Coloração de Gram

Uma mancha de grama de mistura Estatísticas (S. aureus ATCC 25923, cocci grama-positivo, em roxo) e Escherichia coli (E. coli ATCC 11775, bacilos gram-negativos, em vermelho), as bactérias de referência de mancha Gram mais comuns

Em microbiologia e bacteriologia, coloração de Gram (coloração de Gram ou método de Gram), é um método de coloração usado para classificam as espécies bacterianas em dois grandes grupos: bactérias gram-positivas e bactérias gram-negativas. O nome vem do bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram, que desenvolveu a técnica em 1884.

A coloração de Gram diferencia bactérias pelas propriedades químicas e físicas de suas paredes celulares. As células Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptidoglicano na parede celular que retém o corante primário, o cristal violeta. As células gram-negativas têm uma camada mais fina de peptidoglicano que permite que o cristal violeta seja lavado com a adição de etanol. Eles são corados de rosa ou vermelho pela contracoloração, geralmente safranina ou fucsina. A solução de iodo de Lugol é sempre adicionada após a adição do cristal violeta para fortalecer as ligações do corante com a membrana celular.

A coloração de Gram é quase sempre o primeiro passo na identificação de um grupo bacteriano. Embora a coloração de Gram seja uma valiosa ferramenta de diagnóstico em ambientes clínicos e de pesquisa, nem todas as bactérias podem ser definitivamente classificadas por esta técnica. Isso dá origem aos grupos gram-variable e gram-indeterminate.

História

O método recebeu o nome de seu inventor, o cientista dinamarquês Hans Christian Gram (1853–1938), que desenvolveu a técnica enquanto trabalhava com Carl Friedländer no necrotério do hospital municipal de Berlim em 1884. Gram desenvolveu sua técnica não para o objetivo de distinguir um tipo de bactéria de outro, mas para tornar as bactérias mais visíveis em seções coradas de tecido pulmonar. Ele publicou seu método em 1884 e incluiu em seu breve relatório a observação de que o bacilo do tifo não reteve a mancha.

Usos

mancha de grama Candidato albicans de uma cotonete vaginal. Os pequenos chlamydospores oval têm 2-4 μm de diâmetro.

A coloração de Gram é uma técnica laboratorial bacteriológica usada para diferenciar espécies bacterianas em dois grandes grupos (gram-positivos e gram-negativos) com base nas propriedades físicas de suas paredes celulares. A coloração de Gram não é usada para classificar archaea, anteriormente arqueobactérias, uma vez que esses microrganismos produzem respostas amplamente variadas que não seguem seus grupos filogenéticos.

Alguns organismos são gram-variáveis (o que significa que podem apresentar coloração negativa ou positiva); alguns não são corados com nenhum dos corantes usados na técnica de Gram e não são vistos. Em um laboratório moderno de microbiologia ambiental ou molecular, a maior parte da identificação é feita usando sequências genéticas e outras técnicas moleculares, que são muito mais específicas e informativas do que a coloração diferencial.

Médico

As colorações de Gram são realizadas em fluido corporal ou biópsia quando há suspeita de infecção. As colorações de Gram produzem resultados muito mais rapidamente do que a cultura e são especialmente importantes quando a infecção faria uma diferença importante no tratamento e prognóstico do paciente; exemplos são líquido cefalorraquidiano para meningite e líquido sinovial para artrite séptica.

Mecanismo de coloração

Gram-positivo (à esquerda) e gram-negativo manchado rosa (à direita)

As bactérias gram-positivas têm uma parede celular espessa semelhante a uma malha feita de peptidoglicano (50-90% do envelope celular) e, como resultado, são coradas de roxo pelo cristal violeta, enquanto as bactérias gram-negativas têm uma camada mais fina (10 % do envelope celular), portanto, não retêm a coloração roxa e são contra-corados em rosa pela safranina. Existem quatro etapas básicas da coloração de Gram:

• Aplicando uma mancha primária (violeta cristalina) a uma mancha aquecida de uma cultura bacteriana. A fixação de calor mata algumas bactérias, mas é usado principalmente para afixar as bactérias para o slide para que eles não enxaguam durante o procedimento de coloração.
• A adição de iodo, que se liga a violeta de cristal e prende-o na célula
• Descoloração rápida com etanol ou acetona
• Contadores de safranina. A fuchsina de carbol é às vezes substituída pela safranina, uma vez que mancha mais intensamente bactérias anaeróbias, mas é menos comumente usada como uma contrasente.

Cristal violeta (CV) dissocia-se em soluções aquosas em CV⁺
e cloreto ( Cl^-
). Esses íons penetram na parede celular de células gram-positivas e gram-negativas. O CV⁺
íon interage com componentes carregados negativamente de células bacterianas e mancha as células de roxo.

Iodeto (I⁻
ou I^-
₃ ) interage com CV⁺
e forma grandes complexos de cristal violeta e iodo (CV–I) dentro das camadas interna e externa da célula. O iodo é muitas vezes referido como um mordente, mas é um agente de captura que impede a remoção do complexo CV-I e, portanto, colore a célula.

Quando um descolorante como álcool ou acetona é adicionado, ele interage com os lipídios da membrana celular. Uma célula gram-negativa perde sua membrana lipopolissacarídica externa e a camada interna de peptidoglicano fica exposta. Os complexos CV-I são lavados da célula gram-negativa junto com a membrana externa. Em contraste, uma célula gram-positiva torna-se desidratada de um tratamento com etanol. Os grandes complexos CV-I ficam presos dentro da célula gram-positiva devido à natureza multicamada de seu peptidoglicano. A etapa de descoloração é crítica e deve ser cronometrada corretamente; a mancha cristal violeta é removida tanto das células gram-positivas quanto das negativas se o agente descolorante for deixado por muito tempo (em questão de segundos).

Após a descoloração, a célula gram-positiva permanece roxa e a célula gram-negativa perde sua cor roxa. O contraste, que geralmente é safranina carregada positivamente ou fucsina básica, é aplicado por último para dar às bactérias gram-negativas descoloridas uma cor rosa ou vermelha. Tanto as bactérias gram-positivas como as bactérias gram-negativas captam a contracoloração. A contracoloração, no entanto, não é vista em bactérias gram-positivas por causa da coloração violeta de cristal mais escura.

Exemplos

Bactérias Gram-positivas

Gram-stain de estreptococos Gram-positivos cercado por células de pus

As bactérias Gram-positivas geralmente têm uma única membrana (monoderme) cercada por um peptidoglicano espesso. Esta regra é seguida por dois filos: Bacillota (exceto as classes Mollicutes e Negativicutes) e Actinomycetota. Em contraste, os membros da Chloroflexota (bactérias verdes não sulfurosas) são monodermes, mas possuem um peptidoglicano fino ou ausente (classe Dehalococcoidetes) e podem apresentar coloração negativa, positiva ou indeterminada; membros do Deinococcota coram-se positivamente, mas são didermes com peptidoglicano espesso.

Historicamente, as formas gram-positivas compunham o filo Firmicutes, um nome agora usado para o maior grupo. Inclui muitos gêneros bem conhecidos, como Lactobacillus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus e Clostridium. Também foi expandido para incluir os Mollicutes, bactérias como Mycoplasma e Thermoplasma que não possuem paredes celulares e, portanto, não podem ser coradas com Gram, mas são derivadas de tais formas.

Algumas bactérias têm paredes celulares que são particularmente hábeis em reter manchas. Estas aparecerão positivas pela coloração de Gram, embora não estejam intimamente relacionadas com outras bactérias gram-positivas. Estas são chamadas de bactérias ácido-resistentes e só podem ser diferenciadas de outras bactérias gram-positivas por procedimentos especiais de coloração.

Bactérias Gram-negativas

As bactérias gram-negativas geralmente possuem uma fina camada de peptidoglicano entre duas membranas (diderm). O lipopolissacarídeo (LPS) é o antígeno mais abundante na superfície celular da maioria das bactérias gram-negativas, contribuindo com até 80% da membrana externa da E. coli e Salmonella. A maioria dos filos bacterianos são gram-negativos, incluindo as cianobactérias, as bactérias sulfurosas verdes e a maioria dos Pseudomonadota (com exceção de alguns membros das Rickettsiales e dos insetos endossimbiontes das Enterobacteriales).

Bactérias gram-variáveis e gram-indeterminadas

Algumas bactérias, após a coloração com a coloração de Gram, produzem um padrão gram-variável: uma mistura de células rosa e roxas é vista. Em culturas de Bacillus, Butyrivibrio e Clostridium, uma diminuição na espessura do peptidoglicano durante o crescimento coincide com um aumento no número de células que se coram gram-negativas. Além disso, em todas as bactérias coradas com a coloração de Gram, a idade da cultura pode influenciar os resultados da coloração.

As bactérias Gram-indeterminadas não respondem previsivelmente à coloração de Gram e, portanto, não podem ser determinadas como gram-positivas ou gram-negativas. Exemplos incluem muitas espécies de Mycobacterium, incluindo Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae e Mycobacterium tuberculosis, os dois últimos dos quais são os agentes causadores da hanseníase e da tuberculose, respectivamente. As bactérias do gênero Mycoplasma não possuem uma parede celular ao redor de suas membranas celulares, o que significa que elas não se coram pelo método de Gram e são resistentes aos antibióticos que visam a síntese da parede celular.

Nota ortográfica

O termo coloração de Gram é derivado do sobrenome de Hans Christian Gram; o epônimo (Gram) é, portanto, capitalizado, mas não o substantivo comum (mancha), como é usual para termos científicos. As letras iniciais de gram-positivo e gram-negativo, que são adjetivos homônimos, podem ser G maiúsculo ou g< minúsculo /i>, dependendo de qual guia de estilo (se houver) rege o documento que está sendo escrito. O estilo de letras minúsculas é usado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA e outros regimes de estilo, como o estilo AMA. Os dicionários podem usar letras minúsculas, maiúsculas ou ambas. O uso de Gram-positivo ou Gram-negativo em letras maiúsculas também é comum em muitos artigos e publicações de periódicos científicos. Quando os artigos são submetidos a periódicos, cada periódico pode ou não aplicar o estilo interno à versão postprint. As versões de pré-impressão contêm qualquer estilo que o autor tenha usado. Mesmo regimes de estilo que usam letras minúsculas para os adjetivos gram-positivo e gram-negativo ainda usam letras maiúsculas para mancha de Gram.