleo catalítico de la COX están codificadas en el genoma mitocondrial.

Hemos y cofactores se insertan en las subunidades I & II. Las dos moléculas de hemo residen en la subunidad I, ayudando con el transporte a la subunidad II, donde dos moléculas de cobre ayudan con la transferencia continua de electrones. Las subunidades I y IV inician el ensamblaje. Diferentes subunidades pueden asociarse para formar intermediarios de subcomplejos que luego se unen a otras subunidades para formar el complejo COX. En las modificaciones posteriores al ensamblaje, la COX formará un homodímero. Esto es necesario para la actividad. Los dímeros están conectados por una molécula de cardiolipina, que se ha descubierto que desempeña un papel clave en la estabilización del complejo de holoenzimas. La disociación de las subunidades VIIa y III junto con la eliminación de cardiolipina da como resultado la pérdida total de la actividad enzimática. Se sabe que las subunidades codificadas en el genoma nuclear juegan un papel en la dimerización y estabilidad de las enzimas. Las mutaciones en estas subunidades eliminan la función COX.

Se sabe que el ensamblaje ocurre en al menos tres pasos distintos que determinan la velocidad. Se han encontrado los productos de estos pasos, aunque no se han determinado las composiciones de subunidades específicas.

La síntesis y el ensamblaje de las subunidades COX I, II y III se ven facilitados por activadores de traducción, que interactúan con las regiones 5' no traducidas de las transcripciones de ARNm mitocondrial. Los activadores de traducción están codificados en el núcleo. Pueden operar a través de la interacción directa o indirecta con otros componentes de la maquinaria de traducción, pero los mecanismos moleculares exactos no están claros debido a las dificultades asociadas con la síntesis de la maquinaria de traducción in vitro. Aunque las interacciones entre las subunidades I, II y III codificadas dentro del genoma mitocondrial contribuyen en menor medida a la estabilidad enzimática que las interacciones entre las subunidades bigenómicas, estas subunidades están más conservadas, lo que indica funciones potenciales no exploradas para la actividad enzimática.

Bioquímica

La reacción general es

4 Fe²⁺ – citocromo c + 4 H⁺ + O₂ → 4 Fe³⁺ – citocromo c + 2 H₂O Δ_fG^o' = - 218 kJ/mol

Dos electrones pasan de dos citocromos c's, a través de los sitios Cu_A y citocromo a al citocromo a₃–Cu_{B< /sub> centro binuclear, reduciendo los metales a la forma Fe²⁺ y Cu⁺. El ligando de hidróxido se protona y se pierde como agua, creando un vacío entre los metales que se llena con O2. El oxígeno se reduce rápidamente, con dos electrones provenientes del Fe²⁺-citocromo a3, que se convierte en la forma ferryl oxo (Fe^{4+< /sup>=O). El átomo de oxígeno cercano a CuB toma un electrón de Cu+, y un segundo electrón y un protón del hidroxilo de Tyr(244), que se convierte en un radical tirosilo. El segundo oxígeno se convierte en un ion hidróxido al recoger dos electrones y un protón. Un tercer electrón de otro citocromo c pasa a través de los dos primeros portadores de electrones al centro binuclear del citocromo a3–CuB, y este electrón y dos protones convierten el radical tirosilo de vuelta a Tyr, y el hidróxido se une a CuB2+ a una molécula de agua. El cuarto electrón de otro citocromo c fluye a través de CuA y el citocromo a al centro binuclear citocromo a3–CuB, reduciendo el Fe< sup>4+}=O a Fe³⁺, con el átomo de oxígeno tomando un protón simultáneamente, regenerando este oxígeno como un ion hidróxido coordinado en el medio del citocromo a 3–CuB centro como estaba al comienzo de este ciclo. En general, cuatro citocromos c's reducidos se oxidan mientras que O2 y cuatro protones se reducen a dos moléculas de agua.}

Inhibición

La COX existe en tres estados conformacionales: completamente oxidada (pulsada), parcialmente reducida y completamente reducida. Cada inhibidor tiene una alta afinidad por un estado diferente. En el estado pulsado, tanto el centro nuclear hemo a₃ como el Cu_B se oxidan; esta es la conformación de la enzima que tiene la mayor actividad. Una reducción de dos electrones inicia un cambio conformacional que permite que el oxígeno se una en el sitio activo a la enzima parcialmente reducida. Cuatro electrones se unen a la COX para reducir completamente la enzima. Su estado completamente reducido, que consiste en un Fe²⁺ reducido en el grupo hemo del citocromo a₃ y un Cu_B^{+ reducido} centro binuclear, se considera el estado inactivo o de reposo de la enzima.

El cianuro, la azida y el monóxido de carbono se unen a la citocromo c oxidasa, inhibiendo el funcionamiento de la proteína y provocando la asfixia química de las células. Se necesitan concentraciones más altas de oxígeno molecular para compensar el aumento de las concentraciones de inhibidor, lo que conduce a una reducción general de la actividad metabólica en la célula en presencia de un inhibidor. Otros ligandos, como el óxido nítrico y el sulfuro de hidrógeno, también pueden inhibir la COX al unirse a los sitios reguladores de la enzima, lo que reduce la tasa de respiración celular.

El cianuro es un inhibidor no competitivo de la COX, que se une con gran afinidad al estado parcialmente reducido de la enzima y dificulta una mayor reducción de la enzima. En estado pulsado, el cianuro se une lentamente, pero con gran afinidad. El ligando se postula para estabilizar electrostáticamente ambos metales a la vez colocándose entre ellos. Una concentración alta de óxido nítrico, como la que se agrega exógenamente a la enzima, revierte la inhibición de la COX por parte del cianuro.

El óxido nítrico puede unirse de forma reversible a cualquier ion metálico en el centro binuclear para oxidarse a nitrito. El NO y el CN⁻ competirán con el oxígeno para unirse al sitio, reduciendo la tasa de respiración celular. Sin embargo, el NO endógeno, que se produce en niveles más bajos, aumenta la inhibición de CN⁻. Niveles más altos de NO, que se correlacionan con la existencia de más enzima en estado reducido, conducen a una mayor inhibición del cianuro. A estas concentraciones basales, se sabe que la inhibición del NO del Complejo IV tiene efectos beneficiosos, como el aumento de los niveles de oxígeno en los tejidos de los vasos sanguíneos. La incapacidad de la enzima para reducir el oxígeno a agua da como resultado una acumulación de oxígeno, que puede difundirse más profundamente en los tejidos circundantes. La inhibición del NO del Complejo IV tiene un efecto mayor a concentraciones de oxígeno más bajas, lo que aumenta su utilidad como vasodilatador en los tejidos necesitados.

El sulfuro de hidrógeno se unirá a la COX de manera no competitiva en un sitio regulador de la enzima, similar al monóxido de carbono. El sulfuro tiene la mayor afinidad por los estados pulsado o parcialmente reducido de la enzima, y es capaz de reducir parcialmente la enzima en el centro hemo a₃. No está claro si los niveles endógenos de H₂S son suficientes para inhibir la enzima. No hay interacción entre el sulfuro de hidrógeno y la conformación completamente reducida de COX.

El metanol en los alcoholes desnaturalizados se convierte en ácido fórmico, que también inhibe el mismo sistema oxidasa. Los altos niveles de ATP pueden inhibir alostéricamente la citocromo c oxidasa, uniéndose desde dentro de la matriz mitocondrial.

Localizaciones extramitocondriales y subcelulares

Ubicación de los 3 genes de subunidad de citocromo c oxidasa en el genoma mitocondrial humano: COXI, COXII, y COXIII (casas naranjas).

La citocromo c oxidasa tiene 3 subunidades que están codificadas por el ADN mitocondrial (citocromo c oxidasa subunidad I, subunidad II y subunidad III). De estas 3 subunidades codificadas por el ADN mitocondrial, dos se han identificado en localizaciones extramitocondriales. En el tejido acinar pancreático, estas subunidades se encontraron en gránulos de zimógeno. Además, en la pituitaria anterior, se encontraron cantidades relativamente altas de estas subunidades en los gránulos secretores de la hormona del crecimiento. La función extramitocondrial de estas subunidades de citocromo c oxidasa aún no se ha caracterizado. Además de las subunidades de citocromo c oxidasa, también se ha observado la localización extramitocondrial de un gran número de otras proteínas mitocondriales. Esto plantea la posibilidad de que existan mecanismos específicos aún no identificados para la translocación de proteínas desde las mitocondrias a otros destinos celulares.

Defectos y trastornos genéticos

Los defectos que implican mutaciones genéticas que alteran la funcionalidad o la estructura de la citocromo c oxidasa (COX) pueden provocar trastornos metabólicos graves, a menudo mortales. Dichos trastornos suelen manifestarse en la primera infancia y afectan predominantemente a tejidos con altas demandas energéticas (cerebro, corazón, músculo). Entre las muchas enfermedades mitocondriales clasificadas, se cree que las que implican un ensamblaje disfuncional de la COX son las más graves.

La gran mayoría de los trastornos de la COX están relacionados con mutaciones en proteínas codificadas por el núcleo conocidas como factores de ensamblaje o proteínas de ensamblaje. Estos factores de ensamblaje contribuyen a la estructura y funcionalidad de la COX, y están involucrados en varios procesos esenciales, que incluyen la transcripción y traducción de subunidades codificadas por mitocondrias, el procesamiento de preproteínas y la inserción de membrana, y la biosíntesis e incorporación de cofactores.

Actualmente, se han identificado mutaciones en siete factores de ensamblaje de la COX: SURF1, SCO1, SCO2, COX10, COX15, COX20, COA5 y LRPPRC. Las mutaciones en estas proteínas pueden dar como resultado una funcionalidad alterada del ensamblaje de subcomplejos, el transporte de cobre o la regulación de la traducción. Cada mutación genética está asociada con la etiología de una enfermedad específica, y algunas tienen implicaciones en múltiples trastornos. Los trastornos que implican un ensamblaje COX disfuncional a través de mutaciones genéticas incluyen el síndrome de Leigh, la miocardiopatía, la leucodistrofia, la anemia y la sordera neurosensorial.

Histoquímica

La mayor dependencia de las neuronas de la fosforilación oxidativa para obtener energía facilita el uso de la histoquímica COX en el mapeo del metabolismo cerebral regional en animales, ya que establece una correlación directa y positiva entre la actividad enzimática y la actividad neuronal. Esto se puede ver en la correlación entre la cantidad y la actividad de la enzima COX, lo que indica la regulación de la COX a nivel de expresión génica. La distribución de COX es inconsistente en diferentes regiones del cerebro animal, pero su patrón de distribución es consistente en todos los animales. Este patrón se ha observado en el cerebro de monos, ratones y terneros. Una isoenzima de la COX se ha detectado sistemáticamente en el análisis histoquímico del cerebro. Dicho mapeo cerebral se ha logrado en ratones mutantes espontáneos con enfermedad cerebelosa como Reeler y un modelo transgénico de la enfermedad de Alzheimer. Esta técnica también se ha utilizado para mapear la actividad de aprendizaje en el cerebro animal.

Imágenes adicionales

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  ETC

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  Complejo IV