Cinética enzimática

La cinética enzimática es el estudio de las velocidades de las reacciones químicas catalizadas por enzimas. En la cinética enzimática, se mide la velocidad de reacción y se investigan los efectos de variar las condiciones de la reacción. Estudiar la cinética de una enzima de esta manera puede revelar el mecanismo catalítico de esta enzima, su papel en el metabolismo, cómo se controla su actividad y cómo un fármaco o un modificador (inhibidor o activador) podría afectar la velocidad.

Una enzima (E) es típicamente una molécula de proteína que promueve una reacción de otra molécula, su sustrato (S). Este se une al sitio activo de la enzima para producir un complejo enzima-sustrato ES, y se transforma en un complejo enzima-producto EP y de allí al producto P, a través de un estado de transición ES*. La serie de pasos se conoce como el mecanismo:E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P

Este ejemplo asume el caso más simple de una reacción con un sustrato y un producto. Tales casos existen: por ejemplo, una mutasa como la fosfoglucomutasa cataliza la transferencia de un grupo fosfo de una posición a otra, e isomerasa es un término más general para una enzima que cataliza cualquier reacción de un sustrato y un producto, como la triosafosfato isomerasa. Sin embargo, estas enzimas no son muy comunes y son superadas en gran medida por las enzimas que catalizan reacciones de dos sustratos y dos productos: estas incluyen, por ejemplo, las deshidrogenasas dependientes de NAD, como la alcohol deshidrogenasa, que cataliza la oxidación del etanol por NAD.. Las reacciones con tres o cuatro sustratos o productos son menos comunes, pero existen. No es necesario que el número de productos sea igual al número de sustratos; por ejemplo, la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa tiene tres sustratos y dos productos.

Cuando las enzimas se unen a múltiples sustratos, como la dihidrofolato reductasa (mostrado a la derecha), la cinética enzimática también puede mostrar la secuencia en la que se unen estos sustratos y la secuencia en la que se liberan los productos. Un ejemplo de enzimas que se unen a un solo sustrato y liberan múltiples productos son las proteasas, que escinden un sustrato proteico en dos productos polipeptídicos. Otros unen dos sustratos, como la ADN polimerasa que une un nucleótido al ADN. Aunque estos mecanismos suelen ser una serie compleja de pasos, normalmente hay un paso determinante de la velocidad que determina la cinética general. Este paso determinante de la velocidad puede ser una reacción química o un cambio conformacional de la enzima o los sustratos, como los implicados en la liberación de productos de la enzima.

El conocimiento de la estructura de la enzima es útil para interpretar los datos cinéticos. Por ejemplo, la estructura puede sugerir cómo se unen los sustratos y los productos durante la catálisis; qué cambios ocurren durante la reacción; e incluso el papel de residuos de aminoácidos particulares en el mecanismo. Algunas enzimas cambian de forma significativamente durante el mecanismo; en tales casos, es útil determinar la estructura de la enzima con y sin análogos de sustrato unidos que no experimentan la reacción enzimática.

No todos los catalizadores biológicos son enzimas proteicas: los catalizadores basados ​​en ARN, como las ribozimas y los ribosomas, son esenciales para muchas funciones celulares, como el empalme y la traducción del ARN. La principal diferencia entre las ribozimas y las enzimas es que los catalizadores de ARN se componen de nucleótidos, mientras que las enzimas se componen de aminoácidos. Las ribozimas también realizan un conjunto más limitado de reacciones, aunque sus mecanismos de reacción y cinética pueden analizarse y clasificarse mediante los mismos métodos.

Principios generales

La reacción catalizada por una enzima utiliza exactamente los mismos reactivos y produce exactamente los mismos productos que la reacción no catalizada. Como otros catalizadores, las enzimas no alteran la posición de equilibrio entre sustratos y productos. Sin embargo, a diferencia de las reacciones químicas no catalizadas, las reacciones catalizadas por enzimas muestran una cinética de saturación. Para una concentración de enzima dada y concentraciones de sustrato relativamente bajas, la velocidad de reacción aumenta linealmente con la concentración de sustrato; las moléculas de enzima son en gran parte libres para catalizar la reacción, y el aumento de la concentración de sustrato significa una velocidad creciente a la que las moléculas de enzima y sustrato se encuentran entre sí. Sin embargo, a concentraciones de sustrato relativamente altas, la velocidad de reacción se acerca asintóticamente al máximo teórico; casi todos los sitios activos de la enzima están ocupados por sustratos que dan como resultado la saturación, y la tasa de reacción está determinada por la tasa de renovación intrínseca de la enzima. La concentración de sustrato a mitad de camino entre estos dos casos límite se denota por K _M. Así _, KMes la concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima.

Las dos propiedades importantes de la cinética enzimática son la facilidad con la que la enzima puede saturarse con un sustrato y la velocidad máxima que puede alcanzar. Conocer estas propiedades sugiere lo que una enzima podría hacer en la célula y puede mostrar cómo responderá la enzima a los cambios en estas condiciones.

Ensayos enzimáticos

Los ensayos enzimáticos son procedimientos de laboratorio que miden la velocidad de las reacciones enzimáticas. Dado que las enzimas no se consumen en las reacciones que catalizan, los ensayos enzimáticos suelen seguir los cambios en la concentración de sustratos o productos para medir la velocidad de la reacción. Hay muchos métodos de medición. Los ensayos espectrofotométricos observan cambios en la absorbancia de la luz entre productos y reactivos; los ensayos radiométricos involucran la incorporación o liberación de radiactividad para medir la cantidad de producto producido a lo largo del tiempo. Los ensayos espectrofotométricos son los más convenientes ya que permiten medir continuamente la velocidad de la reacción. Aunque los ensayos radiométricos requieren la extracción y el recuento de muestras (es decir, son ensayos discontinuos), suelen ser extremadamente sensibles y pueden medir niveles muy bajos de actividad enzimática. Un enfoque análogo es usar espectrometría de masas para controlar la incorporación o liberación de isótopos estables a medida que el sustrato se convierte en producto. Ocasionalmente, un ensayo falla y los enfoques son esenciales para resucitar un ensayo fallido.

Los ensayos de enzimas más sensibles utilizan láseres enfocados a través de un microscopio para observar cambios en moléculas de enzimas individuales a medida que catalizan sus reacciones. Estas mediciones utilizan cambios en la fluorescencia de los cofactores durante el mecanismo de reacción de una enzima o colorantes fluorescentes agregados en sitios específicos de la proteína para informar sobre los movimientos que ocurren durante la catálisis. Estos estudios están proporcionando una nueva visión de la cinética y la dinámica de enzimas individuales, a diferencia de la cinética enzimática tradicional, que observa el comportamiento promedio de poblaciones de millones de moléculas de enzima.

Arriba se muestra un ejemplo de curva de progreso para un ensayo enzimático. La enzima produce producto a una velocidad inicial que es aproximadamente lineal durante un período corto después del inicio de la reacción. A medida que avanza la reacción y se consume el sustrato, la velocidad disminuye continuamente (siempre que el sustrato no se encuentre todavía en niveles de saturación). Para medir la velocidad inicial (y máxima), los ensayos enzimáticos normalmente se llevan a cabo mientras la reacción ha progresado solo un pequeño porcentaje hacia la finalización total. La duración del período de velocidad inicial depende de las condiciones del ensayo y puede oscilar entre milisegundos y horas. Sin embargo, el equipo para mezclar líquidos rápidamente permite mediciones cinéticas rápidas en tasas iniciales de menos de un segundo. Estos ensayos muy rápidos son esenciales para medir la cinética previa al estado estacionario, que se analiza a continuación.

La mayoría de los estudios de cinética enzimática se concentran en esta parte inicial, aproximadamente lineal, de las reacciones enzimáticas. Sin embargo, también es posible medir la curva de reacción completa y ajustar estos datos a una ecuación de velocidad no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimáticas se denomina análisis de curva de progreso. Este enfoque es útil como alternativa a la cinética rápida cuando la velocidad inicial es demasiado rápida para medirla con precisión.

Reacciones de sustrato único

Las enzimas con mecanismos de sustrato único incluyen isomerasas como triosafosfatoisomerasa o bisfosfoglicerato mutasa, liasas intramoleculares como adenilato ciclasa y la ribozima de cabeza de martillo, una ARN liasa. Sin embargo, algunas enzimas que solo tienen un único sustrato no entran en esta categoría de mecanismos. La catalasa es un ejemplo de esto, ya que la enzima reacciona con una primera molécula de sustrato de peróxido de hidrógeno, se oxida y luego se reduce por una segunda molécula de sustrato. Aunque está involucrado un solo sustrato, la existencia de un intermediario enzimático modificado significa que el mecanismo de la catalasa es en realidad un mecanismo de ping-pong, un tipo de mecanismo que se analiza en la sección Reacciones de múltiples sustratos a continuación.

Cinética de Michaelis-Menten

Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, su tasa de catálisis no muestra una respuesta lineal al aumento de sustrato. Si la velocidad inicial de la reacción se mide en un rango de concentraciones de sustrato (denotado como [S]), la velocidad de reacción inicial () aumenta a medida que aumenta [S], como se muestra a la derecha. Sin embargo, a medida que [S] aumenta, la enzima se satura con el sustrato y la velocidad inicial alcanza la Vmax, la velocidad _máxima de la enzima.

El modelo cinético de Michaelis-Menten de una reacción de un solo sustrato se muestra a la derecha. Hay una reacción bimolecular inicial entre la enzima E y el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato ES. La velocidad de reacción enzimática aumenta con el aumento de la concentración de sustrato hasta un cierto nivel llamado _Vmax; a _Vmax, el aumento en la concentración de sustrato no provoca ningún aumento en la velocidad de reacción ya que no hay más enzima (E) disponible para reaccionar con el sustrato (S). Aquí, la velocidad de reacción se vuelve dependiente del complejo ES y la reacción se convierte en una reacción unimolecular con un orden de cero. Aunque el mecanismo enzimático para la reacción unimolecularpuede ser bastante complejo, normalmente hay un paso enzimático determinante de la velocidad que permite modelar esta reacción como un solo paso catalítico con una constante de velocidad unimolecular aparente k _cat. Si la trayectoria de la reacción transcurre sobre uno o varios intermedios, k _cat será una función de varias constantes de velocidad elementales, mientras que en el caso más simple de una sola reacción elemental (p. ej., sin intermedios) será idéntica a la constante de velocidad unimolecular elemental k ₂. La constante de velocidad unimolecular aparente k _cat también se denomina número de recambio y denota el número máximo de reacciones enzimáticas catalizadas por segundo.

La ecuación de Michaelis-Menten describe cómo la velocidad de reacción (inicial) v ₀ depende de la posición del equilibrio de unión del sustrato y la constante de velocidad k ₂.(Ecuación de Michaelis-Menten)

con las constantes

Esta ecuación de Michaelis-Menten es la base de la mayoría de las cinéticas enzimáticas de sustrato único. Dos suposiciones cruciales subyacen a esta ecuación (aparte de la suposición general acerca de que el mecanismo solo involucra inhibición intermedia o producto, y no hay alostericidad o cooperatividad). La primera suposición es la llamada suposición del estado cuasi-estacionario (o hipótesis del estado pseudo-estacionario), es decir, que la concentración de la enzima unida al sustrato (y por lo tanto también la enzima no unida) cambia mucho más lentamente que la del producto y sustrato y, por lo tanto, el cambio en el tiempo del complejo se puede establecer en cero . La segunda suposición es que la concentración total de enzimas no cambia con el tiempo, por lo tanto . Una derivación completa se puede encontrar aquí.

La constante de Michaelis KM _se define experimentalmente como la concentración a la que la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de V _max, lo que se puede verificar sustituyendo [S] = KM en la _ecuación de Michaelis-Menten y también se puede ver gráficamente. Si el paso enzimático determinante de la velocidad es lento en comparación con la disociación del sustrato (), la constante de Michaelis K _M es aproximadamente la constante de disociación K _D del complejo ES.

Si es pequeño en comparación con el término y también se forma muy poco complejo ES, por lo tanto . Por lo tanto, la velocidad de formación del producto es

Por lo tanto, la tasa de formación del producto depende de la concentración de la enzima, así como de la concentración del sustrato, la ecuación se parece a una reacción bimolecular con una constante de tasa de pseudosegundo orden correspondiente . Esta constante es una medida de la eficiencia catalítica. Las enzimas más eficientes alcanzan un rango de 10 a 10 M s. Estas enzimas son tan eficientes que catalizan de manera efectiva una reacción cada vez que encuentran una molécula de sustrato y, por lo tanto, han alcanzado un límite teórico superior de eficiencia (límite de difusión); y a veces se denominan enzimas cinéticamente perfectas. Pero la mayoría de las enzimas están lejos de ser perfectas: los valores promedio de y son aproximadamente y , respectivamente.

Uso directo de la ecuación de Michaelis-Menten para el análisis cinético del curso del tiempo

Las velocidades observadas predichas por la ecuación de Michaelis-Menten se pueden usar para modelar directamente la desaparición del sustrato en el transcurso del tiempo y la producción de producto mediante la incorporación de la ecuación de Michaelis-Menten en la ecuación de la cinética química de primer orden. Sin embargo, esto solo se puede lograr si se reconoce el problema asociado con el uso del número de Euler en la descripción de la cinética química de primer orden. es decir, e es una constante dividida que introduce un error sistemático en los cálculos y se puede reescribir como una sola constante que representa el sustrato restante después de cada período de tiempo.

En 1983, Stuart Beal (y también de forma independiente Santiago Schnell y Claudio Mendoza en 1997) derivaron una solución de forma cerrada para el análisis cinético del curso del tiempo del mecanismo de Michaelis-Menten. La solución, conocida como ecuación de Schnell-Mendoza, tiene la forma:

donde W[ ] es la función Lambert-W. y donde F(t) es

Esta ecuación está englobada en la siguiente ecuación, obtenida por Berberan-Santos, que también es válida cuando la concentración inicial de sustrato es cercana a la de enzima,

donde W[ ] es nuevamente la función Lambert-W.

Gráficos lineales de la ecuación de Michaelis-Menten

La gráfica de v versus [S] anterior no es lineal; aunque inicialmente lineal en [S] bajo, se dobla para saturarse en [S] alto. Antes de la era moderna del ajuste no lineal de curvas en las computadoras, esta no linealidad podía dificultar la estimación precisa de K _M y V _máx. Por lo tanto, varios investigadores desarrollaron linealizaciones de la ecuación de Michaelis-Menten, como el diagrama de Lineweaver-Burk, el diagrama de Eadie-Hofstee y el diagrama de Hanes-Woolf. Todas estas representaciones lineales pueden ser útiles para visualizar datos, pero ninguna debe usarse para determinar parámetros cinéticos, ya que hay software de computadora fácilmente disponible que permite una determinación más precisa mediante métodos de regresión no lineal.

El gráfico de Lineweaver-Burk o gráfico recíproco doble es una forma común de ilustrar datos cinéticos. Esto se produce tomando el recíproco de ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten. Como se muestra a la derecha, esta es una forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten y produce una línea recta con la ecuación y = m x + c con una intersección en y equivalente a 1/ V _máx y una intersección en x de la gráfica representando −1 _/ KM.

Naturalmente, no se pueden tomar valores experimentales en 1/[S] negativo; el valor límite inferior 1/[S] = 0 (la intersección y) corresponde a una concentración de sustrato infinita, donde 1/v=1/V _max como se muestra a la derecha; por lo tanto, la intersección x es una extrapolación de los datos experimentales tomados en concentraciones positivas. En términos más generales, el diagrama de Lineweaver-Burk distorsiona la importancia de las mediciones tomadas a bajas concentraciones de sustrato y, por lo tanto, puede generar estimaciones inexactas _de V _max y KM. Un método de trazado lineal más preciso es el gráfico de Eadie-Hofstee. En este caso, v se grafica contra v/[S]. En la tercera representación lineal común, el diagrama de Hanes-Woolf, [S]/ v se representa frente a [S]. En general, la normalización de datos puede ayudar a disminuir la cantidad de trabajo experimental y puede aumentar la confiabilidad de la salida, y es adecuada tanto para el análisis gráfico como numérico.

Importancia práctica de las constantes cinéticas

El estudio de la cinética enzimática es importante por dos razones básicas. En primer lugar, ayuda a explicar cómo funcionan las enzimas y, en segundo lugar, ayuda a predecir cómo se comportan las enzimas en los organismos vivos. Las constantes cinéticas definidas anteriormente, KM y _{Vmax, son} fundamentales para intentar comprender cómo las enzimas trabajan juntas para controlar el metabolismo.

Hacer estas predicciones no es trivial, incluso para sistemas simples. Por ejemplo, el oxaloacetato está formado por malato deshidrogenasa dentro de la mitocondria. Luego, el oxaloacetato puede ser consumido por la citrato sintasa, la fosfoenolpiruvato carboxicinasa o la aspartato aminotransferasa, alimentándose en el ciclo del ácido cítrico, la gluconeogénesis o la biosíntesis del ácido aspártico, respectivamente. Ser capaz de predecir cuánto oxaloacetato entra en qué vía requiere conocer la concentración de oxaloacetato, así como la concentración y la cinética de cada una de estas enzimas. Este objetivo de predecir el comportamiento de las rutas metabólicas alcanza su expresión más compleja en la síntesis de grandes cantidades de datos cinéticos y de expresión génica en modelos matemáticos de organismos completos. Alternativamente,

Cinética de Michaelis-Menten con intermedio

También se podría considerar el caso menos simple<img src="https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/5cd1904bee27689d5df0933e40a4b01631243041" alt="{displaystyle {ce {{E}+S[k_{1}][k_{-1}]ES->[k_{2}]EI->[k_{3}]{E}+ PAG}}}">

donde existe un complejo con la enzima y un intermedio y el intermedio se convierte en producto en un segundo paso. En este caso tenemos una ecuación muy similar.

pero las constantes son diferentes

Vemos que para el caso límite , por lo tanto, cuando el último paso de E + P}}}">es mucho más rápido que el paso anterior, obtenemos nuevamente la ecuación original. Matemáticamente tenemos entonces y .

Reacciones multisustrato

Las reacciones multisustrato siguen ecuaciones de velocidad complejas que describen cómo se unen los sustratos y en qué secuencia. El análisis de estas reacciones es mucho más sencillo si se mantiene constante la concentración de sustrato A y se varía la concentración de sustrato B. En estas condiciones, la enzima se comporta como una enzima de un solo sustrato y una gráfica de v por [S] _da constantes aparentes de KM y _{Vmax para el} sustrato B. Si se realiza un conjunto de estas mediciones a diferentes concentraciones fijas de A, estos datos se pueden utilizar para averiguar cuál es el mecanismo de la reacción. Para una enzima que toma dos sustratos A y B y los convierte en dos productos P y Q, hay dos tipos de mecanismos: complejo ternario y ping-pong.

Mecanismos del complejo ternario

En estas enzimas, ambos sustratos se unen a la enzima al mismo tiempo para producir un complejo ternario EAB. El orden de unión puede ser aleatorio (en un mecanismo aleatorio) o los sustratos deben unirse en una secuencia particular (en un mecanismo ordenado). Cuando un conjunto de curvas v por [S] (A fija, B variable) de una enzima con un mecanismo de complejo ternario se trazan en un gráfico de Lineweaver-Burk, el conjunto de líneas producidas se intersecará.

Las enzimas con mecanismos de complejo ternario incluyen glutatión S -transferasa, dihidrofolato reductasa y ADN polimerasa. Los siguientes enlaces muestran animaciones breves de los mecanismos del complejo ternario de las enzimas dihidrofolato reductasa y ADN polimerasa.

Mecanismos de ping-pong

Como se muestra a la derecha, las enzimas con un mecanismo de ping-pong pueden existir en dos estados, E y una forma químicamente modificada de la enzima E*; esta enzima modificada se conoce como intermediario. En tales mecanismos, el sustrato A se une, cambia la enzima a E*, por ejemplo, transfiriendo un grupo químico al sitio activo y luego se libera. Solo después de que se libera el primer sustrato, el sustrato B puede unirse y reaccionar con la enzima modificada, regenerando la forma E no modificada. Cuando se traza un conjunto de curvas v por [S] (A fija, B variable) de una enzima con un mecanismo de ping-pong en un diagrama de Lineweaver-Burk, se producirá un conjunto de líneas paralelas. Esto se llama trama secundaria.

Las enzimas con mecanismos de ping-pong incluyen algunas oxidorreductasas como la tiorredoxina peroxidasa, transferasas como la acilneuraminato citidililtransferasa y serina proteasas como la tripsina y la quimotripsina. Las serina proteasas son una familia de enzimas muy común y diversa, que incluye enzimas digestivas (tripsina, quimotripsina y elastasa), varias enzimas de la cascada de la coagulación de la sangre y muchas otras. En estas serina proteasas, el intermedio E* es una especie de acil-enzima formada por el ataque de un residuo de serina del sitio activo en un enlace peptídico en un sustrato proteico. Aquí se vincula una breve animación que muestra el mecanismo de la quimotripsina.

Catálisis reversible y la ecuación de Haldane

Los factores externos pueden limitar la capacidad de una enzima para catalizar una reacción en ambas direcciones (mientras que la naturaleza de un catalizador en sí mismo significa que no puede catalizar en una sola dirección, de acuerdo con el principio de reversibilidad microscópica). Consideremos el caso de una enzima que cataliza la reacción en ambos sentidos:

La velocidad inicial de estado estacionario de la reacción es

es positivo si la reacción procede en la dirección directa () y negativo en caso contrario.

El equilibrio requiere eso , lo cual ocurre cuando . Esto muestra que la termodinámica fuerza una relación entre los valores de las 4 constantes de velocidad.

Los valores de las tasas máximas hacia adelante y hacia atrás, obtenidos para , , y , , respectivamente, son y , respectivamente. Su relación no es igual a la constante de equilibrio, lo que implica que la termodinámica no restringe la relación de las tasas máximas. Esto explica que las enzimas pueden ser mucho "mejores catalizadores" (en términos de velocidades máximas) en una dirección particular de la reacción.

On también puede derivar las dos constantes de Michaelis y . La ecuación de Haldane es la relación .

Por lo tanto, la termodinámica restringe la relación entre los valores hacia adelante y hacia atrás , no la relación de valores.

Cinética no Michaelis-Menten

Muchos sistemas enzimáticos diferentes siguen un comportamiento no Michaelis-Menten. Unos pocos ejemplos selectos incluyen la cinética de enzimas autocatalíticas, enzimas cooperativas y alostéricas, enzimas interfaciales e intracelulares, enzimas procesivas, etc. Algunas enzimas producen un gráfico sigmoide v por [S], que a menudo indica unión cooperativa del sustrato al sitio activo. Esto significa que la unión de una molécula de sustrato afecta la unión de las moléculas de sustrato posteriores. Este comportamiento es más común en enzimas multiméricas con varios sitios activos que interactúan.Aquí, el mecanismo de cooperación es similar al de la hemoglobina, con la unión del sustrato a un sitio activo que altera la afinidad de los otros sitios activos por las moléculas de sustrato. La cooperatividad positiva ocurre cuando la unión de la primera molécula de sustrato aumenta la afinidad de los otros sitios activos por el sustrato. La cooperatividad negativa ocurre cuando la unión del primer sustrato disminuye la afinidad de la enzima por otras moléculas de sustrato.

Las enzimas alostéricas incluyen la tirosil tRNA-sintetasa de mamíferos, que muestra una cooperatividad negativa, y la aspartato transcarbamoilasa y la fosfofructocinasa bacterianas, que muestran una cooperatividad positiva.

La cooperatividad es sorprendentemente común y puede ayudar a regular las respuestas de las enzimas a los cambios en las concentraciones de sus sustratos. La cooperatividad positiva hace que las enzimas sean mucho más sensibles a [S] y sus actividades pueden mostrar grandes cambios en un rango estrecho de concentración de sustrato. Por el contrario, la cooperatividad negativa hace que las enzimas sean insensibles a pequeños cambios en [S].

La ecuación de Hill se usa a menudo para describir cuantitativamente el grado de cooperatividad en cinéticas que no son de Michaelis-Menten. El coeficiente de Hill derivado n mide cuánto afecta la unión del sustrato a un sitio activo a la unión del sustrato a los otros sitios activos. Un coeficiente de Hill <1 indica cooperatividad negativa y un coeficiente >1 indica cooperatividad positiva.

Cinética de estado preestablecido

En el primer momento después de que una enzima se mezcla con el sustrato, no se ha formado ningún producto y no existen intermediarios. El estudio de los próximos milisegundos de la reacción se denomina cinética de estado preestablecido. Por lo tanto, la cinética previa al estado estacionario se ocupa de la formación y el consumo de intermediarios enzima-sustrato (como ES o E*) hasta que se alcanzan sus concentraciones en el estado estacionario.

Este enfoque se aplicó por primera vez a la reacción de hidrólisis catalizada por quimotripsina. A menudo, la detección de un intermediario es una prueba vital en las investigaciones sobre el mecanismo que sigue una enzima. Por ejemplo, en los mecanismos de ping-pong que se muestran arriba, las mediciones cinéticas rápidas pueden seguir la liberación del producto P y medir la formación del intermedio enzimático modificado E*. En el caso de la quimotripsina, este intermedio se forma por un ataque al sustrato por parte de la serina nucleófila en el sitio activo y la formación del intermedio acil-enzima.

En la figura de la derecha, la enzima produce E* rápidamente en los primeros segundos de la reacción. Luego, la velocidad disminuye a medida que se alcanza el estado estacionario. Esta fase de explosión rápida de la reacción mide una única renovación de la enzima. En consecuencia, la cantidad de producto liberado en este estallido, que se muestra como la intersección en el eje y del gráfico, también da la cantidad de enzima funcional que está presente en el ensayo.

Mecanismo quimico

Un objetivo importante de medir la cinética enzimática es determinar el mecanismo químico de una reacción enzimática, es decir, la secuencia de pasos químicos que transforman el sustrato en producto. Los enfoques cinéticos discutidos anteriormente mostrarán a qué velocidades se forman y se interconvierten los intermediarios, pero no pueden identificar exactamente cuáles son estos intermediarios.

Las mediciones cinéticas tomadas en varias condiciones de solución o en enzimas o sustratos ligeramente modificados a menudo arrojan luz sobre este mecanismo químico, ya que revelan el paso o los intermedios que determinan la velocidad en la reacción. Por ejemplo, la ruptura de un enlace covalente con un átomo de hidrógeno es un paso común que determina la velocidad. Se puede demostrar cuál de las posibles transferencias de hidrógeno determina la velocidad midiendo los efectos cinéticos de sustituir cada hidrógeno por deuterio, su isótopo estable. La velocidad cambiará cuando se reemplace el hidrógeno crítico, debido a un efecto isotópico cinético primario, que ocurre porque los enlaces con el deuterio son más difíciles de romper que los enlaces con el hidrógeno. También es posible medir efectos similares con otras sustituciones de isótopos, como C/ C y O/O, pero estos efectos son más sutiles.

Los isótopos también se pueden utilizar para revelar el destino de varias partes de las moléculas del sustrato en los productos finales. Por ejemplo, a veces es difícil discernir el origen de un átomo de oxígeno en el producto final; ya que puede proceder del agua o de parte del sustrato. Esto se puede determinar sustituyendo sistemáticamente el isótopo estable O del oxígeno en las diversas moléculas que participan en la reacción y comprobando el isótopo en el producto. El mecanismo químico también se puede dilucidar examinando la cinética y los efectos isotópicos en diferentes condiciones de pH, alterando los iones metálicos u otros cofactores unidos, mediante mutagénesis dirigida al sitio de residuos de aminoácidos conservados o estudiando el comportamiento de la enzima en el presencia de análogos del (de los) sustrato(s).

Inhibición y activación de enzimas.

Los inhibidores de enzimas son moléculas que reducen o anulan la actividad de las enzimas, mientras que los activadores de enzimas son moléculas que aumentan la tasa catalítica de las enzimas. Estas interacciones pueden ser reversibles (es decir, la eliminación del inhibidor restablece la actividad enzimática) o irreversibles (es decir, el inhibidor inactiva permanentemente la enzima).

Inhibidores reversibles

Tradicionalmente, los inhibidores enzimáticos reversibles se han clasificado como competitivos, no competitivos o no competitivos, según sus efectos sobre la KM y la V _{máx .}. Estos diferentes efectos resultan de la unión del inhibidor a la enzima E, al complejo enzima-sustrato ES, oa ambos, respectivamente. La división de estas clases surge de un problema en su derivación y da como resultado la necesidad de usar dos constantes de enlace diferentes para un evento de enlace. La unión de un inhibidor y su efecto sobre la actividad enzimática son dos cosas claramente diferentes, otro problema que las ecuaciones tradicionales no reconocen. En la inhibición no competitiva, la unión del inhibidor da como resultado una inhibición del 100 % de la enzima solamente, y no considera la posibilidad de que haya algo intermedio. En la inhibición no competitiva, el inhibidor se unirá a una enzima en su sitio alostérico; por lo tanto, la afinidad de unión, o inversa de K _M, del sustrato con la enzima seguirá siendo el mismo. Por otro lado, la _Vmax disminuirá en relación con una enzima no inhibida. En un gráfico de Lineweaver-Burk, la presencia de un inhibidor no competitivo se ilustra mediante un cambio en la intersección y, definida como 1/V _máx. La intersección x, definida como −1/ K _M, seguirá siendo la misma. En la inhibición competitiva, el inhibidor se unirá a una enzima en el sitio activo, compitiendo con el sustrato. Como resultado, la K _M aumentará y la V _máx permanecerá igual.La forma común del término inhibidor también oscurece la relación entre la unión del inhibidor a la enzima y su relación con cualquier otro término de unión, ya sea la ecuación de Michaelis-Menten o una curva de respuesta a la dosis asociada con la unión del receptor del ligando. Para demostrar la relación se puede hacer el siguiente reordenamiento:

Agregar cero al final ([I]-[I])

Dividiendo por [I]+K _i

Esta notación demuestra que, de manera similar a la ecuación de Michaelis-Menten, donde la velocidad de reacción depende del porcentaje de la población de enzimas que interactúa con el sustrato, el efecto del inhibidor es el resultado del porcentaje de la población de enzimas que interactúa con el inhibidor. El único problema con esta ecuación en su forma actual es que supone una inhibición absoluta de la enzima con la unión del inhibidor, cuando de hecho puede haber una amplia gama de efectos desde el 100 % de inhibición de la rotación del sustrato hasta >0 %. Para dar cuenta de esto, la ecuación se puede modificar fácilmente para permitir diferentes grados de inhibición al incluir un término _delta Vmax.

o

Este término puede definir la actividad enzimática residual presente cuando el inhibidor interactúa con enzimas individuales en la población. Sin embargo, la inclusión de este término tiene el valor agregado de permitir la posibilidad de activación si el término V _max secundario resulta ser mayor que el término inicial. Para tener en cuenta también la posibilidad de activación, la notación se puede reescribir reemplazando el inhibidor "I" con un término modificador indicado aquí como "X".

Si bien esta terminología da como resultado una forma simplificada de tratar los efectos cinéticos relacionados con la velocidad máxima de la ecuación de Michaelis-Menten, destaca problemas potenciales con el término utilizado para describir los efectos relacionados con la K _M. La KM _relacionada con la afinidad de la enzima por el sustrato debería relacionarse en la mayoría de los casos con cambios potenciales en el sitio de unión de la enzima que resultarían directamente de las interacciones del inhibidor de la enzima. Como tal, un término similar al propuesto anteriormente para modular V _max debería ser apropiado en la mayoría de las situaciones:

En los siguientes artículos se analizan algunos ejemplos de inhibición reversible pertenecientes a los modelos competitivo y no competitivo.

Inhibidores irreversibles

Los inhibidores de enzimas también pueden inactivar irreversiblemente las enzimas, generalmente mediante la modificación covalente de los residuos del sitio activo. Estas reacciones, que pueden denominarse sustratos suicidas, siguen funciones de decaimiento exponencial y suelen ser saturables. Por debajo de la saturación, siguen una cinética de primer orden con respecto al inhibidor. La inhibición irreversible podría clasificarse en dos tipos distintos. El marcado por afinidad es un tipo de inhibición irreversible en la que un grupo funcional que es altamente reactivo modifica un residuo catalíticamente crítico en la proteína de interés para provocar la inhibición. La inhibición basada en mecanismos, por otro lado, implica la unión del inhibidor seguida de alteraciones mediadas por enzimas que transforman este último en un grupo reactivo que modifica irreversiblemente la enzima.

Discurso filosófico sobre la reversibilidad e irreversibilidad de la inhibición

Habiendo discutido la inhibición reversible y la inhibición irreversible en los dos encabezados anteriores, habría que señalar que el concepto de reversibilidad (o irreversibilidad) es una construcción puramente teórica que depende exclusivamente del marco de tiempo del ensayo, es decir, un ensayo reversible que involucran la asociación y disociación de la molécula inhibidora en escalas de tiempo de minutos parecería irreversible si un ensayo evaluara el resultado en segundos y viceversa. Existe un continuo de comportamientos de inhibidores que abarca la reversibilidad y la irreversibilidad en un marco de tiempo de ensayo no arbitrario determinado. Hay inhibidores que muestran un comportamiento de inicio lento y la mayoría de estos inhibidores, invariablemente, también muestran una fuerte unión a la proteína diana de interés.

Mecanismos de catálisis

El modelo preferido para la interacción enzima-sustrato es el modelo de ajuste inducido. Este modelo propone que la interacción inicial entre la enzima y el sustrato es relativamente débil, pero que estas interacciones débiles inducen rápidamente cambios conformacionales en la enzima que fortalecen la unión. Estos cambios conformacionales también acercan los residuos catalíticos en el sitio activo a los enlaces químicos en el sustrato que se alterarán en la reacción.Los cambios conformacionales se pueden medir usando dicroísmo circular o interferometría de polarización dual. Una vez que tiene lugar la unión, uno o más mecanismos de catálisis reducen la energía del estado de transición de la reacción al proporcionar una ruta química alternativa para la reacción. Los mecanismos de catálisis incluyen catálisis por tensión de enlace; por proximidad y orientación; por donantes o aceptores de protones en el sitio activo; Catálisis covalente y tunelización cuántica.

La cinética enzimática no puede probar qué modos de catálisis utiliza una enzima. Sin embargo, algunos datos cinéticos pueden sugerir posibilidades para ser examinados por otras técnicas. Por ejemplo, un mecanismo de ping-pong con una cinética de estado preestablecido en fase de explosión sugeriría que la catálisis covalente podría ser importante en el mecanismo de esta enzima. Alternativamente, la observación de un fuerte efecto del pH en V _max pero no en KM podría _indicar que un residuo en el sitio activo necesita estar en un estado de ionización particular para que ocurra la catálisis.

Historia

En 1902, Victor Henri propuso una teoría cuantitativa de la cinética enzimática, pero en ese momento aún no se reconocía la importancia experimental de la concentración de iones de hidrógeno. Después de que Peter Lauritz Sørensen definiera la escala de pH logarítmica e introdujera el concepto de amortiguación en 1909, la química alemana Leonor Michaelis y la Dra. Maud Leonora Menten (una investigadora postdoctoral en el laboratorio de Michaelis en ese momento) repitieron los experimentos de Henri y confirmaron su ecuación, que ahora se conoce generalmente como cinética de Michaelis-Menten (a veces también cinética de Henri-Michaelis-Menten). Su trabajo fue desarrollado aún más por GE Briggs y JBS Haldane, quienes derivaron ecuaciones cinéticas que todavía se consideran ampliamente hoy en día como un punto de partida en el modelado de la actividad enzimática.

La principal contribución del enfoque de Henri-Michaelis-Menten fue pensar en las reacciones enzimáticas en dos etapas. En el primero, el sustrato se une reversiblemente a la enzima, formando el complejo enzima-sustrato. Esto a veces se llama el complejo de Michaelis. La enzima luego cataliza el paso químico en la reacción y libera el producto. La cinética de muchas enzimas se describe adecuadamente mediante el modelo simple de Michaelis-Menten, pero todas las enzimas tienen movimientos internos que no se tienen en cuenta en el modelo y pueden tener contribuciones significativas a la cinética general de la reacción. Esto se puede modelar introduciendo varias vías de Michaelis-Menten que están conectadas con tasas fluctuantes, que es una extensión matemática del mecanismo básico de Michaelis Menten.

Software

ENZO (Enzyme Kinetics) es una herramienta de interfaz gráfica para construir modelos cinéticos de reacciones catalizadas por enzimas. ENZO genera automáticamente las ecuaciones diferenciales correspondientes a partir de un esquema de reacción enzimático estipulado. Estas ecuaciones diferenciales son procesadas por un solucionador numérico y un algoritmo de regresión que ajusta los coeficientes de las ecuaciones diferenciales a las curvas de curso de tiempo observadas experimentalmente. ENZO permite una evaluación rápida de esquemas de reacción rivales y puede usarse para pruebas de rutina en cinética enzimática.