Teste de Ames
O teste de Ames é um método amplamente empregado que usa bactérias para testar se um determinado produto químico pode causar mutações no DNA do organismo de teste. Mais formalmente, é um ensaio biológico para avaliar o potencial mutagênico de compostos químicos. Um teste positivo indica que o produto químico é mutagênico e, portanto, pode atuar como cancerígeno, porque o câncer geralmente está ligado à mutação. O teste serve como um ensaio rápido e conveniente para estimar o potencial carcinogênico de um composto porque os ensaios carcinógenos padrão em camundongos e ratos são demorados (levando de dois a três anos para serem concluídos) e caros. No entanto, falsos positivos e falsos negativos são conhecidos.
O procedimento foi descrito em uma série de artigos no início dos anos 1970 por Bruce Ames e seu grupo na Universidade da Califórnia, em Berkeley.
Procedimento geral
O teste de Ames utiliza várias cepas da bactéria Salmonella typhimurium que carregam mutações em genes envolvidos na síntese de histidina. Essas cepas são mutantes auxotróficos, ou seja, requerem histidina para crescer, mas não podem produzi-la. O método testa a capacidade da substância testada em criar mutações que resultam no retorno a um estado "prototrófico" estado, para que as células possam crescer em um meio livre de histidina.
As cepas de teste são especialmente construídas para detectar mutações frameshift (por exemplo, cepas TA-1537 e TA-1538) ou pontuais (por exemplo, cepa TA-1531) nos genes necessários para sintetizar a histidina, de modo que agentes mutagênicos que atuam por meio de diferentes mecanismos possam ser identificado. Alguns compostos são bastante específicos, causando reversões em apenas uma ou duas cepas. As cepas testadoras também carregam mutações nos genes responsáveis pela síntese de lipopolissacarídeos, tornando a parede celular da bactéria mais permeável, e no sistema de reparo por excisão para tornar o teste mais sensível.
Organismos maiores, como mamíferos, têm processos metabólicos que podem potencialmente transformar um produto químico considerado não mutagênico em outro que é ou um que é considerado mutagênico em outro que não é. Portanto, para testar com mais eficácia a mutagenicidade de um composto químico em relação a organismos maiores, enzimas hepáticas de rato podem ser adicionadas na tentativa de replicar os processos metabólicos. efeito sobre o composto sendo testado no Teste de Ames. Extrato de fígado de rato é opcionalmente adicionado para simular o efeito do metabolismo, já que alguns compostos, como benzo[a]pireno, não são mutagênicos, mas seus produtos metabólicos são.
As bactérias são espalhadas em uma placa de ágar com pequena quantidade de histidina. Esta pequena quantidade de histidina no meio de crescimento permite que as bactérias cresçam por um tempo inicial e tenham a oportunidade de sofrer mutações. Quando a histidina é esgotada, apenas as bactérias que sofreram mutação para ganhar a capacidade de produzir sua própria histidina sobreviverão. A placa é incubada por 48 horas. A mutagenicidade de uma substância é proporcional ao número de colônias observadas.
Teste de Ames e agentes cancerígenos
Os mutagênicos identificados por meio do teste de Ames também são possíveis carcinógenos, e os primeiros estudos de Ames mostraram que 90% dos carcinógenos conhecidos podem ser identificados por meio desse teste. Estudos posteriores, no entanto, mostraram a identificação de 50 a 70% dos carcinógenos conhecidos. O teste foi usado para identificar uma série de compostos previamente utilizados em produtos comerciais como potenciais carcinógenos. Exemplos incluem tris(2,3-dibromopropil)fosfato, que foi usado como retardador de chama em plástico e têxteis, como pijamas infantis, e furilfuramida, que foi usado como aditivo antibacteriano em alimentos no Japão nas décadas de 1960 e 1970. De fato, a furilfuramida já havia passado por testes em animais, mas testes mais vigorosos após sua identificação no teste de Ames mostraram que ela era cancerígena. Seus testes positivos resultaram na retirada desses produtos químicos de uso em produtos de consumo.
Um resultado interessante do teste de Ames é que a curva de resposta à dose usando várias concentrações do produto químico é quase sempre linear, indicando que não há concentração limite para mutagênese. Sugere, portanto, que, como acontece com a radiação, pode não haver limite seguro para mutagênicos químicos ou carcinógenos. No entanto, alguns propuseram que os organismos poderiam tolerar baixos níveis de mutagênicos devido a mecanismos de proteção, como o reparo do DNA e, portanto, pode existir um limite para certos mutagênicos químicos. O próprio Bruce Ames argumentou contra a extrapolação linear de dose-resposta da alta dose usada em testes de carcinogênese em sistemas animais para a dose mais baixa de produtos químicos normalmente encontrados na exposição humana, pois os resultados podem ser falsos positivos devido à resposta mitogênica causada pela dose artificialmente alta de produtos químicos usados em tais testes. Ele também alertou contra a "histeria sobre pequenos vestígios de produtos químicos que podem ou não causar câncer", que "elimina completamente os principais riscos dos quais você deve estar ciente".
O teste de Ames é freqüentemente usado como uma das triagens iniciais de possíveis drogas para eliminar possíveis carcinógenos, e é um dos oito testes exigidos pela Lei de Pesticidas (EUA) e um dos seis testes exigidos pela Toxic Lei de Controle de Substâncias (EUA).
Limitações
Salmonella typhimurium é um procariota, portanto não é um modelo perfeito para humanos. A fração S9 do fígado de rato é usada para imitar as condições metabólicas dos mamíferos, de modo que o potencial mutagênico dos metabólitos formados por uma molécula parental no sistema hepático possa ser avaliado; no entanto, existem diferenças no metabolismo entre humanos e ratos que podem afetar a mutagenicidade dos produtos químicos testados. O teste pode, portanto, ser melhorado pelo uso da fração S9 de fígado humano; seu uso era anteriormente limitado por sua disponibilidade, mas agora está disponível comercialmente e, portanto, pode ser mais viável. Um modelo in vitro adaptado foi feito para células eucarióticas, por exemplo levedura.
Os mutagênicos identificados no teste de Ames não precisam ser necessariamente cancerígenos, e mais testes são necessários para qualquer potencial cancerígeno identificado no teste. Drogas que contêm a porção de nitrato às vezes voltam positivas para Ames quando são realmente seguras. Os compostos de nitrato podem gerar óxido nítrico, uma importante molécula sinalizadora que pode dar um falso positivo. A nitroglicerina é um exemplo que dá um Ames positivo, mas ainda é usado no tratamento hoje. No entanto, os nitratos nos alimentos podem ser reduzidos por ação bacteriana a nitritos, que são conhecidos por gerar carcinógenos ao reagir com aminas e amidas. Longos estudos de toxicologia e resultados são necessários com tais compostos para refutar um teste de Ames positivo.
Método de flutuação
O teste de Ames foi desenvolvido inicialmente usando placas de ágar (a técnica de incorporação de placas), conforme descrito acima. Desde então, foi desenvolvida uma alternativa à realização do teste de Ames, conhecida como "método de flutuação". Essa técnica tem o mesmo conceito do método à base de ágar, em que bactérias são adicionadas a uma mistura reacional com uma pequena quantidade de histidina, o que permite que as bactérias cresçam e sofram mutações, voltando a sintetizar sua própria histidina. Ao incluir um indicador de pH, a frequência de mutação é contada nas microplacas como o número de poços que mudaram de cor (causada por uma queda no pH devido a processos metabólicos de reprodução de bactérias). Como no teste de Ames tradicional, a amostra é comparada com a taxa de fundo natural de mutação reversa para estabelecer a genotoxicidade de uma substância. O método de flutuação é realizado inteiramente em cultura líquida e é pontuado pela contagem do número de poços que mudam de amarelo para roxo em microplacas de 96 ou 384 poços.
No método da placa de 96 poços, a frequência da mutação é contada como o número de poços em 96 que mudaram de cor. As placas são incubadas por até cinco dias, com colônias mutantes (amarelas) sendo contadas a cada dia e comparadas com a taxa de fundo de mutação reversa usando tabelas de significância estabelecidas para determinar as diferenças significativas entre a taxa de fundo de mutação e aquela para o testado amostras.
No método de microflutuação de placa de 384 poços mais reduzido, a frequência da mutação é contada como o número de poços de 48 que mudaram de cor após 2 dias de incubação. Uma amostra de teste é analisada em 6 níveis de dose com dose zero simultânea (background) e controles positivos que se encaixam em uma placa de 384 poços. O ensaio é realizado em triplicado para fornecer robustez estatística. Ele usa as cepas testadoras recomendadas da Diretriz 471 da OCDE (auxotróficas de histidina e auxotróficas de triptofano).
O método de flutuação é comparável ao método tradicional de pour plate em termos de sensibilidade e precisão, no entanto, tem uma série de vantagens: requer menos amostra de teste, tem um ponto final colorimétrico simples, contando o número de poços positivos de 96 ou 48 poços possíveis consome muito menos tempo do que contar colônias individuais em uma placa de ágar. Vários kits comerciais estão disponíveis. A maioria dos kits possui componentes consumíveis prontos para uso, incluindo bactérias liofilizadas, e os testes podem ser realizados com pipetas multicanal. O método de flutuação também permite testar volumes maiores de amostras aquosas (até 75% v/v), aumentando a sensibilidade e estendendo sua aplicação a mutagênicos ambientais de baixo nível.