Zebrafish

O zebrafish (Danio rerio) é um peixe de água doce pertencente à família dos peixinhos (Cyprinidae) da ordem Cypriniformes. Nativo do sul da Ásia, é um peixe de aquário popular, frequentemente vendido sob o nome comercial zebra danio (e, portanto, muitas vezes chamado de "peixe tropical", embora tropical e subtropical). Também é encontrado em lagoas privadas.

O peixe-zebra é um organismo modelo vertebrado importante e amplamente utilizado na investigação científica, por exemplo no desenvolvimento de fármacos, em particular no desenvolvimento pré-clínico. Também é notável por suas habilidades regenerativas e foi modificado por pesquisadores para produzir muitas cepas transgênicas.

Taxonomia

O zebrafish é um membro derivado do gênero Brachydanio, da família Cyprinidae. Tem uma relação de grupo irmão com Danio aesculapii. Zebrafish também estão intimamente relacionados com o gênero Devario, como demonstrado por uma árvore filogenética de espécies próximas.

Distribuição

Intervalo

O peixe-zebra é nativo de habitats de água doce no sul da Ásia, onde é encontrado na Índia, Paquistão, Bangladesh, Nepal e Butão. O limite norte fica no sul do Himalaia, desde a bacia do rio Sutlej na região fronteiriça de Bangladesh-Índia até o estado de Arunachal Pradesh no nordeste da Índia. Seu alcance está concentrado nas bacias dos rios Ganges e Brahmaputra, e a espécie foi descrita pela primeira vez no rio Kosi (bacia inferior do Ganges) da Índia. Seu alcance mais ao sul é mais local, com registros dispersos das regiões de Ghats Ocidental e Oriental. Tem sido frequentemente dito que ocorre em Myanmar (Birmânia), mas isso é inteiramente baseado em registros anteriores a 1930 e provavelmente se refere a parentes próximos descritos apenas posteriormente, notavelmente Danio kyathit. Da mesma forma, registros antigos do Sri Lanka são altamente questionáveis e permanecem não confirmados.

Os peixes-zebra foram introduzidos na Califórnia, Connecticut, Flórida e Novo México nos Estados Unidos, presumivelmente por soltura deliberada por aquaristas ou por fuga de fazendas de peixes. A população do Novo México foi extirpada em 2003 e não está claro se os outros sobreviveram, pois os últimos registros publicados foram décadas atrás. Em outros lugares, a espécie foi introduzida na Colômbia e na Malásia.

Habitats

O peixe-zebra normalmente habita águas claras que fluem moderadamente a estagnadas de profundidade bastante rasa em riachos, canais, valas, lagos marginais, lagoas e arrozais. Habitualmente existe alguma vegetação, quer submersa quer pendente das margens, sendo o fundo arenoso, lodoso ou limoso, muitas vezes misturado com seixos ou saibros. Em pesquisas de locais de peixe-zebra em grande parte de sua distribuição em Bangladesh e na Índia, a água tinha um pH quase neutro a um tanto básico e variava principalmente de 16,5 a 34 °C (61,7–93,2 °F) de temperatura. Um local incomumente frio era de apenas 12,3 °C (54,1 °F) e outro local incomumente quente era de 38,6 °C (101,5 °F), mas o peixe-zebra ainda parecia saudável. A temperatura extraordinariamente fria estava em um dos locais mais altos conhecidos do peixe-zebra, a 1.576 m (5.171 pés) acima do nível do mar, embora a espécie tenha sido registrada a 1.795 m (5.889 pés).

Descrição

O peixe-zebra recebe esse nome devido às cinco listras uniformes, pigmentadas, horizontais e azuis nas laterais do corpo, que lembram as listras de uma zebra e se estendem até o final da nadadeira caudal. Sua forma é fusiforme e comprimida lateralmente, com a boca voltada para cima. O macho tem formato de torpedo, com listras douradas entre as listras azuis; a fêmea tem uma barriga maior e esbranquiçada e listras prateadas em vez de douradas. As fêmeas adultas exibem uma pequena papila genital na frente da origem da nadadeira anal. O peixe-zebra pode atingir até 4–5 cm (1,6–2,0 in) de comprimento, embora normalmente tenha 1,8–3,7 cm (0,7–1,5 in) na natureza, com algumas variações dependendo da localização. A sua longevidade em cativeiro é de cerca de dois a três anos, embora em condições ideais possa prolongar-se para mais de cinco anos. Na natureza, é tipicamente uma espécie anual.

Psicologia

Em 2015, foi publicado um estudo sobre o peixe-zebra. capacidade de memória episódica. Os indivíduos mostraram capacidade de lembrar o contexto em relação a objetos, locais e ocasiões (o quê, quando, onde). A memória episódica é uma capacidade dos sistemas de memória explícita, tipicamente associada à experiência consciente.

As células de Mauthner integram uma ampla gama de estímulos sensoriais para produzir o reflexo de fuga. Esses estímulos incluem os sinais da linha lateral de McHenry et al. 2009 e sinais visuais consistentes com objetos iminentes por Temizer et al. 2015, Dunn et al. 2016, e Yao et al. 2016.

Reprodução

Estágios de desenvolvimento de zebrafish. Fotos para escala exceto adulto, que tem cerca de 2,5 cm (1 in) de comprimento.

O tempo aproximado de geração de Danio rerio é de três meses. Um macho deve estar presente para que ocorra a ovulação e a desova. Os peixes-zebra são desovadores assíncronos e sob condições ideais (como disponibilidade de alimentos e parâmetros de água favoráveis) podem desovar com sucesso com frequência, mesmo diariamente. As fêmeas são capazes de desovar em intervalos de dois a três dias, colocando centenas de ovos em cada ninhada. Após a liberação, o desenvolvimento embrionário começa; na ausência de esperma, o crescimento para após as primeiras divisões celulares. Os ovos fertilizados tornam-se quase imediatamente transparentes, uma característica que torna D. rerio uma espécie modelo de pesquisa conveniente. A determinação do sexo de cepas comuns de laboratório mostrou ser uma característica genética complexa, em vez de seguir um sistema ZW ou XY simples.

O embrião do peixe-zebra se desenvolve rapidamente, com os precursores de todos os principais órgãos aparecendo dentro de 36 horas após a fertilização. O embrião começa como uma gema com uma única célula enorme no topo (ver imagem, painel 0 h), que se divide em duas (painel 0,75 h) e continua se dividindo até que haja milhares de pequenas células (painel 3,25 h). As células então migram pelas laterais da gema (painel de 8 h) e começam a formar uma cabeça e cauda (painel de 16 h). A cauda então cresce e se separa do corpo (painel 24 h). A gema encolhe com o tempo porque o peixe a utiliza como alimento à medida que amadurece durante os primeiros dias (painel de 72 h). Após alguns meses, o peixe adulto atinge a maturidade reprodutiva (painel inferior).

Para estimular a desova dos peixes, alguns pesquisadores usam um aquário com fundo deslizante, que reduz a profundidade da piscina para simular a margem de um rio. Zebrafish desovam melhor pela manhã devido aos seus ritmos circadianos. Os pesquisadores conseguiram coletar 10.000 embriões em 10 minutos usando esse método. Em particular, um par de peixes adultos é capaz de colocar 200 a 300 ovos em uma manhã em aproximadamente 5 a 10 de cada vez. Além disso, sabe-se que os peixes-zebra machos respondem a marcações mais pronunciadas nas fêmeas, ou seja, "boas listras", mas em um grupo, os machos acasalam com as fêmeas que encontram. O que atrai as mulheres não é compreendido atualmente. A presença de plantas, mesmo de plástico, aparentemente também encoraja a desova.

A exposição a concentrações ambientalmente relevantes de diisononil ftalato (DINP), comumente usado em uma grande variedade de itens de plástico, interrompe o sistema endocanabinóide e, portanto, afeta a reprodução de maneira específica para o sexo.

Alimentação

Os peixes-zebra são onívoros, comendo principalmente zooplâncton, fitoplâncton, insetos e larvas de insetos, embora possam comer uma variedade de outros alimentos, como vermes e pequenos crustáceos, se suas fontes alimentares preferidas não estiverem prontamente disponíveis.

Em pesquisas, peixes-zebra adultos são frequentemente alimentados com artêmias, ou paramécios.

No aquário

Zebrafish são peixes resistentes e considerados bons para aquaristas iniciantes. Sua popularidade duradoura pode ser atribuída à sua disposição lúdica, bem como à sua reprodução rápida, estética, preço barato e ampla disponibilidade. Eles também se dão bem em cardumes ou cardumes de seis ou mais e interagem bem com outras espécies de peixes no aquário. No entanto, eles são suscetíveis a Oodinium ou doença de veludo, microsporídios (Pseudoloma neurophilia) e espécies de Mycobacterium. Se possível, os adultos comem os filhotes, que podem ser protegidos separando os dois grupos com rede, caixa de criação ou tanque separado. Em cativeiro, o peixe-zebra vive aproximadamente quarenta e dois meses. Alguns peixes-zebra em cativeiro podem desenvolver uma coluna curva.

O zebra danio também foi usado para fazer peixes geneticamente modificados e foi a primeira espécie a ser vendida como GloFish (peixe de cor fluorescente).

Estirpes

No final de 2003, peixes-zebra transgênicos que expressam proteínas fluorescentes verdes, vermelhas e amarelas tornaram-se disponíveis comercialmente nos Estados Unidos. As cepas fluorescentes são de nome comercial GloFish; outras variedades cultivadas incluem "golden", "sandy", "longfin" e "leopardo".

O danio leopardo, anteriormente conhecido como Danio frankei, é uma metamorfose de cor manchada do peixe-zebra que surgiu devido a uma mutação de pigmento. Formas xantísticas do padrão zebra e leopardo, juntamente com cepas de barbatanas longas, foram obtidas por meio de programas de reprodução seletiva para o comércio de aquários.

Várias cepas transgênicas e mutantes de zebrafish foram armazenadas no China Zebrafish Resource Center (CZRC), uma organização sem fins lucrativos, que foi apoiada conjuntamente pelo Ministério da Ciência e Tecnologia da China e pela Academia Chinesa de Ciências.

Estirpes de tipo selvagem

A Zebrafish Information Network (ZFIN) fornece informações atualizadas sobre as cepas conhecidas de tipo selvagem (WT) de D. rerio, alguns dos quais estão listados abaixo.

Híbridos

Híbridos entre diferentes espécies de Danio podem ser férteis: por exemplo, entre D. rerio e D. nigrofasciatus.

Pesquisa científica

Os cromatóforos Zebrafish, mostrados aqui mediando a adaptação de fundo, são amplamente estudados por cientistas.

Um mutante de pigmento de zebrafish (bottom) produzido por mutagenesis insertional. Um embrião do tipo selvagem (top) é mostrado para comparação. O mutante carece de pigmento preto em seus melanócitos porque é incapaz de sintetizar melanina corretamente.

D. rerio é um organismo modelo científico comum e útil para estudos de desenvolvimento de vertebrados e função gênica. Seu uso como animal de laboratório foi iniciado pelo biólogo molecular americano George Streisinger e seus colegas da Universidade de Oregon nas décadas de 1970 e 1980; Os clones de peixe-zebra de Streisinger estavam entre os primeiros clones de vertebrados bem-sucedidos criados. Sua importância foi consolidada por telas genéticas avançadas em grande escala bem-sucedidas (comumente chamadas de telas de Tübingen/Boston). O peixe tem um banco de dados on-line dedicado de informações genéticas, genômicas e de desenvolvimento, a Zebrafish Information Network (ZFIN). O Zebrafish International Resource Center (ZIRC) é um repositório de recursos genéticos com 29.250 alelos disponíveis para distribuição à comunidade de pesquisa. D. rerio também é uma das poucas espécies de peixes a serem enviadas ao espaço.

Pesquisa com D. rerio produziu avanços nas áreas de biologia do desenvolvimento, oncologia, toxicologia, estudos reprodutivos, teratologia, genética, neurobiologia, ciências ambientais, pesquisa com células-tronco, medicina regenerativa, distrofias musculares e teoria evolutiva.

Características do modelo

Como sistema biológico modelo, o peixe-zebra possui inúmeras vantagens para os cientistas. Seu genoma foi totalmente sequenciado e tem comportamentos de desenvolvimento bem compreendidos, facilmente observáveis e testáveis. Seu desenvolvimento embrionário é muito rápido, e seus embriões são relativamente grandes, robustos e transparentes, podendo se desenvolver fora da mãe. Além disso, cepas mutantes bem caracterizadas estão prontamente disponíveis.

Outras vantagens incluem o tamanho da espécie; tamanho quase constante durante o desenvolvimento inicial, o que permite o uso de técnicas simples de coloração, e o fato de que seu embrião bicelular pode ser fundido em uma única célula para criar um embrião homozigoto. O peixe-zebra também é comprovadamente semelhante a modelos de mamíferos e humanos em testes de toxicidade e exibe um ciclo de sono diurno com semelhanças com o comportamento de sono dos mamíferos. No entanto, o peixe-zebra não é um modelo de pesquisa universalmente ideal; há uma série de desvantagens em seu uso científico, como a ausência de uma dieta padrão e a presença de pequenas, mas importantes, diferenças entre o peixe-zebra e os mamíferos no papel de alguns genes relacionados a distúrbios humanos.

Regeneração

Os peixes-zebra têm a capacidade de regenerar as células ciliadas do coração e da linha lateral durante os estágios larvais. O processo regenerativo cardíaco provavelmente envolve vias de sinalização como Notch e Wnt; as alterações hemodinâmicas no coração danificado são detectadas pelas células endoteliais ventriculares e seus cílios cardíacos associados por meio do canal iônico mecanossensível TRPV4, facilitando subsequentemente a via de sinalização Notch via KLF2 e ativando vários efetores a jusante, como BMP-2 e HER2/neu. Em 2011, a British Heart Foundation fez uma campanha publicitária divulgando sua intenção de estudar a aplicabilidade dessa habilidade em humanos, afirmando que pretendia arrecadar £ 50 milhões em fundos de pesquisa.

Também foi descoberto que o peixe-zebra regenera células fotorreceptoras e neurônios da retina após lesão, o que demonstrou ser mediado pela desdiferenciação e proliferação da glia de Müller. Pesquisadores freqüentemente amputam as barbatanas dorsal e ventral da cauda e analisam seu crescimento para testar mutações. Verificou-se que a desmetilação das histonas ocorre no local da amputação, mudando as células do peixe-zebra para um estado "ativo", regenerativo, semelhante a células-tronco. Em 2012, cientistas australianos publicaram um estudo revelando que o peixe-zebra usa uma proteína especializada, conhecida como fator de crescimento de fibroblastos, para garantir que suas medulas cicatrizem sem cicatrizes gliais após lesões. Além disso, células ciliadas da linha lateral posterior também se regeneram após dano ou interrupção do desenvolvimento. O estudo da expressão gênica durante a regeneração tem permitido a identificação de várias importantes vias de sinalização envolvidas no processo, como a sinalização Wnt e o fator de crescimento de fibroblastos.

Na investigação de distúrbios do sistema nervoso, incluindo doenças neurodegenerativas, distúrbios do movimento, distúrbios psiquiátricos e surdez, os pesquisadores estão usando o peixe-zebra para entender como os defeitos genéticos subjacentes a essas condições causam anormalidades funcionais no cérebro humano, medula espinhal e órgãos sensoriais. Os pesquisadores também estudaram o peixe-zebra para obter novos insights sobre as complexidades das doenças musculoesqueléticas humanas, como a distrofia muscular. Outro foco da pesquisa do peixe-zebra é entender como um gene chamado Hedgehog, um sinal biológico que está por trás de uma série de cânceres humanos, controla o crescimento celular.

Genética

Genética de fundo

Estirpes endogâmicas e estoques endogâmicos tradicionais não foram desenvolvidos para peixes-zebra de laboratório, e a variabilidade genética de linhas de tipo selvagem entre instituições pode contribuir para a crise de replicação na pesquisa biomédica. Diferenças genéticas em linhagens de tipo selvagem entre populações mantidas em diferentes instituições de pesquisa foram demonstradas usando polimorfismos de nucleotídeo único e análise de microssatélites.

Expressão gênica

Devido aos seus ciclos de vida rápidos e curtos e tamanhos de embreagem relativamente grandes, D. rerio ou zebrafish são um modelo útil para estudos genéticos. Uma técnica comum de genética reversa é reduzir a expressão gênica ou modificar o splicing usando a tecnologia antisense Morpholino. Os oligonucleótidos morfolino (MO) são macromoléculas sintéticas estáveis que contêm as mesmas bases que o ADN ou o ARN; ao se ligarem a sequências de RNA complementares, eles podem reduzir a expressão de genes específicos ou bloquear a ocorrência de outros processos no RNA. O MO pode ser injetado em uma célula de um embrião após o estágio de 32 células, reduzindo a expressão gênica apenas nas células descendentes dessa célula. No entanto, as células no embrião inicial (menos de 32 células) são permeáveis a moléculas grandes, permitindo a difusão entre as células. Diretrizes para o uso de Morpholinos em peixe-zebra descrevem estratégias de controle apropriadas. Morpholinos são comumente microinjetados em 500pL diretamente em embriões de peixe-zebra em estágio de 1-2 células. O morfolino é capaz de se integrar na maioria das células do embrião.

Um problema conhecido com knockdowns de genes é que, porque o genoma sofreu uma duplicação após a divergência de peixes com nadadeiras raiadas e peixes com nadadeiras lobadas, nem sempre é fácil silenciar a atividade de um dos dois genes parálogos de forma confiável devido à complementação pelo outro parálogo. Apesar das complicações do genoma do peixe-zebra, existem várias plataformas globais disponíveis comercialmente para análise da expressão gênica por microarrays e regulação do promotor usando ChIP-on-chip.

Sequenciamento do genoma

O Wellcome Trust Sanger Institute iniciou o projeto de sequenciamento do genoma do peixe-zebra em 2001, e a sequência completa do genoma da cepa de referência de Tuebingen está disponível publicamente na página do genoma do peixe-zebra do National Center for Biotechnology Information (NCBI). A sequência do genoma de referência do peixe-zebra é anotada como parte do projeto Ensembl e é mantida pelo Genome Reference Consortium.

Em 2009, pesquisadores do Instituto de Genômica e Biologia Integrativa em Delhi, na Índia, anunciaram o sequenciamento do genoma de uma linhagem selvagem de peixe-zebra, contendo cerca de 1,7 bilhão de letras genéticas. O genoma do peixe-zebra selvagem foi sequenciado com cobertura de 39 vezes. A análise comparativa com o genoma de referência do peixe-zebra revelou mais de 5 milhões de variações de nucleotídeo único e mais de 1,6 milhão de variações de exclusão de inserção. A sequência do genoma de referência do peixe-zebra de 1,4 GB e mais de 26.000 genes codificadores de proteínas foi publicada por Kerstin Howe et al. em 2013.

DNA mitocondrial

Em outubro de 2001, pesquisadores da Universidade de Oklahoma publicaram D. rerio's sequência completa de DNA mitocondrial. Seu comprimento é de 16.596 pares de bases. Isso está dentro de 100 pares de bases de outras espécies relacionadas de peixes, e é notavelmente apenas 18 pares a mais que o peixe dourado (Carassius auratus) e 21 a mais que a carpa (Cyprinus carpio).). Sua ordem e conteúdo gênico são idênticos à forma comum de vertebrado do DNA mitocondrial. Ele contém 13 genes codificadores de proteínas e uma região de controle não codificante contendo a origem de replicação da fita pesada. Entre um agrupamento de cinco genes de tRNA, encontra-se uma sequência que se assemelha à origem vertebrada da replicação da cadeia leve. É difícil tirar conclusões evolutivas porque é difícil determinar se as mudanças de pares de bases têm significado adaptativo por meio de comparações com outros vertebrados. sequências de nucleotídeos.

Genética do desenvolvimento

T-boxes e homeoboxes são vitais em Danio assim como em outros vertebrados. O Bruce et al. equipe são conhecidos por esta área, e em Bruce et al. 2003 & Bruce et ai. 2005 descobrem o papel de dois destes elementos em oócitos desta espécie. Ao interferir por meio de um alelo não funcional dominante e um morfolino, eles descobrem que o ativador da transcrição T-box Eomesodermin e seu alvo mtx2 – um fator de transcrição – são vitais para a epibolia. (Em Bruce et al. 2003, eles falharam em apoiar a possibilidade de que Eomesodermin se comporte como Vegt. Nem eles nem ninguém foi capaz de localizar qualquer mutação que - na mãe - impeça o início dos processos de desenvolvimento do mesoderma ou endoderma nesta espécie.)

Genes de pigmentação

Em 1999, a mutação nacre foi identificada no peixe-zebra ortólogo do fator de transcrição MITF de mamíferos. Mutações no MITF humano resultam em defeitos oculares e perda de pigmento, um tipo de Síndrome de Waardenburg. Em dezembro de 2005, um estudo da cepa golden identificou o gene responsável por sua pigmentação incomum como SLC24A5, um transportador de soluto que parecia ser necessário para a produção de melanina, e confirmou sua função com um knockdown de Morpholino. O gene ortólogo foi então caracterizado em humanos e uma diferença de um par de bases foi encontrada para segregar fortemente europeus de pele clara e africanos de pele escura. Peixes-zebra com a mutação nacre já foram criados com peixes com uma mutação roy orbison (roy) para produzir peixes que não possuem melanóforos ou iridóforos e são transparentes na idade adulta. Esses peixes são caracterizados por olhos uniformemente pigmentados e pele translúcida.

Transgênese

A transgênese é uma abordagem popular para estudar a função dos genes no peixe-zebra. A construção de peixe-zebra transgênico é bastante fácil por um método que usa o sistema de transposon Tol2. Elemento Tol2 que codifica um gene para uma transposase totalmente funcional capaz de catalisar a transposição na linhagem germinativa do peixe-zebra. Tol2 é o único elemento transponível de DNA natural em vertebrados do qual um membro autônomo foi identificado. Exemplos incluem a interação artificial produzida entre LEF1 e Catenina beta-1/β-catenina/CTNNB1. Dorsky et ai. 2002 investigou o papel de desenvolvimento de Wnt expressando transgenicamente um repórter Lef1/β-catenina.

Existem protocolos bem estabelecidos para edição de genes de zebrafish usando CRISPR-Cas9 e esta ferramenta tem sido usada para gerar modelos geneticamente modificados.

Corpos adultos transparentes

Em 2008, pesquisadores do Hospital Infantil de Boston desenvolveram uma nova linhagem de peixe-zebra, chamada Casper, cujos corpos adultos tinham pele transparente. Isso permite a visualização detalhada da atividade celular, circulação, metástase e muitos outros fenômenos. Em 2019, pesquisadores publicaram um cruzamento de uma cepa prkdc^-/- e uma IL2rga^-/- que produzia, descendentes imunodeficientes, sem células assassinas naturais, bem como células B e T. Esta cepa pode ser adaptada a 37 °C (99 °F) de água morna e a ausência de um sistema imunológico torna possível o uso de xenoenxertos derivados do paciente. Em janeiro de 2013, cientistas japoneses modificaram geneticamente um espécime transparente de peixe-zebra para produzir um brilho visível durante períodos de intensa atividade cerebral.

Em janeiro de 2007, pesquisadores chineses da Universidade de Fudan modificaram geneticamente o peixe-zebra para detectar poluição de estrogênio em lagos e rios, que está ligada à infertilidade masculina. Os pesquisadores clonaram genes sensíveis ao estrogênio e os injetaram nos ovos férteis do peixe-zebra. O peixe modificado ficou verde se colocado em água poluída por estrogênio.

Splicing de RNA

Em 2015, pesquisadores da Brown University descobriram que 10% dos genes do peixe-zebra não precisam depender da proteína U2AF2 para iniciar o splicing de RNA. Esses genes têm os pares de bases de DNA AC e TG como sequências repetidas nas extremidades de cada íntron. No 3'ss (local de splicing 3'), os pares de bases adenina e citosina se alternam e se repetem, e no 5'ss (local de splicing 5'), seus complementos timina e guanina se alternam e repita também. Eles descobriram que havia menos dependência da proteína U2AF2 do que em humanos, nos quais a proteína é necessária para que o processo de splicing ocorra. O padrão de repetição de pares de bases ao redor dos íntrons que altera a estrutura secundária do RNA foi encontrado em outros teleósteos, mas não em tetrápodes. Isso indica que uma mudança evolutiva nos tetrápodes pode ter levado os humanos a depender da proteína U2AF2 para o splicing de RNA, enquanto esses genes no peixe-zebra sofrem splicing independentemente da presença da proteína.

Ortologia

D. rerio tem três transferrinas, todas agrupadas de perto com outros vertebrados.

Depressão por endogamia

Quando parentes próximos acasalam, a progênie pode exibir os efeitos prejudiciais da depressão por endogamia. A depressão por endogamia é predominantemente causada pela expressão homozigótica de alelos deletérios recessivos. Para o peixe-zebra, pode-se esperar que a depressão por endogamia seja mais grave em ambientes estressantes, incluindo aqueles causados pela poluição antropogênica. A exposição do peixe-zebra ao estresse ambiental induzido pelo químico clotrimazol, um fungicida imidazólico usado na agricultura e na medicina veterinária e humana, ampliou os efeitos da endogamia nas principais características reprodutivas. A viabilidade do embrião foi significativamente reduzida em peixes expostos endogâmicos e houve uma tendência de machos endogâmicos gerarem menos descendentes.

Pesquisa em aquicultura

Os peixes-zebra são modelos comuns para pesquisa em piscicultura, incluindo patógenos e parasitas que causam perda de rendimento e/ou disseminação para populações selvagens adjacentes.

Essa utilidade é menor do que poderia ser devido à taxonomia de Danio' distância das espécies aquícolas mais comuns. Porque os mais comuns são os salmonídeos e o bacalhau da família Protacanthopterygii e o robalo, a dourada, tilápia e peixe chato, no Percomorpha, os resultados do peixe zebra podem não ser perfeitamente aplicáveis. Vários outros modelos – Goldfish (Carassius auratus), Medaka (Oryzias latipes), Stickleback (Gasterosteus aculeatus), Barata (Rutilus rutilus ), baiacu (Takifugu rubripes), espadachim (Xiphophorus hellerii) – normalmente são menos usados, mas estariam mais próximos de determinadas espécies-alvo.

As únicas exceções são a carpa (incluindo a carpa capim, Ctenopharyngodon idella) e o peixe-leite (Chanos chanos) que são bastante próximos, sendo ambos da família Cyprinidae. No entanto, também deve ser notado que Danio consistentemente prova ser um modelo útil para mamíferos em muitos casos e há uma distância genética dramaticamente maior entre eles do que entre Danio e qualquer peixe cultivado.

Neuroquímica

Em um mutante com defeito no receptor de glicocorticóides com comportamento exploratório reduzido, a fluoxetina resgatou o comportamento exploratório normal. Isso demonstra relações entre glicocorticóides, fluoxetina e exploração neste peixe.

Descoberta e desenvolvimento de medicamentos

Pesquisa da FDA usou Zebrafish para mostrar os efeitos da quetamina no desenvolvimento neurológico

O peixe-zebra e a larva do peixe-zebra são um organismo modelo adequado para a descoberta e desenvolvimento de medicamentos. Como um vertebrado com 70% de homologia genética com humanos, pode ser preditivo de saúde e doença humana, enquanto seu pequeno tamanho e rápido desenvolvimento facilita experimentos em uma escala maior e mais rápida do que com estudos in vivo mais tradicionais, incluindo o desenvolvimento de estudos superiores. produtividade, ferramentas investigativas automatizadas. Conforme demonstrado por meio de programas de pesquisa em andamento, o modelo do peixe-zebra permite aos pesquisadores não apenas identificar genes que podem estar por trás de doenças humanas, mas também desenvolver novos agentes terapêuticos em programas de descoberta de medicamentos. Os embriões de peixe-zebra provaram ser um modelo de ensaio de teratologia rápido, econômico e confiável.

Telas de drogas

As telas de drogas no peixe-zebra podem ser usadas para identificar novas classes de compostos com efeitos biológicos ou para redirecionar drogas existentes para novos usos; um exemplo do último seria uma triagem que descobriu que uma estatina comumente usada (rosuvastatina) pode suprimir o crescimento do câncer de próstata. Até o momento, 65 triagens de moléculas pequenas foram realizadas e pelo menos uma levou a ensaios clínicos. Nessas telas, muitos desafios técnicos ainda precisam ser resolvidos, incluindo diferentes taxas de absorção de drogas, resultando em níveis de exposição interna que não podem ser extrapolados a partir da concentração de água e altos níveis de variação natural entre animais individuais.

Tóxico ou farmacocinética

Para entender os efeitos da droga, a exposição interna da droga é essencial, pois isso impulsiona o efeito farmacológico. A tradução dos resultados experimentais do peixe-zebra para vertebrados superiores (como humanos) requer relações concentração-efeito, que podem ser derivadas de análises farmacocinéticas e farmacodinâmicas. Devido ao seu pequeno tamanho, no entanto, é muito difícil quantificar a exposição interna à droga. Tradicionalmente, várias amostras de sangue seriam coletadas para caracterizar o perfil de concentração da droga ao longo do tempo, mas essa técnica ainda precisa ser desenvolvida. Até o momento, apenas um único modelo farmacocinético para paracetamol foi desenvolvido em larvas de zebrafish.

Análise de dados computacionais

Usando métodos inteligentes de análise de dados, os processos fisiopatológicos e farmacológicos podem ser compreendidos e posteriormente traduzidos para vertebrados superiores, incluindo humanos. Um exemplo é o uso da farmacologia de sistemas, que é a integração da biologia de sistemas e da farmacometria. A biologia de sistemas caracteriza (parte de) um organismo por uma descrição matemática de todos os processos relevantes. Estes podem ser, por exemplo, diferentes vias de transdução de sinal que, mediante um sinal específico, levam a uma determinada resposta. Ao quantificar esses processos, seu comportamento em situação de saúde e doença pode ser compreendido e previsto. A farmacometria usa dados de experimentos pré-clínicos e ensaios clínicos para caracterizar os processos farmacológicos subjacentes à relação entre a dose do medicamento e sua resposta ou resultado clínico. Estes podem ser, por exemplo, a absorção ou depuração do fármaco pelo organismo, ou a sua interação com o alvo para atingir um determinado efeito. Ao quantificar esses processos, seu comportamento após diferentes doses ou em diferentes pacientes pode ser compreendido e previsto para novas doses ou pacientes. Ao integrar esses dois campos, a farmacologia de sistemas tem o potencial de melhorar o entendimento da interação do fármaco com o sistema biológico por meio da quantificação matemática e posterior predição para novas situações, como novos fármacos ou novos organismos ou pacientes. Usando esses métodos computacionais, a análise mencionada anteriormente da exposição interna ao paracetamol em larvas de peixe-zebra mostrou correlação razoável entre a depuração de paracetamol em peixe-zebra com a de vertebrados superiores, incluindo humanos.

Pesquisa médica

Câncer

O peixe-zebra tem sido usado para fazer vários modelos transgênicos de câncer, incluindo melanoma, leucemia, câncer pancreático e carcinoma hepatocelular. O peixe-zebra que expressa formas mutantes dos oncogenes BRAF ou NRAS desenvolve melanoma quando colocado em um fundo deficiente em p53. Histologicamente, esses tumores se assemelham fortemente à doença humana, são totalmente transplantáveis e exibem alterações genômicas em larga escala. O modelo BRAF de melanoma foi utilizado como plataforma para duas telas publicadas em março de 2011 na revista Nature. Em um estudo, o modelo foi usado como uma ferramenta para entender a importância funcional de genes conhecidos por serem amplificados e superexpressos no melanoma humano. Um gene, SETDB1, acelerou acentuadamente a formação de tumores no sistema zebrafish, demonstrando sua importância como um novo oncogene de melanoma. Isso foi particularmente significativo porque SETDB1 é conhecido por estar envolvido na regulação epigenética que é cada vez mais considerada central para a biologia das células tumorais.

Em outro estudo, foi feito um esforço para direcionar terapeuticamente o programa genético presente na célula da crista neural de origem do tumor usando uma abordagem de triagem química. Isso revelou que uma inibição da proteína DHODH (por uma pequena molécula chamada leflunomida) impediu o desenvolvimento das células-tronco da crista neural que, em última análise, dão origem ao melanoma por meio da interferência no processo de alongamento transcricional. Como essa abordagem visaria atingir a "identidade" da célula do melanoma em vez de uma única mutação genética, a leflunomida pode ter utilidade no tratamento do melanoma humano.

Doenças cardiovasculares

Na pesquisa cardiovascular, o peixe-zebra tem sido usado para modelar o modelo de infarto do miocárdio humano. O coração do peixe-zebra se regenera completamente após cerca de 2 meses de lesão sem qualquer formação de cicatriz. O peixe-zebra também é usado como modelo para coagulação sanguínea, desenvolvimento de vasos sanguíneos e doenças cardíacas e renais congênitas.

Sistema imunológico

Em programas de pesquisa sobre inflamação aguda, um importante processo subjacente em muitas doenças, os pesquisadores estabeleceram um modelo de inflamação do peixe-zebra e sua resolução. Esta abordagem permite o estudo detalhado dos controles genéticos da inflamação e a possibilidade de identificar potenciais novas drogas.

O peixe-zebra tem sido amplamente utilizado como organismo modelo para estudar a imunidade inata dos vertebrados. O sistema imune inato é capaz de atividade fagocítica por 28 a 30 h pós-fertilização (hpf), enquanto a imunidade adaptativa não está funcionalmente madura até pelo menos 4 semanas pós-fertilização.

Doenças infecciosas

Como o sistema imunológico é relativamente conservado entre zebrafish e humanos, muitas doenças infecciosas humanas podem ser modeladas em zebrafish. Os estágios transparentes do início da vida são adequados para imagens in vivo e dissecação genética de interações patógeno-hospedeiro. Modelos de peixe-zebra para uma ampla gama de patógenos bacterianos, virais e parasitários já foram estabelecidos; por exemplo, o modelo de peixe-zebra para tuberculose fornece informações fundamentais sobre os mecanismos de patogênese de micobactérias. Além disso, a tecnologia robótica foi desenvolvida para triagem de drogas antimicrobianas de alto rendimento usando modelos de infecção de peixe-zebra.

Reparando danos na retina

O desenvolvimento de uma única retina de zebrafish capturada em um microscópio de folha de luz aprox. a cada 12 horas de 1,5 dias a 3,5 dias após o nascimento do embrião.

Outra característica notável do peixe-zebra é que ele possui quatro tipos de células cone, com células sensíveis ao ultravioleta complementando os subtipos de células cone vermelho, verde e azul encontrados em humanos. Zebrafish pode, assim, observar um espectro muito amplo de cores. A espécie também é estudada para entender melhor o desenvolvimento da retina; em particular, como as células cônicas da retina se organizam no chamado 'mosaico cônico'. O peixe-zebra, além de alguns outros peixes teleósteos, é particularmente conhecido por ter extrema precisão no arranjo das células do cone.

Este estudo das características da retina do peixe-zebra também extrapolou para a investigação médica. Em 2007, pesquisadores da University College London cultivaram um tipo de célula-tronco adulta de peixe-zebra encontrada nos olhos de peixes e mamíferos que se desenvolve em neurônios na retina. Estes poderiam ser injetados no olho para tratar doenças que danificam os neurônios da retina – quase todas as doenças oculares, incluindo degeneração macular, glaucoma e cegueira relacionada ao diabetes. Os pesquisadores estudaram as células gliais de Müller nos olhos de humanos com idades entre 18 meses e 91 anos e conseguiram desenvolvê-las em todos os tipos de neurônios da retina. Eles também foram capazes de cultivá-los facilmente no laboratório. As células-tronco migraram com sucesso para ratos doentes. retinas, e assumiu as características dos neurônios circundantes. A equipe afirmou que pretendia desenvolver a mesma abordagem em humanos.

Distrofias musculares

As distrofias musculares (DM) são um grupo heterogêneo de distúrbios genéticos que causam fraqueza muscular, contrações anormais e perda de massa muscular, muitas vezes levando à morte prematura. Zebrafish é amplamente utilizado como organismo modelo para estudar distrofias musculares. Por exemplo, o mutante sapje (sap) é o peixe-zebra ortólogo da distrofia muscular de Duchenne (DMD) humana. O Machuca-Tzili e colaboradores aplicaram o peixe-zebra para determinar o papel do fator de splicing alternativo, MBNL, na patogênese da distrofia miotônica tipo 1 (DM1). Mais recentemente, Todd et al. descreveram um novo modelo de peixe-zebra projetado para explorar o impacto da expressão de repetição CUG durante o desenvolvimento inicial da doença DM1. O peixe-zebra também é um excelente modelo animal para estudar distrofias musculares congênitas, incluindo CMD Tipo 1 A (CMD 1A) causada por mutação no gene humano da laminina α2 (LAMA2). O peixe-zebra, por causa de suas vantagens discutidas acima e, em particular, a capacidade dos embriões de peixe-zebra de absorver produtos químicos, tornou-se um modelo de escolha na triagem e teste de novas drogas contra distrofias musculares.

Fisiologia e patologia óssea

Os peixes-zebra têm sido usados como organismos modelo para o metabolismo ósseo, renovação tecidual e atividade de reabsorção. Esses processos são amplamente conservados evolutivamente. Eles têm sido usados para estudar a osteogênese (formação óssea), avaliando a diferenciação, atividade de deposição de matriz e cross-talk de células esqueléticas, para criar e isolar mutantes que modelam doenças ósseas humanas e testar novos compostos químicos para a capacidade de reverter defeitos ósseos. As larvas podem ser usadas para acompanhar a formação de novos osteoblastos (de novo) durante o desenvolvimento ósseo. Eles começam a mineralizar elementos ósseos tão cedo quanto 4 dias após a fertilização. Recentemente, peixes-zebra adultos estão sendo usados para estudar doenças ósseas complexas relacionadas à idade, como osteoporose e osteogênese imperfeita. As escamas (elasmóides) do peixe-zebra funcionam como uma camada externa protetora e são pequenas placas ósseas feitas por osteoblastos. Essas estruturas exoesqueléticas são formadas por osteoblastos depositadores de matriz óssea e são remodeladas por osteoclastos. As escamas também atuam como o principal depósito de cálcio dos peixes. Eles podem ser cultivados ex-vivo (mantidos vivos fora do organismo) em uma placa de poços múltiplos, o que permite a manipulação com drogas e até a triagem de novas drogas que possam alterar o metabolismo ósseo (entre osteoblastos e osteoclastos).

Diabetes

O desenvolvimento do pâncreas do peixe-zebra é muito homólogo ao de mamíferos, como camundongos. Os mecanismos de sinalização e a maneira como o pâncreas funciona são muito semelhantes. O pâncreas tem um compartimento endócrino, que contém uma variedade de células. Células PP pancreáticas que produzem polipeptídeos e células β que produzem insulina são dois exemplos dessas células. Essa estrutura do pâncreas, junto com o sistema de homeostase da glicose, é útil no estudo de doenças, como diabetes, relacionadas ao pâncreas. Modelos para a função do pâncreas, como coloração fluorescente de proteínas, são úteis para determinar os processos de homeostase da glicose e o desenvolvimento do pâncreas. Os testes de tolerância à glicose foram desenvolvidos usando peixe-zebra e agora podem ser usados para testar a intolerância à glicose ou diabetes em humanos. A função da insulina também está sendo testada em peixe-zebra, o que contribuirá ainda mais para a medicina humana. A maior parte do trabalho feito em torno do conhecimento sobre a homeostase da glicose veio do trabalho com peixes-zebra transferidos para humanos.

Obesidade

O peixe-zebra tem sido usado como um sistema modelo para estudar a obesidade, com pesquisas sobre obesidade genética e obesidade induzida por supernutrição. O peixe-zebra obeso, semelhante aos mamíferos obesos, apresenta desregulação das vias metabólicas de controle de lipídios, o que leva ao ganho de peso sem o metabolismo lipídico normal. Também como os mamíferos, o peixe-zebra armazena o excesso de lipídios em depósitos adiposos viscerais, intramusculares e subcutâneos. Essas e outras razões tornam o peixe-zebra um bom modelo para estudar a obesidade em humanos e outras espécies. A obesidade genética é geralmente estudada em peixes-zebra transgênicos ou mutantes com genes obesogênicos. Como exemplo, o peixe-zebra transgênico com AgRP superexpresso, um antagonista endógeno da melacortina, apresentou aumento do peso corporal e deposição adiposa durante o crescimento. Embora os genes do peixe-zebra possam não ser exatamente os mesmos dos genes humanos, esses testes podem fornecer informações importantes sobre possíveis causas genéticas e tratamentos para a obesidade genética humana. Modelos de peixes-zebra com obesidade induzida por dieta são úteis, pois a dieta pode ser modificada desde muito cedo. Dietas ricas em gordura e dietas de superalimentação em geral mostram aumentos rápidos na deposição adiposa, aumento do IMC, hepatoesteatose e hipertrigliceridemia. No entanto, os espécimes com gordura normal e superalimentados ainda são metabolicamente saudáveis, enquanto os espécimes com dieta rica em gordura não são. Compreender as diferenças entre os tipos de obesidade induzida pela alimentação pode ser útil no tratamento humano da obesidade e condições de saúde relacionadas.

Toxicologia ambiental

O Zebrafish tem sido usado como um sistema modelo em estudos de toxicologia ambiental.

Epilepsia

Os peixes-zebra têm sido usados como um sistema modelo para estudar a epilepsia. As convulsões em mamíferos podem ser recapituladas molecular, comportamental e eletrofisiologicamente, usando uma fração dos recursos necessários para experimentos em mamíferos.