ADN recombinante

Las moléculas de ADN recombinante (ADNr) son moléculas de ADN formadas por métodos de laboratorio de recombinación genética (como la clonación molecular) que reúnen material genético de múltiples fuentes, creando secuencias que de otro modo no se encontrarían en el genoma.

El ADN recombinante es el nombre general de una pieza de ADN que se ha creado mediante la combinación de al menos dos fragmentos de dos fuentes diferentes. El ADN recombinante es posible porque las moléculas de ADN de todos los organismos comparten la misma estructura química y difieren solo en la secuencia de nucleótidos dentro de esa estructura general idéntica. Las moléculas de ADN recombinante a veces se denominan ADN quimérico, porque pueden estar hechas de material de dos especies diferentes, como la quimera mítica. La tecnología R-DNA utiliza secuencias palindrómicas y conduce a la producción de extremos pegajosos y romos.

Las secuencias de ADN utilizadas en la construcción de moléculas de ADN recombinante pueden proceder de cualquier especie. Por ejemplo, el ADN vegetal se puede unir al ADN bacteriano, o el ADN humano se puede unir al ADN fúngico. Además, las secuencias de ADN que no se encuentran en ninguna parte de la naturaleza pueden crearse mediante la síntesis química de ADN e incorporarse a moléculas recombinantes. Usando tecnología de ADN recombinante y ADN sintético, literalmente cualquier secuencia de ADN puede crearse e introducirse en una amplia gama de organismos vivos.

Las proteínas que pueden resultar de la expresión de ADN recombinante dentro de células vivas se denominan proteínas recombinantes. Cuando el ADN recombinante que codifica una proteína se introduce en un organismo huésped, la proteína recombinante no se produce necesariamente. La expresión de proteínas extrañas requiere el uso de vectores de expresión especializados y, a menudo, necesita una reestructuración significativa por parte de secuencias de codificación extrañas.

El ADN recombinante se diferencia de la recombinación genética en que el primero resulta de métodos artificiales en el tubo de ensayo, mientras que el segundo es un proceso biológico normal que resulta en la remezcla de secuencias de ADN existentes en prácticamente todos los organismos.

Creación de ADN

La clonación molecular es el proceso de laboratorio utilizado para crear ADN recombinante. Es uno de los dos métodos más utilizados, junto con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que se utiliza para dirigir la replicación de cualquier secuencia de ADN específica elegida por el experimentador. Hay dos diferencias fundamentales entre los métodos. Una es que la clonación molecular implica la replicación del ADN dentro de una célula viva, mientras que la PCR replica el ADN en el tubo de ensayo, libre de células vivas. La otra diferencia es que la clonación implica cortar y pegar secuencias de ADN, mientras que la PCR amplifica copiando una secuencia existente.

La formación de ADN recombinante requiere un vector de clonación, una molécula de ADN que se replica dentro de una célula viva. Los vectores generalmente se derivan de plásmidos o virus y representan segmentos relativamente pequeños de ADN que contienen las señales genéticas necesarias para la replicación, así como elementos adicionales para facilitar la inserción de ADN extraño, la identificación de células que contienen ADN recombinante y, cuando corresponda, la expresión de la ADN extraño. La elección del vector para la clonación molecular depende de la elección del organismo huésped, el tamaño del ADN que se va a clonar y si se va a expresar el ADN extraño y cómo. Los segmentos de ADN se pueden combinar usando una variedad de métodos, como la clonación de ligasa/enzima de restricción o el ensamblaje de Gibson.

En los protocolos de clonación estándar, la clonación de cualquier fragmento de ADN implica esencialmente siete pasos: (1) Elección del organismo huésped y el vector de clonación, (2) Preparación del vector de ADN, (3) Preparación del ADN que se va a clonar, (4) Creación de ADN recombinante, (5) Introducción de ADN recombinante en el organismo huésped, (6) Selección de organismos que contienen ADN recombinante, y (7) Selección de clones con insertos de ADN deseados y propiedades biológicas. Estos pasos se describen con cierto detalle en un artículo relacionado (clonación molecular).

Expresión de ADN

Después del trasplante en el organismo huésped, el ADN extraño contenido en la construcción de ADN recombinante puede expresarse o no. Es decir, el ADN puede simplemente replicarse sin expresión, o puede transcribirse y traducirse y se produce una proteína recombinante. En términos generales, la expresión de un gen extraño requiere la reestructuración del gen para incluir secuencias necesarias para producir una molécula de ARNm que pueda ser utilizada por el aparato de traducción del huésped (p. ej., promotor, señal de iniciación de la traducción y terminador transcripcional).Se pueden realizar cambios específicos en el organismo huésped para mejorar la expresión del gen ectópico. Además, también pueden ser necesarios cambios en las secuencias de codificación, para optimizar la traducción, hacer que la proteína sea soluble, dirigir la proteína recombinante a la ubicación celular o extracelular adecuada y estabilizar la proteína frente a la degradación.

Propiedades de los organismos que contienen ADN recombinante

En la mayoría de los casos, los organismos que contienen ADN recombinante tienen fenotipos aparentemente normales. Es decir, su apariencia, comportamiento y metabolismo no suelen cambiar, y la única forma de demostrar la presencia de secuencias recombinantes es examinar el propio ADN, normalmente mediante una prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Existen excepciones significativas, y se analizan a continuación.

Si las secuencias de rDNA codifican un gen que se expresa, entonces se puede detectar la presencia de RNA y/o productos proteicos del gen recombinante, típicamente usando RT-PCR o métodos de hibridación western. Los grandes cambios fenotípicos no son la norma, a menos que el gen recombinante haya sido elegido y modificado para generar actividad biológica en el organismo huésped. Los fenotipos adicionales que se encuentran incluyen toxicidad para el organismo huésped inducida por el producto del gen recombinante, especialmente si se sobreexpresa o se expresa dentro de células o tejidos inapropiados.

En algunos casos, el ADN recombinante puede tener efectos nocivos incluso si no se expresa. Un mecanismo por el cual esto sucede es la inactivación por inserción, en la que el ADNr se inserta en el gen de una célula huésped. En algunos casos, los investigadores utilizan este fenómeno para "eliminar" los genes para determinar su función e importancia biológica. Otro mecanismo por el cual la inserción de ADNr en el ADN cromosómico puede afectar la expresión génica es la activación inapropiada de genes de la célula huésped no expresados ​​previamente. Esto puede suceder, por ejemplo, cuando un fragmento de ADN recombinante que contiene un promotor activo se ubica junto a un gen de la célula huésped previamente silencioso, o cuando un gen de la célula huésped que funciona para restringir la expresión génica sufre una inactivación por inserción mediante el ADN recombinante.

Aplicaciones del ADN recombinante

El ADN recombinante se usa ampliamente en biotecnología, medicina e investigación. Hoy en día, las proteínas recombinantes y otros productos que resultan del uso de la tecnología del ADN se encuentran esencialmente en todas las farmacias, consultorios médicos o veterinarios, laboratorios de pruebas médicas y laboratorios de investigación biológica occidentales. Además, los organismos que han sido manipulados usando tecnología de ADN recombinante, así como los productos derivados de esos organismos, han llegado a muchas granjas, supermercados, botiquines domésticos e incluso tiendas de mascotas, como las que venden GloFish y otros genéticamente animales modificados.

La aplicación más común del ADN recombinante es en la investigación básica, en la que la tecnología es importante para la mayoría de los trabajos actuales en las ciencias biológicas y biomédicas. El ADN recombinante se usa para identificar, mapear y secuenciar genes, y para determinar su función. Las sondas de ADNr se emplean para analizar la expresión génica dentro de células individuales y en los tejidos de organismos completos. Las proteínas recombinantes se utilizan ampliamente como reactivos en experimentos de laboratorio y para generar sondas de anticuerpos para examinar la síntesis de proteínas dentro de las células y los organismos.

Muchas aplicaciones prácticas adicionales del ADN recombinante se encuentran en la industria, la producción de alimentos, la medicina humana y veterinaria, la agricultura y la bioingeniería. A continuación se identifican algunos ejemplos específicos.Quimosina recombinanteLa quimosina, que se encuentra en el cuajo, es una enzima necesaria para fabricar queso. Fue el primer aditivo alimentario modificado genéticamente utilizado comercialmente. Tradicionalmente, los procesadores obtenían la quimosina del cuajo, una preparación derivada del cuarto estómago de los terneros alimentados con leche. Los científicos diseñaron una cepa no patógena (K-12) de la bacteria E. coli para la producción de la enzima en laboratorio a gran escala. Esta enzima recombinante producida microbiológicamente, estructuralmente idéntica a la enzima derivada de ternera, cuesta menos y se produce en cantidades abundantes. Hoy en día, alrededor del 60 % del queso duro estadounidense se elabora con quimosina modificada genéticamente. En 1990, la FDA otorgó a la quimosina el estatus de "generalmente reconocido como seguro" (GRAS) en base a datos que mostraban que la enzima era segura.insulina humana recombinanteReemplazó casi por completo a la insulina obtenida de fuentes animales (por ejemplo, cerdos y ganado) para el tratamiento de la diabetes insulinodependiente. Se utiliza ampliamente una variedad de diferentes preparaciones de insulina recombinante. La insulina recombinante se sintetiza insertando el gen de insulina humana en E. coli o levadura (Saccharomyces cerevisiae) que luego produce insulina para uso humano.Hormona de crecimiento humana recombinante (HGH, somatotropina)Administrado a pacientes cuyas glándulas pituitarias generan cantidades insuficientes para apoyar el crecimiento y desarrollo normal. Antes de que la HGH recombinante estuviera disponible, la HGH para uso terapéutico se obtenía de glándulas pituitarias de cadáveres. Esta práctica insegura hizo que algunos pacientes desarrollaran la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. La HGH recombinante eliminó este problema y ahora se usa terapéuticamente. También ha sido mal utilizado como droga para mejorar el rendimiento por atletas y otros. entrada del banco de medicamentosFactor VIII de coagulación sanguínea recombinanteUna proteína de coagulación de la sangre que se administra a pacientes con formas del trastorno hemorrágico hemofilia, que no pueden producir factor VIII en cantidades suficientes para apoyar la coagulación sanguínea normal. Antes del desarrollo del factor VIII recombinante, la proteína se obtenía procesando grandes cantidades de sangre humana de múltiples donantes, lo que conllevaba un riesgo muy alto de transmisión de enfermedades infecciosas transmitidas por la sangre, por ejemplo, el VIH y la hepatitis B. Entrada de DrugBankVacuna contra la hepatitis B recombinanteLa infección por hepatitis B se controla mediante el uso de una vacuna recombinante contra la hepatitis B, que contiene una forma del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B que se produce en las células de levadura. El desarrollo de la vacuna de subunidades recombinantes fue un avance importante y necesario porque el virus de la hepatitis B, a diferencia de otros virus comunes como el virus de la poliomielitis, no se puede cultivar in vitro. Información sobre vacunas de la Hepatitis B FoundationDiagnóstico de infección por VIHCada uno de los tres métodos ampliamente utilizados para diagnosticar la infección por VIH se ha desarrollado utilizando ADN recombinante. La prueba de anticuerpos (ELISA o western blot) utiliza una proteína del VIH recombinante para detectar la presencia de anticuerpos que el cuerpo ha producido en respuesta a una infección por el VIH. La prueba de ADN busca la presencia de material genético del VIH mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). El desarrollo de la prueba RT-PCR fue posible gracias a la clonación molecular y el análisis de secuencias de los genomas del VIH. Página de pruebas de VIH de los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) de EE. UU.arroz doradoUna variedad recombinante de arroz que ha sido diseñada para expresar las enzimas responsables de la biosíntesis de β-caroteno. Esta variedad de arroz es muy prometedora para reducir la incidencia de la deficiencia de vitamina A en la población mundial. El arroz dorado no está actualmente en uso, a la espera de la resolución de problemas regulatorios y de propiedad intelectual.Cultivos resistentes a herbicidasSe han desarrollado variedades comerciales de cultivos agrícolas importantes (que incluyen soja, maíz, sorgo, canola, alfalfa y algodón) que incorporan un gen recombinante que genera resistencia al herbicida glifosato (nombre comercial Roundup) y simplifica el control de malas hierbas con glifosato. solicitud. Estos cultivos son de uso comercial común en varios países.Cultivos resistentes a insectosBacillus thuringeiensis es una bacteria que produce naturalmente una proteína (toxina Bt) con propiedades insecticidas. La bacteria se ha aplicado a los cultivos como estrategia de control de insectos durante muchos años, y esta práctica ha sido ampliamente adoptada en la agricultura y la jardinería. Recientemente, se han desarrollado plantas que expresan una forma recombinante de la proteína bacteriana, que puede controlar eficazmente algunos insectos depredadores. Los problemas ambientales asociados con el uso de estos cultivos transgénicos no se han resuelto por completo.

Historia

La idea del ADN recombinante fue propuesta por primera vez por Peter Lobban, estudiante graduado del Prof. Dale Kaiser en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford. Las primeras publicaciones que describen la producción exitosa y la replicación intracelular de ADN recombinante aparecieron en 1972 y 1973, de Stanford y UCSF. En 1980, Paul Berg, profesor del Departamento de Bioquímica de Stanford y autor de uno de los primeros artículos, recibió el Premio Nobel de Química por su trabajo sobre los ácidos nucleicos "con especial atención al ADN recombinante". Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1978 por el descubrimiento de las endonucleasas de restricción que mejoraron las técnicas de la tecnología del ADNr.

La Universidad de Stanford solicitó una patente estadounidense sobre ADN recombinante en 1974, enumerando a los inventores como Herbert W. Boyer (profesor de la Universidad de California, San Francisco) y Stanley N. Cohen (profesor de la Universidad de Stanford); esta patente se concedió en 1980. El primer fármaco con licencia generado mediante tecnología de ADN recombinante fue la insulina humana, desarrollada por Genentech y autorizada por Eli Lilly and Company.

Controversia

Los científicos asociados con el desarrollo inicial de los métodos de ADN recombinante reconocieron que existía la posibilidad de que los organismos que contienen ADN recombinante tuvieran propiedades indeseables o peligrosas. En la Conferencia de Asilomar de 1975 sobre ADN recombinante, se discutieron estas preocupaciones y se inició una moratoria voluntaria en la investigación de ADN recombinante para experimentos que se consideraron particularmente riesgosos. Esta moratoria se observó ampliamente hasta que los Institutos Nacionales de Salud (EE. UU.) desarrollaron y emitieron pautas formales para el trabajo con ADNr. Hoy en día, las moléculas de ADN recombinante y las proteínas recombinantes generalmente no se consideran peligrosas. Sin embargo, siguen existiendo preocupaciones sobre algunos organismos que expresan ADN recombinante, particularmente cuando salen del laboratorio y se introducen en el medio ambiente o en la cadena alimentaria. Estas preocupaciones se discuten en los artículos sobre organismos modificados genéticamente y controversias sobre alimentos modificados genéticamente. Además, existen preocupaciones sobre los subproductos en la producción biofarmacéutica, donde el ADN recombinante da como resultado productos proteicos específicos. El subproducto principal, denominado proteína de la célula huésped, proviene del sistema de expresión del huésped y representa una amenaza para la salud del paciente y el medio ambiente en general.