Quimotripsina
Quimotripsina (EC 3.4.21.1, quimotripsinas A e B, alpha-chymar ophth, avazyme, chymar, chymotest, enzeon, quimar, quimotrase, alpha-chymar, alpha-chymotrypsin A, alpha- quimotripsina) é uma enzima digestiva componente do suco pancreático que atua no duodeno, onde realiza a proteólise, a quebra de proteínas e polipeptídeos. A quimotripsina cliva preferencialmente ligações amida peptídicas onde a cadeia lateral do aminoácido N-terminal à ligação amida cindivel (a posição P1) é um grande aminoácido hidrofóbico (tirosina, triptofano e fenilalanina). Esses aminoácidos contêm um anel aromático em sua cadeia lateral que se encaixa em uma bolsa hidrofóbica (a posição S1) da enzima. É ativado na presença de tripsina. A complementaridade hidrofóbica e de forma entre a cadeia lateral do substrato peptídico P1 e a cavidade de ligação da enzima S1 é responsável pela especificidade do substrato desta enzima. A quimotripsina também hidrolisa outras ligações amida em peptídeos em taxas mais lentas, particularmente aqueles que contêm leucina na posição P1.
Estruturalmente, é a estrutura arquetípica para sua superfamília, o clã PA de proteases.
Ativação
A quimotripsina é sintetizada no pâncreas. Seu precursor é o quimotripsinogênio. A tripsina ativa o quimotripsinogênio pela clivagem de ligações peptídicas nas posições Arg15 – Ile16 e produz π-quimotripsina. Por sua vez, o grupo amínico (-NH3+) do resíduo Ile16 interage com a cadeia lateral do Asp194, produzindo o "oxiânion hole" e o hidrofóbico "bolso S1". Além disso, a quimotripsina induz sua própria ativação pela clivagem nas posições 14-15, 146-147 e 148-149, produzindo α-quimotripsina (que é mais ativa e estável que a π-quimotripsina). A molécula resultante é uma molécula de três polipeptídeos interconectados por pontes dissulfeto.
Mecanismo de ação e cinética
In vivo, a quimotripsina é uma enzima proteolítica (serina protease) que atua no sistema digestivo de muitos organismos. Facilita a quebra de ligações peptídicas por uma reação de hidrólise, que apesar de ser termodinamicamente favorável, ocorre de forma extremamente lenta na ausência de um catalisador. Os principais substratos da quimotripsina são ligações peptídicas nas quais o aminoácido N-terminal da ligação é um triptofano, tirosina, fenilalanina ou leucina. Como muitas proteases, a quimotripsina também hidrolisa ligações amida in vitro, uma virtude que permitiu o uso de análogos de substrato, como N-acetil-L-fenilalanina p-nitrofenilamida para ensaios enzimáticos.
A quimotripsina cliva as ligações peptídicas atacando o grupo carbonila não reativo com um poderoso nucleófilo, o resíduo serina 195 localizado no sítio ativo da enzima, que brevemente se liga covalentemente ao substrato, formando um intermediário enzima-substrato. Junto com a histidina 57 e o ácido aspártico 102, esse resíduo de serina constitui a tríade catalítica do sítio ativo. Essas descobertas se baseiam em ensaios de inibição e no estudo da cinética de clivagem do referido substrato, explorando o fato de que o intermediário enzima-substrato p-nitrofenolato tem uma cor amarela, permitindo medir sua concentração medindo a absorção de luz a 410 nm.
A catálise da quimotripsina da hidrólise de um substrato protéico (em vermelho) é realizada em duas etapas. Primeiro, a nucleofilicidade de Ser-195 é aumentada pela catálise de base geral, na qual o próton do grupo hidroxila da serina é transferido para a porção imidazol de His-57 durante seu ataque ao carbono carbonílico deficiente em elétrons da proteína-substrato principal. cadeia (passo k1). Isso ocorre por meio da ação concertada dos resíduos de três aminoácidos na tríade catalítica. O acúmulo de carga negativa no intermediário tetraédrico resultante é estabilizado no orifício oxiânion do sítio ativo da enzima, pela formação de duas ligações de hidrogênio com hidrogênios de amida adjacentes da cadeia principal.
A fração His-57 imidazólio formada na etapa k1 é um catalisador ácido geral para a reação k-1. No entanto, a evidência de catálise de ácido geral semelhante da reação k2 (Tet2) foi controvertida; aparentemente a água fornece um próton para o grupo de saída da amina.
A quebra de Tet1 (via k3) gera uma enzima acil, que é hidrolisada com His-57 atuando como uma base geral (kH2O) na formação de um intermediário tetraédrico, que se decompõe para regenerar a porção hidroxila da serina, bem como o fragmento de proteína com o terminal carboxilo recém-formado.