Celulasa

Celulasa (EC 3.2.1.4; nombre sistemático 4-β-D-glucano 4-glucanohidrolasa) es cualquiera de varias enzimas producidas principalmente por hongos, bacterias y protozoos que catalizan la celulólisis, la descomposición de la celulosa y de algunos polisacáridos relacionados:

Endohidrolisis de (1→4)-β-D- Enlacesglucosidicos en celulosa, lichenina y cereal β-D-glucan

El nombre también se utiliza para cualquier mezcla o complejo natural de varias de estas enzimas, que actúan en serie o sinérgicamente para descomponer el material celulósico.

Las celulasas descomponen la molécula de celulosa en monosacáridos ("azúcares simples") como β-glucosa, o polisacáridos y oligosacáridos más cortos. La descomposición de la celulosa tiene una importancia económica considerable, porque hace que un constituyente principal de las plantas esté disponible para el consumo y uso en reacciones químicas. La reacción específica involucrada es la hidrólisis de los enlaces glucosídicos 1,4-β-D en celulosa, hemicelulosa, liquenina y β-D-glucanos de cereales. Debido a que las moléculas de celulosa se unen fuertemente entre sí, la celulólisis es relativamente difícil en comparación con la descomposición de otros polisacáridos como el almidón.

La mayoría de los mamíferos tienen una capacidad muy limitada para digerir fibras dietéticas como la celulosa por sí mismos. En muchos animales herbívoros, como los rumiantes, como el ganado bovino y ovino, y los fermentadores del intestino posterior, como los caballos, las celulasas son producidas por bacterias simbióticas. Las celulasas endógenas son producidas por algunos tipos de animales metazoarios, como algunas termitas, caracoles y lombrices de tierra.

Recientemente, también se han encontrado celulasas en microalgas verdes (Chlamydomonas reinhardtii, Gonium pectorale y Volvox carteri) y sus dominios catalíticos (CD) que pertenecen a la familia GH9 muestran la mayor homología de secuencia con las celulasas endógenas de metazoos. Las celulasas de algas son modulares y consisten en nuevas células putativas ricas en cisteína. módulos de unión a carbohidratos (CBM), enlazadores ricos en prolina/serina-(PS) además de supuestos dominios similares a Ig y desconocidos en algunos miembros. La celulasa de Gonium pectorale constaba de dos CD separados por enlazadores y con un CBM C-terminal.

Se conocen varios tipos diferentes de celulasas, que difieren estructural y mecánicamente. Sinónimos, derivados y enzimas específicos asociados con el nombre "celulasa" incluyen endo-1,4-β-D-glucanasa (β-1,4-glucanasa, β-1,4-endoglucano hidrolasa, endoglucanasa D, 1,4-(1,3;1,4)-β-D-glucano 4-glucanohidrolasa), carboximetil celulasa (CMCase), avicelasa, celludextrinasa, celulasa A, celulosa AP, celulasa alcalina, celulasa A 3, celulasa 9.5, celoxilanasa y pancelasa SS. En ocasiones, las enzimas que escinden la lignina se han llamado celulasas, pero este antiguo uso está en desuso; son enzimas modificadoras de la lignina.

Tipos y acción

Cinco tipos generales de celulasas según el tipo de reacción catalizada:

• Endocellulases (EC 3.2.1.4) aleatoriamente cierne los vínculos internos en sitios amorfos que crean nuevos extremos de cadena.
• Exocellulases o cellobiohidrolases (EC 3.2.1.91) cleave dos a cuatro unidades de los extremos de las cadenas expuestas producidas por endocellulase, resultando en tetrasaccharides o disacáridos, como la celobiosa. Las exócelulas se clasifican más en el tipo I, que trabajan de forma procesiva desde el extremo de reducción de la cadena de celulosa, y el tipo II, que trabajan de forma procesiva desde el extremo no reductor.
• Cellobiases (EC 3.2.1.21) o β-glucosidases hidrolizan el producto exocelulasa en monosacáridos individuales.
• Las células oxidativas depolymerizan la celulosa por reacciones radicales, como por ejemplo la deshidrogenasa de la celobiosa (aceptor).
• La fosforilasa celulosa depolymeriza la celulosa utilizando fosfatos en lugar del agua.

La avicelasa tiene casi exclusivamente actividad de exocelulasa, ya que avicel es un sustrato altamente microcristalino.

Dentro de los tipos anteriores también hay tipos progresivos (también conocidos como procesivos) y no progresivos. La celulasa progresiva continuará interactuando con una sola hebra de polisacárido, la celulasa no progresiva interactuará una vez y luego se desconectará y se acoplará a otra hebra de polisacárido.

La acción de la celulasa se considera sinérgica ya que las tres clases de celulasa pueden producir mucha más azúcar que la adición de las tres por separado. Aparte de los rumiantes, la mayoría de los animales (incluidos los humanos) no producen celulasa en sus cuerpos y solo pueden descomponer parcialmente la celulosa a través de la fermentación, lo que limita su capacidad para usar energía en el material vegetal fibroso.

Estructura

La mayoría de las celulasas fúngicas tienen una estructura de dos dominios, con un dominio catalítico y un dominio de unión a celulosa, que están conectados por un conector flexible. Esta estructura está adaptada para trabajar sobre un sustrato insoluble y permite que la enzima se difunda bidimensionalmente sobre una superficie en forma de oruga. Sin embargo, también hay celulasas (principalmente endoglucanasas) que carecen de dominios de unión a celulosa.

Tanto la unión de sustratos como la catálisis dependen de la estructura tridimensional de la enzima que surge como consecuencia del nivel de plegamiento de la proteína. La secuencia de aminoácidos y la disposición de sus residuos que ocurren dentro del sitio activo, la posición donde se une el sustrato, pueden influir en factores como la afinidad de unión de los ligandos, la estabilización de los sustratos dentro del sitio activo y la catálisis. La estructura del sustrato es complementaria a la estructura precisa del sitio activo de la enzima. Los cambios en la posición de los residuos pueden provocar la distorsión de una o más de estas interacciones. Factores adicionales como la temperatura, el pH y los iones metálicos influyen en las interacciones no covalentes entre la estructura de la enzima. La especie Thermotoga maritima produce celulasas que constan de 2 láminas β (estructuras proteicas) que rodean una región catalítica central que es el sitio activo. La enzima se clasifica como una endoglucanasa, que escinde internamente los enlaces glucosídicos β-1,4 en las cadenas de celulosa, lo que facilita una mayor degradación del polímero. Diferentes especies de la misma familia que T. maritima fabrica celulasas con diferentes estructuras. Las celulasas producidas por la especie Coprinopsis cinerea consisten en siete hebras de proteína en forma de túnel cerrado llamado barril β/α. Estas enzimas hidrolizan el sustrato carboximetilcelulosa. La unión del sustrato en el sitio activo induce un cambio en la conformación que permite la degradación de la molécula.

Complejos de celulasa

En muchas bacterias, las celulasas in vivo son estructuras enzimáticas complejas organizadas en complejos supramoleculares, los celulosomas. Pueden contener, pero no se limitan a, cinco subunidades enzimáticas diferentes que representan, a saber, endocelulasas, exocelulasas, celobiasas, celulasas oxidativas y celulosa fosforilasas, en las que solo las exocelulasas y las celobiasas participan en la hidrólisis real del enlace β(1→4). El número de subunidades que componen los celulosomas también puede determinar la tasa de actividad enzimática.

Las celulasas multidominio están muy extendidas entre muchos grupos taxonómicos, sin embargo, las celulasas de bacterias anaerobias, que se encuentran en los celulosomas, tienen la arquitectura más compleja que consta de diferentes tipos de módulos. Por ejemplo, Clostridium cellulolyticum produce 13 celulasas modulares GH9 que contienen un número y disposición diferente de dominio catalítico (CD), módulo de unión a carbohidratos (CBM), dockerina, enlazador y dominio similar a Ig.

El complejo de celulasa de Trichoderma reesei, por ejemplo, comprende un componente denominado C1 (57.000 daltons) que separa las cadenas de celulosa cristalina, una endoglucanasa (unos 52.000 daltons), una exoglucanasa (unos 61.000 daltons) dalton), y una β-glucosidasa (76.000 dalton).

Numerosas "firmas" Se han identificado secuencias conocidas como dockerinas y cohesinas en los genomas de bacterias que producen celulosomas. Dependiendo de su secuencia de aminoácidos y estructuras terciarias, las celulasas se dividen en clanes y familias.

Las celulasas multimodulares son más eficientes que las enzimas libres (solo con CD) debido al sinergismo debido a la proximidad entre la enzima y el sustrato celulósico. Los CBM están involucrados en la unión de la celulosa, mientras que los enlazadores glicosilados brindan flexibilidad a la CD para una mayor actividad y protección de la proteasa, así como una mayor unión a la superficie de la celulosa.

Mecanismo de celulólisis

Usos

La celulasa se utiliza para el procesamiento comercial de alimentos en el café. Realiza la hidrólisis de la celulosa durante el secado de los frijoles. Además, las celulasas se utilizan ampliamente en la industria textil y en los detergentes para ropa. También se han utilizado en la industria de la pulpa y el papel para diversos fines, e incluso se utilizan para aplicaciones farmacéuticas. La celulasa se usa en la fermentación de biomasa en biocombustibles, aunque este proceso es relativamente experimental en la actualidad. La celulasa se utiliza en medicina como tratamiento para los fitobezoares, una forma de bezoar de celulosa que se encuentra en el estómago humano, y ha mostrado eficacia en la degradación de biopelículas bacterianas polimicrobianas al hidrolizar los enlaces glucosídicos β(1-4) dentro de los exopolisacáridos de la matriz estructural de la sustancia polimérica extracelular (EPS).

Medición

Como el sustrato nativo, la celulosa, es un polímero insoluble en agua, los ensayos tradicionales de azúcares reductores que usan este sustrato no se pueden emplear para medir la actividad de la celulasa. Los científicos analíticos han desarrollado una serie de métodos alternativos.

• DNSA Método La actividad de la celulasa se determinó incubando 0,5 ml de supernatante con 0,5 ml de carboxilocelulosa 1% (CMC) en buffer de citrato 0,05M (pH 4,8) a 50° C durante 30 minutos. La reacción fue terminada por la adición de 3 ml de ácido dinitrosalicílico reactivo. Absorbance fue leído a las 540 nm.

Se puede usar un viscosímetro para medir la disminución de la viscosidad de una solución que contiene un derivado de celulosa soluble en agua, como la carboximetilcelulosa, tras la incubación con una muestra de celulasa. La disminución de la viscosidad es directamente proporcional a la actividad de la celulasa. Si bien estos ensayos son muy sensibles y específicos para endo-celulasa (las enzimas de celulasa que actúan exo producen poco o ningún cambio en la viscosidad), están limitados por el hecho de que es actividad difícil de definir en unidades enzimáticas convencionales (micromoles de sustrato hidrolizado o producto producido por minuto).

Cello Oligosaccharide substrates

Los celo-oligosacáridos de menor DP (DP2-6) son suficientemente solubles en agua para actuar como sustratos viables para las enzimas celulasa. Sin embargo, dado que estos sustratos son en sí mismos "azúcares reductores", no son adecuados para su uso en los ensayos tradicionales de azúcares reductores porque generan un alto valor "en blanco". valor. Sin embargo, su hidrólisis mediada por celulasa se puede monitorear mediante métodos de HPLC o IC para obtener información valiosa sobre los requisitos de sustrato de una enzima de celulasa en particular.

Sustratos de celooligosacáridos reducidos

Los celo-oligosacáridos se pueden reducir químicamente mediante la acción del borohidruro de sodio para producir sus alcoholes de azúcar correspondientes. Estos compuestos no reaccionan en los ensayos de azúcares reductores pero sus productos de hidrólisis sí lo hacen. Esto hace que los celooligosacáridos reducidos con borohidruro sean sustratos valiosos para el ensayo de celulasa utilizando ensayos tradicionales de azúcar reductor como el método Nelson-Symogyi.

Sustratos polisacáridos teñidos

Estos sustratos se pueden subdividir en dos clases:

• Sustratos crogénicos insolubles: Un sustrato de celulasa insoluble como AZCL-HE-celulosa absorbe el agua para crear partículas gelatinas cuando se coloca en la solución. Este sustrato es gradualmente depolímero y solubilizado por la acción de la celulasa. La reacción se termina añadiendo una solución alcalina para detener la actividad de la enzima y se filtra o se centrifuga la cereza de reacción. El color en el filtrado o supernatante se mide y puede estar relacionado con la actividad de enzimas.
• Sustratos crogénicos solubles: Una muestra de celulasa se incuba con un sustrato soluble en agua como la azo-CM-celulosa, la reacción se termina y el alto peso molecular, fragmentos parcialmente hidrolizados se precipitan de la solución con un solvente orgánico como el etanol o el metoxietanol. La suspensión se mezcla a fondo, se centrifuga y se mide el color en la solución supernatante (debido a fragmentos pequeños, solubles y teñidos). Con la ayuda de una curva estándar, se puede determinar la actividad de la enzima.

Reactivos acoplados a enzimas

Recientemente, se han desarrollado nuevos reactivos que permiten la medición específica de endo-celulasa. Estos métodos implican el uso de sustratos de oligosacáridos funcionalizados en presencia de una enzima auxiliar. En el ejemplo que se muestra, una enzima celulasa puede reconocer el fragmento de trisacárido de celulosa y escindir esta unidad. La enzima auxiliar presente en la mezcla de reactivos (β-glucosidasa) actúa entonces para hidrolizar el fragmento que contiene el cromóforo o el fluoróforo. El ensayo finaliza con la adición de una solución básica que detiene la reacción enzimática y desprotona el compuesto fenólico liberado para producir la especie de fenolato. La actividad de celulasa de una muestra dada es directamente proporcional a la cantidad de fenolato liberado que se puede medir con un espectrofotómetro. La funcionalización con acetal en el extremo no reductor del sustrato trisacárido evita la acción de la β-glucosidasa auxiliar en el sustrato original.