DNA ligase

DNA ligase é um tipo de enzima que facilita a união das cadeias de DNA ao catalisar a formação de uma ligação fosfodiéster. Ele desempenha um papel na reparação de quebras de fita simples no DNA duplex em organismos vivos, mas algumas formas (como a DNA ligase IV) podem reparar especificamente quebras de fita dupla (isto é, uma quebra em ambas as fitas complementares de DNA). As quebras de fita simples são reparadas pela DNA ligase usando a fita complementar da dupla hélice como modelo, com a DNA ligase criando a ligação fosfodiéster final para reparar completamente o DNA.

A DNA ligase é usada tanto no reparo quanto na replicação do DNA (consulte ligases de mamíferos). Além disso, a DNA ligase tem uso extensivo em laboratórios de biologia molecular para experimentos de DNA recombinante (consulte Aplicativos de pesquisa). A DNA ligase purificada é usada na clonagem de genes para unir moléculas de DNA para formar DNA recombinante.

Mecanismo enzimático

A imagem demonstra como a ligase (oval amarelo) catalisa duas vertentes de fragmento de DNA. O ligase junta-se aos dois fragmentos de DNA para formar um fio mais longo de DNA "passando" eles juntos.

O mecanismo da DNA ligase é formar duas ligações fosfodiéster covalentes entre 3' extremidades hidroxila de um nucleotídeo ("aceptor"), com o 5' extremidade de fosfato de outro ("doador"). Duas moléculas de ATP são consumidas para cada ligação fosfodiéster formada. O AMP é necessário para a reação da ligase, que ocorre em quatro etapas:

1. Reorganização do local de atividade, como nicks em segmentos de DNA ou fragmentos Okazaki etc.
2. Adenilação (adição de AMP) de um resíduo de lisina no centro ativo da enzima, o pirophosfato é liberado;
3. Transferência do AMP para o fosfato 5 do chamado doador, formação de um vínculo pirophosfato;
4. Formação de uma ligação de fosfodiester entre o fosfato 5 do doador e o hidroxilo 3 do aceptor.

Um exemplo pictórico de como um ligase funciona (com pontas pegajosas)

A ligase também funcionará com extremidades rombas, embora sejam necessárias concentrações de enzima mais altas e diferentes condições de reação.

Tipos

E. coli

A E. coli DNA ligase é codificada pelo gene lig. DNA ligase em E. coli, assim como a maioria dos procariotos, usa a energia obtida pela clivagem do dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NAD) para criar a ligação fosfodiéster. Ele não liga o DNA de extremidades cegas, exceto sob condições de aglomeração molecular com polietilenoglicol, e não pode unir o RNA ao DNA de forma eficiente.

A atividade da DNA ligase de E. coli pode ser aumentada pela DNA polimerase nas concentrações certas. O realce só funciona quando as concentrações da DNA polimerase 1 são muito menores do que os fragmentos de DNA a serem ligados. Quando as concentrações de polimerases de DNA Pol I são mais altas, há um efeito adverso na DNA ligase de E. coli

T4

A DNA ligase do bacteriófago T4 (um bacteriófago que infecta a bactéria Escherichia coli). A T4 ligase é a mais comumente usada em pesquisas de laboratório. Ele pode ligar extremidades coesivas ou cegas de DNA, oligonucleotídeos, bem como híbridos de RNA e RNA-DNA, mas não ácidos nucleicos de fita simples. Ele também pode ligar o DNA de extremidades cegas com muito mais eficiência do que o E. coli DNA ligase. Ao contrário de E. coli DNA ligase, T4 DNA ligase não pode utilizar NAD e tem um requisito absoluto de ATP como cofator. Alguma engenharia foi feita para melhorar a atividade in vitro da T4 DNA ligase; uma abordagem bem-sucedida, por exemplo, testou a T4 DNA ligase fundida a várias proteínas alternativas de ligação ao DNA e descobriu que as construções com p50 ou NF-kB como parceiros de fusão eram mais de 160% mais ativas em ligações cegas para fins de clonagem do que o tipo selvagem T4 DNA ligase. Uma reação típica para inserir um fragmento em um vetor de plasmídeo usaria cerca de 0,01 (extremidades pegajosas) a 1 (extremidades cegas) unidades de ligase. A temperatura de incubação ideal para T4 DNA ligase é de 16°C.

Os mutantes da bacteriófago T4 ligase têm maior sensibilidade à irradiação UV e ao agente alquilante metil metanossulfonato, indicando que a DNA ligase é empregada no reparo dos danos ao DNA causados por esses agentes.

Mamífero

Em mamíferos, existem quatro tipos específicos de ligase.

1. DNA ligase I: liga o DNA nascente da cadeia lagging após a Ribonuclease H removeu o primer do RNA dos fragmentos de Okazaki.
2. DNA ligase III: complexos com proteína de reparo de DNA XRCC1 para auxiliar na vedação do DNA durante o processo de reparação de excisão de nucleotídeos e fragmentos recombinantes. De todas as ligases de DNA mamíferos conhecidas, apenas Lig III foi encontrado para estar presente nas mitocôndrias.
3. DNA ligase IV: complexos com XRCC4. Ele catalisa o passo final na extremidade não-homologous juntando o caminho de reparo de ruptura de dupla distância do DNA. Também é necessário para a recombinação V(D)J, o processo que gera diversidade em loci do receptor da imunoglobulina e da célula T durante o desenvolvimento do sistema imunológico.

• Ligação de DNA II: Um artefato de purificação resultante da degradação proteolítica da ligase do DNA III. Inicialmente, foi reconhecido como outro ligase de DNA e é a razão para a nomenclatura incomum de ligases de DNA.

A DNA ligase de eucariotos e alguns micróbios usa trifosfato de adenosina (ATP) em vez de NAD.

Termostável

Derivada de uma bactéria termofílica, a enzima é estável e ativa em temperaturas muito mais altas do que as DNA ligases convencionais. Sua meia-vida é de 48 horas a 65°C e superior a 1 hora a 95°C. Demonstrou-se que a Ampligase DNA Ligase é ativa por pelo menos 500 ciclos térmicos (94 °C/80 °C) ou 16 horas de ciclismo.¹⁰ Essa termoestabilidade excepcional permite um rigor de hibridização extremamente alto e especificidade de ligação.

Medição da atividade

Existem pelo menos três unidades diferentes usadas para medir a atividade da DNA ligase:

• Unidade de Weiss - a quantidade de ligase que catalisa a troca de 1 nmole de ³²P de piroposfato inorgânico para ATP em 20 minutos em 37^°C. Este é o mais comumente usado.
• Unidade Modrich-Lehman - isto raramente é usado, e uma unidade é definida como a quantidade de enzima necessária para converter 100 nmoles de d (A-T)_n a uma forma resistente exonuclease-III em 30 minutos em condições padrão.
• Muitos fornecedores comerciais de ligases usam uma unidade arbitrária com base na capacidade de ligase a extremidades coesas ligadas. Essas unidades são muitas vezes mais subjetivas do que quantitativas e carentes de precisão.

Aplicativos de pesquisa

As ligases de DNA tornaram-se ferramentas indispensáveis na pesquisa de biologia molecular moderna para gerar sequências de DNA recombinante. Por exemplo, ligases de DNA são usadas com enzimas de restrição para inserir fragmentos de DNA, geralmente genes, em plasmídeos.

Controlar a temperatura ideal é um aspecto vital da realização de experimentos de recombinação eficientes envolvendo a ligação de fragmentos coesivos. A maioria dos experimentos usa T4 DNA Ligase (isolado do bacteriófago T4), que é mais ativo a 37°C. No entanto, para uma eficiência de ligação ideal com fragmentos de extremidades coesas ("extremidades adesivas"), a temperatura ideal da enzima precisa ser equilibrada com a temperatura de fusão T_m das extremidades adesivas que estão sendo ligadas, o emparelhamento homólogo das extremidades pegajosas não será estável porque a alta temperatura interrompe a ligação de hidrogênio. Uma reação de ligação é mais eficiente quando as extremidades pegajosas já estão recozidas de forma estável e, portanto, a interrupção das extremidades de recozimento resultaria em baixa eficiência de ligação. Quanto menor o balanço, menor o T_m.

Como os fragmentos de DNA com extremidades cegas não possuem extremidades coesivas para recozimento, a temperatura de fusão não é um fator a ser considerado dentro da faixa de temperatura normal da reação de ligação. O fator limitante na ligação de extremidade cega não é a atividade da ligase, mas sim o número de alinhamentos entre as extremidades dos fragmentos de DNA que ocorrem. A temperatura de ligação mais eficiente para o DNA de extremidades cegas seria, portanto, a temperatura na qual o maior número de alinhamentos pode ocorrer. A maioria das ligaduras rombas é realizada a 14-25 °C durante a noite. A ausência de extremidades recozidas de forma estável também significa que a eficiência de ligação é reduzida, exigindo o uso de uma concentração de ligase mais alta.

Um novo uso da DNA ligase pode ser visto no campo da nanoquímica, especificamente em origami de DNA. Os princípios de automontagem baseados em DNA provaram ser úteis para organizar objetos em nanoescala, como biomoléculas, nanomáquinas, componentes nanoeletrônicos e fotônicos. A montagem dessa nanoestrutura requer a criação de uma malha intrincada de moléculas de DNA. Embora a automontagem do DNA seja possível sem qualquer ajuda externa, usando diferentes substratos, como o fornecimento de superfície catatônica de folha de alumínio, a DNA ligase pode fornecer a assistência enzimática necessária para criar a estrutura da treliça do DNA a partir do DNA suspenso.

História

A primeira DNA ligase foi purificada e caracterizada em 1967 pelos laboratórios Gellert, Lehman, Richardson e Hurwitz. Foi primeiro purificado e caracterizado por Weiss e Richardson usando um processo de fracionamento cromatográfico de seis etapas, começando com a eliminação de detritos celulares e adição de estreptomicina, seguido por várias lavagens de coluna de dietilaminoetil (DEAE)-celulose e um fracionamento final de fosfocelulose. O extrato final continha 10% da atividade inicialmente registrada no E. coli mídia; ao longo do processo descobriu-se que ATP e Mg++ eram necessários para otimizar a reação. As DNA ligases comuns comercialmente disponíveis foram originalmente descobertas no bacteriófago T4, E. coli e outras bactérias.

Distúrbios

As deficiências genéticas nas ligases de DNA humano têm sido associadas a síndromes clínicas marcadas por imunodeficiência, sensibilidade à radiação e anormalidades de desenvolvimento. A síndrome LIG4 (síndrome da Ligase IV) é uma doença rara associada a mutações na DNA ligase 4 e interfere na quebra do dsDNA mecanismos de reparação. A síndrome da ligase IV causa imunodeficiência em indivíduos e é comumente associada a microcefalia e hipoplasia medular. Uma lista de doenças prevalentes causadas pela falta ou mau funcionamento da DNA ligase é a seguinte.

Xeroderma pigmentoso

O xeroderma pigmentoso, comumente conhecido como XP, é uma condição hereditária caracterizada por uma sensibilidade extrema aos raios ultravioleta (UV) da luz solar. Esta condição afeta principalmente os olhos e áreas da pele expostas ao sol. Alguns indivíduos afetados também têm problemas envolvendo o sistema nervoso.

Ataxia-telangiectasia

Mutações no gene ATM causam ataxia-telangiectasia. O gene ATM fornece instruções para produzir uma proteína que ajuda a controlar a divisão celular e está envolvida no reparo do DNA. Esta proteína desempenha um papel importante no desenvolvimento normal e na atividade de vários sistemas do corpo, incluindo o sistema nervoso e o sistema imunológico. A proteína ATM auxilia as células no reconhecimento de fitas de DNA danificadas ou quebradas e coordena o reparo do DNA ativando enzimas que consertam as fitas quebradas. O reparo eficiente de fitas de DNA danificadas ajuda a manter a estabilidade da informação genética da célula. As crianças afetadas geralmente desenvolvem dificuldade para andar, problemas de equilíbrio e coordenação das mãos, movimentos involuntários de espasmos (coreia), espasmos musculares (mioclonia) e distúrbios na função nervosa (neuropatia). Os problemas de movimento geralmente fazem com que as pessoas precisem de assistência em cadeira de rodas na adolescência. As pessoas com esse distúrbio também têm fala arrastada e dificuldade para mover os olhos para olhar de um lado para o outro (apraxia oculomotora).

Anemia de Fanconi

A anemia de Fanconi (AF) é uma doença sanguínea hereditária rara que leva à falência da medula óssea. FA impede que a medula óssea produza novas células sanguíneas suficientes para o corpo funcionar normalmente. A AF também pode fazer com que a medula óssea produza muitas células sanguíneas defeituosas. Isso pode levar a sérios problemas de saúde, como leucemia.

Síndrome de Bloom

A síndrome de Bloom resulta em pele sensível à exposição ao sol e, geralmente, no desenvolvimento de uma mancha avermelhada em forma de borboleta no nariz e nas bochechas. Uma erupção cutânea também pode aparecer em outras áreas normalmente expostas ao sol, como as costas das mãos e os antebraços. Pequenos aglomerados de vasos sanguíneos dilatados (telangiectasias) geralmente aparecem na erupção cutânea; telangiectasias também podem ocorrer nos olhos. Outras características da pele incluem manchas de pele que são mais claras ou mais escuras do que as áreas circundantes (hipopigmentação ou hiperpigmentação, respectivamente). Essas manchas aparecem em áreas da pele que não são expostas ao sol e seu desenvolvimento não está relacionado às erupções cutâneas.

Como alvo de drogas

Em estudos recentes, a DNA ligase I humana foi usada no projeto de medicamentos auxiliado por computador para identificar os inibidores da DNA ligase como possíveis agentes terapêuticos para tratar o câncer. Uma vez que o crescimento celular excessivo é uma marca registrada do desenvolvimento do câncer, a quimioterapia direcionada que interrompe o funcionamento da DNA ligase pode impedir as formas adjuvantes de câncer. Além disso, foi demonstrado que as ligases de DNA podem ser amplamente divididas em duas categorias, a saber, dependentes de ATP e NAD⁺. Pesquisas anteriores mostraram que, embora DNA ligases dependentes de NAD⁺ tenham sido descobertas em nichos celulares ou virais esporádicos fora do domínio bacteriano da vida, não há caso em que um NAD⁺-dependente está presente em um organismo eucariótico. A presença apenas em organismos não eucarióticos, especificidade de substrato única e estrutura de domínio distinta de NAD+ dependente em comparação com ligases de DNA humanas dependentes de ATP juntas tornam as ligases dependentes de NAD⁺ alvos ideais para o desenvolvimento de novos antibacterianos drogas.