Desnaturação (bioquímica)

Os efeitos da temperatura na atividade da enzima.
Topo: aumentar a temperatura aumenta a taxa de reação (coeficiente Q10).
Meio ambiente: a fração da enzima dobrada e funcional diminui acima de sua temperatura de desnaturação.
Fundo: consequentemente, a taxa ideal de reação de uma enzima está a uma temperatura intermediária.

Em bioquímica, desnaturação é um processo no qual proteínas ou ácidos nucléicos perdem a estrutura quaternária, estrutura terciária e estrutura secundária que está presente em seu estado nativo, por aplicação de algum estresse externo ou composto como um ácido ou base forte, um sal inorgânico concentrado, um solvente orgânico (por exemplo, álcool ou clorofórmio), agitação e radiação ou calor. Se as proteínas de uma célula viva forem desnaturadas, isso resultará na interrupção da atividade celular e possivelmente na morte celular. A desnaturação de proteínas também é consequência da morte celular. Proteínas desnaturadas podem exibir uma ampla gama de características, desde alteração conformacional e perda de solubilidade até agregação devido à exposição de grupos hidrofóbicos. A perda de solubilidade como resultado da desnaturação é chamada de coagulação. As proteínas desnaturadas perdem sua estrutura 3D e, portanto, não podem funcionar.

O dobramento de proteínas é a chave para saber se uma proteína globular ou de membrana pode fazer seu trabalho corretamente; ele deve ser dobrado na forma certa para funcionar. No entanto, as ligações de hidrogênio, que desempenham um papel importante no dobramento, são bastante fracas e, portanto, facilmente afetadas pelo calor, acidez, variações nas concentrações de sal e outros estressores que podem desnaturar a proteína. Esta é uma das razões pelas quais a homeostase é fisiologicamente necessária em muitas formas de vida.

Este conceito não tem relação com o álcool desnaturado, que é o álcool que foi misturado com aditivos para torná-lo impróprio para consumo humano.

Exemplos comuns

A proteína álbum no ovo branco sofre desnaturação e perda de solubilidade quando o ovo é cozido. (Bottom) Paperclips fornecem uma analogia visual para ajudar na conceituação do processo de desnaturação.

Quando os alimentos são cozinhados, algumas das suas proteínas tornam-se desnaturadas. É por isso que os ovos cozidos ficam duros e a carne cozida fica firme.

Um exemplo clássico de desnaturação em proteínas vem da clara do ovo, que geralmente são basicamente albuminas de ovo em água. Fresco dos ovos, as claras são transparentes e líquidas. Cozinhar as claras termicamente instáveis torna-as opacas, formando uma massa sólida interligada. A mesma transformação pode ser realizada com um produto químico desnaturante. Despejar as claras em um béquer com acetona também as tornará translúcidas e sólidas. A pele que se forma no leite coalhado é outro exemplo comum de proteína desnaturada. O aperitivo frio conhecido como ceviche é preparado por "cozimento" peixe cru e marisco numa marinada ácida de citrinos, sem calor.

Desnaturação de proteínas

As proteínas desnaturadas podem exibir uma ampla gama de características, desde a perda de solubilidade até a agregação de proteínas.

As proteínas funcionais têm quatro níveis de organização estrutural:

1. Estrutura primária: a estrutura linear de aminoácidos na cadeia de polipeptídeos
2. Estrutura secundária: ligações de hidrogênio entre cadeias de grupo peptídeo em uma folha alfa helix ou beta
3. Estrutura terciária: estrutura tridimensional de hélices alfa e hélices beta dobradas
4. Estrutura quaternária: estrutura tridimensional de polipeptídeos múltiplos e como eles se encaixam juntos

Processo de desnaturação:

1. Proteína funcional mostrando uma estrutura quaternária
2. Quando o calor é aplicado altera as ligações intramoleculares da proteína
3. Desdobramento dos polipeptídeos (aminoácidos)

Fundo

Proteínas ou polipeptídeos são polímeros de aminoácidos. Uma proteína é criada por ribossomos que "leem" RNA que é codificado por códons no gene e monta a combinação de aminoácidos necessária a partir da instrução genética, em um processo conhecido como tradução. A cadeia de proteína recém-criada então sofre modificação pós-traducional, na qual são adicionados átomos ou moléculas adicionais, por exemplo, cobre, zinco ou ferro. Uma vez concluído esse processo de modificação pós-traducional, a proteína começa a se dobrar (às vezes espontaneamente e às vezes com assistência enzimática), enrolando-se sobre si mesma de modo que os elementos hidrofóbicos da proteína sejam enterrados profundamente no interior da estrutura e os elementos hidrofílicos terminem na estrutura. fora. A forma final de uma proteína determina como ela interage com seu ambiente.

O dobramento de proteínas consiste em um equilíbrio entre uma quantidade substancial de interações intramoleculares fracas dentro de uma proteína (interações hidrofóbicas, eletrostáticas e de Van Der Waals) e interações proteína-solvente. Como resultado, esse processo depende muito do estado ambiental em que a proteína reside. Essas condições ambientais incluem, entre outras, temperatura, salinidade, pressão e os solventes envolvidos. Consequentemente, qualquer exposição a estresses extremos (por exemplo, calor ou radiação, altas concentrações de sais inorgânicos, ácidos e bases fortes) pode interromper a interação de uma proteína e inevitavelmente levar à desnaturação.

Quando uma proteína é desnaturada, as estruturas secundárias e terciárias são alteradas, mas as ligações peptídicas da estrutura primária entre os aminoácidos permanecem intactas. Como todos os níveis estruturais da proteína determinam sua função, a proteína não pode mais desempenhar sua função depois de desnaturada. Isso contrasta com as proteínas intrinsecamente não estruturadas, que são desdobradas em seu estado nativo, mas ainda funcionalmente ativas e tendem a se dobrar ao se ligarem ao seu alvo biológico.

Como a desnaturação ocorre nos níveis da estrutura da proteína

• Em estrutura quaternária desnaturação, subunidades proteicas são dissociadas e/ou o arranjo espacial das subunidades proteicas é interrompido.
• Estrutura terciária a desnaturação envolve a ruptura de:
  • Interações covalentes entre cadeias laterais de aminoácidos (como pontes desulfeto entre grupos de cisteína)
  • Interações dipole-dipole não covalentes entre as cadeias laterais do aminoácido polar (e o solvente circundante)
  • Van der Waals (dipolo induzido) interações entre as cadeias laterais de aminoácidos não polares.
• Em estrutura secundária desnaturação, as proteínas perdem todos os padrões repetitivos regulares, como alfa-helices e folhas beta-pleated, e adotam uma configuração de bobina aleatória.
• Estrutura primária, como a seqüência de aminoácidos mantidos em conjunto por ligações peptídicas covalentes, não é interrompida pela desnaturação.

Perda de função

A maioria dos substratos biológicos perde sua função biológica quando desnaturada. Por exemplo, as enzimas perdem sua atividade, porque os substratos não podem mais se ligar ao sítio ativo e porque os resíduos de aminoácidos envolvidos na estabilização dos substratos' estados de transição não estão mais posicionados para serem capazes de fazer isso. O processo de desnaturação e a perda de atividade associada podem ser medidos usando técnicas como interferometria de dupla polarização, CD, QCM-D e MP-SPR.

Perda de atividade devido a metais pesados e metaloides

Ao atingir as proteínas, os metais pesados são conhecidos por interromper a função e a atividade realizada pelas proteínas. É importante observar que os metais pesados se enquadram em categorias que consistem em metais de transição, bem como em uma quantidade selecionada de metalóides. Esses metais, ao interagir com proteínas nativas dobradas, tendem a desempenhar um papel na obstrução de sua atividade biológica. Essa interferência pode ser realizada de várias maneiras. Esses metais pesados podem formar um complexo com os grupos funcionais da cadeia lateral presentes em uma proteína ou formar ligações com tióis livres. Os metais pesados também desempenham um papel na oxidação das cadeias laterais de aminoácidos presentes nas proteínas. Junto com isso, ao interagir com metaloproteínas, os metais pesados podem deslocar e substituir os principais íons metálicos. Como resultado, os metais pesados podem interferir nas proteínas dobradas, o que pode impedir fortemente a estabilidade e a atividade das proteínas.

Reversibilidade e irreversibilidade

Em muitos casos, a desnaturação é reversível (as proteínas podem retornar ao seu estado original quando a influência desnaturante é removida). Este processo pode ser chamado de renaturação. Esse entendimento levou à noção de que todas as informações necessárias para as proteínas assumirem seu estado nativo estavam codificadas na estrutura primária da proteína e, portanto, no DNA que codifica a proteína, o chamado "Anfinsen' 39;hipótese termodinâmica".

A desnaturação também pode ser irreversível. Essa irreversibilidade é tipicamente uma irreversibilidade cinética, não termodinâmica, pois uma proteína dobrada geralmente tem energia livre menor do que quando é desdobrada. Através da irreversibilidade cinética, o fato de a proteína estar presa em um mínimo local pode impedi-la de se redobrar depois de ter sido irreversivelmente desnaturada.

Desnaturação de proteínas devido ao pH

A desnaturação também pode ser causada por mudanças no pH que podem afetar a química dos aminoácidos e seus resíduos. Os grupos ionizáveis em aminoácidos são capazes de se tornar ionizados quando ocorrem mudanças no pH. Uma mudança de pH para condições mais ácidas ou mais básicas pode induzir o desdobramento. O desdobramento induzido por ácido geralmente ocorre entre pH 2 e 5, o desdobramento induzido por base geralmente requer pH 10 ou superior.

Desnaturação de ácidos nucleicos

Os ácidos nucleicos (incluindo RNA e DNA) são polímeros de nucleotídeos sintetizados por enzimas polimerase durante a transcrição ou a replicação do DNA. Seguindo 5'-3' Na síntese do esqueleto, as bases nitrogenadas individuais são capazes de interagir umas com as outras por pontes de hidrogênio, permitindo assim a formação de estruturas de ordem superior. A desnaturação do ácido nucleico ocorre quando a ligação de hidrogênio entre os nucleotídeos é interrompida e resulta na separação de fitas previamente recozidas. Por exemplo, a desnaturação do DNA devido a altas temperaturas resulta na ruptura dos pares de bases e na separação da dupla hélice em duas fitas simples. As fitas de ácido nucleico são capazes de se recompor quando "normais" as condições são restauradas, mas se a restauração ocorrer muito rapidamente, as fitas de ácido nucléico podem se recompor de maneira imperfeita, resultando no emparelhamento inadequado de bases.

Desnaturação biologicamente induzida

A desnaturação de DNA ocorre quando as ligações de hidrogênio entre pares de base são perturbadas.

As interações não covalentes entre as fitas antiparalelas no DNA podem ser quebradas para "abrir" a dupla hélice quando mecanismos biologicamente importantes, como a replicação do DNA, a transcrição, o reparo do DNA ou a ligação a proteínas estão definidos para ocorrer. A área de DNA parcialmente separado é conhecida como bolha de desnaturação, que pode ser mais especificamente definida como a abertura de uma dupla hélice de DNA por meio da separação coordenada de pares de bases.

O primeiro modelo que tentou descrever a termodinâmica da bolha de desnaturação foi introduzido em 1966 e chamado de Modelo Poland-Scheraga. Este modelo descreve a desnaturação das fitas de DNA em função da temperatura. À medida que a temperatura aumenta, as ligações de hidrogênio entre os pares de bases são cada vez mais perturbadas e os "loops desnaturados" começam a se formar. No entanto, o Modelo Poland-Scheraga agora é considerado elementar porque não leva em conta as implicações confusas da sequência do DNA, composição química, rigidez e torção.

Estudos termodinâmicos recentes inferiram que o tempo de vida de uma bolha de desnaturação singular varia de 1 microssegundo a 1 milissegundo. Esta informação é baseada em escalas de tempo estabelecidas de replicação e transcrição do DNA. Atualmente, estudos de pesquisa biofísica e bioquímica estão sendo realizados para elucidar mais completamente os detalhes termodinâmicos da bolha de desnaturação.

Desnaturação por agentes químicos

A formamida desnatura o DNA interrompendo as ligações de hidrogênio entre pares de base. As linhas de laranja, azul, verde e roxo representam adenina, timina, guanina e citosina respectivamente. As três linhas pretas curtas entre as bases e as moléculas de formamida representam ligações de hidrogênio recém-formadas.

Com a reação em cadeia da polimerase (PCR) sendo um dos contextos mais populares em que a desnaturação do DNA é desejada, o aquecimento é o método de desnaturação mais frequente. Além da desnaturação pelo calor, os ácidos nucleicos podem passar pelo processo de desnaturação por meio de vários agentes químicos, como formamida, guanidina, salicilato de sódio, dimetil sulfóxido (DMSO), propilenoglicol e uréia. Esses agentes químicos desnaturantes reduzem a temperatura de fusão (T_m) competindo por doadores e aceitadores de ligações de hidrogênio com pares de bases nitrogenadas pré-existentes. Alguns agentes são até capazes de induzir a desnaturação à temperatura ambiente. Por exemplo, agentes alcalinos (por exemplo, NaOH) demonstraram desnaturar o DNA alterando o pH e removendo os prótons que contribuem com pontes de hidrogênio. Esses desnaturantes têm sido empregados para fazer gel de Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE), que promove a desnaturação de ácidos nucléicos para eliminar a influência da forma do ácido nucléico em sua mobilidade eletroforética.

Desnaturação química como alternativa

A atividade óptica (absorção e dispersão de luz) e as propriedades hidrodinâmicas (difusão translacional, coeficientes de sedimentação e tempos de correlação rotacional) dos ácidos nucleicos desnaturados com formamida são semelhantes aos dos ácidos nucleicos desnaturados pelo calor. Portanto, dependendo do efeito desejado, a desnaturação química do DNA pode fornecer um procedimento mais suave para a desnaturação de ácidos nucleicos do que a desnaturação induzida pelo calor. Estudos comparando diferentes métodos de desnaturação, como aquecimento, moinho de grânulos de diferentes tamanhos de grânulos, sonicação de sonda e desnaturação química, mostram que a desnaturação química pode fornecer uma desnaturação mais rápida em comparação com os outros métodos de desnaturação física descritos. Particularmente nos casos em que a renaturação rápida é desejada, os agentes químicos de desnaturação podem fornecer uma alternativa ideal ao aquecimento. Por exemplo, cadeias de DNA desnaturadas com agentes alcalinos, como NaOH, renaturam assim que o tampão fosfato é adicionado.

Desnaturação devido ao ar

Moléculas pequenas e eletronegativas, como nitrogênio e oxigênio, que são os gases primários do ar, afetam significativamente a capacidade das moléculas vizinhas de participar das ligações de hidrogênio. Essas moléculas competem com os aceptores de ligação de hidrogênio circundantes por doadores de ligação de hidrogênio, agindo, portanto, como "quebradores de ligação de hidrogênio" e enfraquecendo as interações entre as moléculas circundantes no ambiente. As fitas antiparalelas nas duplas hélices do DNA são ligadas não covalentemente por pontes de hidrogênio entre os pares de bases; nitrogênio e oxigênio, portanto, mantêm o potencial de enfraquecer a integridade do DNA quando exposto ao ar. Como resultado, os filamentos de DNA expostos ao ar requerem menos força para separar e exemplificam temperaturas de fusão mais baixas.

Aplicativos

Muitas técnicas de laboratório dependem da capacidade de separação dos filamentos de ácido nucleico. Ao compreender as propriedades da desnaturação do ácido nucleico, foram criados os seguintes métodos:

• PCR
• Blot sulista
• Blot do Norte
• Sequenciamento de DNA

Desnaturantes

Desnaturantes de proteínas

Ácidos

Os desnaturantes de proteínas ácidas incluem:

• Ácido acético
• Ácido trichloroacetic 12% na água
• Ácido sulfosalicida

Bases

As bases funcionam de forma semelhante aos ácidos na desnaturação. Eles incluem:

• Bicarbonato de sódio

Solventes

A maioria dos solventes orgânicos são desnaturantes, incluindo:

• Etanol

Reagentes de reticulação

Os agentes de reticulação para proteínas incluem:

• Formaldeído
• Glutaraldeído

Agentes caotrópicos

Os agentes caotrópicos incluem:

• Urea 6–8 mol/L
• Cloreto de Guanidinium 6 mol/L
• Perclorato de lítio 4.5 mol/L
• Sulfato de sódio dodecyl

Redutores de ligação dissulfeto

Agentes que quebram ligações dissulfeto por redução incluem:

• 2-Mercaptoetanol
• Dithiothreitol
• TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine)

Agentes quimicamente reativos

Agentes como peróxido de hidrogênio, cloro elementar, ácido hipocloroso (água clorada), bromo, água bromada, iodo, ácidos nítrico e oxidante e ozônio reagem com frações sensíveis, como sulfeto/tiol, anéis aromáticos ativados (fenilalanina) em efeito danifica a proteína e a torna inútil.

Outro

• Agrupamento mecânico
• Ácido pictórico
• Radiação
• Temperatura

Desnaturantes de ácidos nucleicos

Químico

Os desnaturantes de ácidos nucleicos ácidos incluem:

• Ácido acético
• HCl
• Ácido nítrico

Os desnaturantes básicos de ácido nucleico incluem:

• NaOH

Outros desnaturantes de ácidos nucleicos incluem:

• DMSO
• Formam
• Guanidina
• Salicila de sódio
• Propilene glicol
• Relações externas

Físico

• Desnaturação térmica
• moinho de contas
• Sonicação da sonda
• Radiação