Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis (ou Bt) é uma bactéria gram-positiva que vive no solo, o pesticida biológico mais comumente usado em todo o mundo. B. thuringiensis também ocorre naturalmente no intestino de lagartas de vários tipos de mariposas e borboletas, bem como na superfície das folhas, ambientes aquáticos, fezes de animais, ambientes ricos em insetos e moinhos de farinha e instalações de armazenamento de grãos. Também foi observado parasitar outras mariposas, como Cadra calidella—em experimentos de laboratório trabalhando com C. calidella, muitas das mariposas estavam doentes devido a este parasita.
Durante a esporulação, muitas cepas de Bt produzem proteínas cristalinas (inclusões proteicas), denominadas endotoxinas delta, que possuem ação inseticida. Isso levou ao seu uso como inseticidas e, mais recentemente, a cultivos geneticamente modificados usando genes Bt, como o milho Bt. Muitas cepas de Bt produtoras de cristais, porém, não possuem propriedades inseticidas. A subespécie israelensis é comumente usada para controle de mosquitos e de mosquitos-fungos.
Como um mecanismo tóxico, as proteínas cry se ligam a receptores específicos nas membranas das células do intestino médio (epiteliais) das pragas visadas, resultando em sua ruptura. Outros organismos (incluindo humanos, outros animais e insetos não-alvo) que não possuem os receptores apropriados em seus intestinos não podem ser afetados pela proteína cry e, portanto, não são afetados pelo Bt.
Taxonomia e descoberta
Em 1902, B. thuringiensis foi descoberto pela primeira vez em bichos-da-seda pelo engenheiro sericultor japonês Ishiwatari Shigetane (石渡 繁 胤). Ele o nomeou B. sotto, usando a palavra japonesa sottō (卒倒, 'colapso'), referindo-se aqui à paralisia bacilar. Em 1911, o microbiologista alemão Ernst Berliner a redescobriu ao isolá-la como a causa de uma doença chamada Schlaffsucht em lagartas da traça da farinha na Turíngia (daí o nome específico thuringiensis, "Thuringian"). B. sotto mais tarde seria reatribuído como B. thuringiensis var. sotto.
Em 1976, Robert A. Zakharyan relatou a presença de um plasmídeo em uma cepa de B. thuringiensis e sugeriu o envolvimento do plasmídeo na formação de endosporos e cristais. B. thuringiensis está intimamente relacionado com B. cereus, uma bactéria do solo, e B. anthracis, a causa do antraz; os três organismos diferem principalmente em seus plasmídeos. Como outros membros do gênero, todos os três são capazes de produzir endosporos.
Colocação do grupo de espécies
B. thuringiensis é colocado no grupo Bacillus cereus que é definido como: sete espécies estreitamente relacionadas: B. cereus sensu stricto (B. cereus), B. anthracis, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides e B. citotóxico; ou como seis espécies em um Bacillus cereus sensu lato: B. weihenstephanensis, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. cereus, B. thuringiensis e B. antracis. Dentro deste grupo B.t. está mais relacionado com B.ce. Está mais distantemente relacionado com B.w., B.m., B.p. e B.cy.
Subespécie
Existem várias dezenas de subespécies reconhecidas de B. thuringiensis. Subespécies comumente usadas como inseticidas incluem B. thuringiensis subespécie kurstaki (Btk), subespécie israelensis (Bti) e subespécie aizawai (Bta). Algumas linhagens de Bti são clonais.
Genética
Algumas cepas são conhecidas por carregar os mesmos genes que produzem enterotoxinas em B. cereus, e assim é possível que todo o B. cereus sensu lato podem ter o potencial de serem enteropatógenos.
As proteínas que B. thuringiensis é mais conhecido por serem codificados por genes cry. Na maioria das cepas de B. thuringiensis, esses genes estão localizados em um plasmídeo (em outras palavras, cry não é um gene cromossômico na maioria das cepas). Se estes plasmídeos forem perdidos, torna-se indistinguível de B. cereus como B. thuringiensis não possui outras características de espécie. A troca de plasmídeos foi observada naturalmente e experimentalmente dentro de B.t. e entre B.t. e dois congêneres, B. cereus e B. mycoides.
plcR é um regulador de transcrição indispensável da maioria dos fatores de virulência, sua ausência reduz muito a virulência e a toxicidade. Algumas cepas completam naturalmente seu ciclo de vida com um plcR inativado. É metade de um operon de dois genes junto com o heptapeptídeo papR. papR faz parte da detecção de quorum em B. thuringiensis.
Várias cepas, incluindo Btk ATCC 33679, carregam plasmídeos pertencentes à família pXO1-like mais ampla. (A família pXO1 sendo uma família comum B. cereus com membros de ≈330kb de comprimento. Eles diferem de pXO1 pela substituição da ilha de patogenicidade pXO1.) O parasita de inseto Btk HD73 carrega um plasmídeo semelhante a pXO2 (pBT9727) sem a ilha de patogenicidade de 35 kb do próprio pXO2 e, de fato, sem fatores de virulência identificáveis. (A família pXO2 não tem substituição da ilha de patogenicidade, apenas falta essa parte do pXO2.)
Os genomas do B. cereus pode conter dois tipos de íntrons, denominados grupo I e grupo II. As cepas B.t têm variadamente 0-5 grupos Is e 0-13 grupos IIs.
Ainda não há informações suficientes para determinar se a coevolução cromossomo-plasmídeo para permitir a adaptação a nichos ambientais específicos ocorreu ou é mesmo possível.
Comum com B. cereus, mas até agora não encontrados em outros lugares - incluindo em outros membros do grupo de espécies - são a bomba de efluxo BC3663, a N-acil-L-aminoácido amidohidrolase BC3664 e a proteína de quimiotaxia aceitadora de metil BC5034.
Proteoma
Tem diversidade de proteoma semelhante ao parente próximo B. cereus.
Mecanismo de ação inseticida
Após a esporulação, B. thuringiensis forma cristais de dois tipos de endotoxinas delta inseticidas proteicas (δ-endotoxinas) chamadas proteínas cristalinas ou proteínas Cry, que são codificadas por genes cry e proteínas Cyt.
As toxinas Cry têm atividades específicas contra espécies de insetos das ordens Lepidoptera (mariposas e borboletas), Diptera (moscas e mosquitos), Coleoptera (besouros) e Hymenoptera (vespas, abelhas, formigas e moscas), bem como contra nematóides. Assim, B. thuringiensis serve como um importante reservatório de toxinas Cry para a produção de inseticidas biológicos e culturas geneticamente modificadas resistentes a insetos. Quando os insetos ingerem cristais de toxina, seus tratos digestivos alcalinos desnaturam os cristais insolúveis, tornando-os solúveis e, portanto, passíveis de serem cortados com proteases encontradas no intestino do inseto, que liberam a toxina do cristal. A toxina Cry é então inserida na membrana celular do intestino do inseto, paralisando o trato digestivo e formando um poro. O inseto para de comer e morre de fome; bactérias Bt vivas também podem colonizar o inseto, o que pode contribuir para a morte. A morte ocorre dentro de algumas horas ou semanas. As bactérias do intestino médio de larvas suscetíveis podem ser necessárias para B. thuringiensis atividade inseticida.
A B. thuringiensis pequeno RNA chamado BtsR1 pode silenciar a expressão da toxina Cry5Ba quando fora do hospedeiro, ligando-se ao sítio RBS da transcrição da toxina Cry5Ba para evitar as defesas comportamentais do nematóide. O silenciamento resulta em aumento da ingestão de bactérias por C. elegantes. A expressão de BtsR1 é então reduzida após a ingestão, resultando na produção da toxina Cry5Ba e na morte do hospedeiro.
Em 1996, outra classe de proteínas inseticidas em Bt foi descoberta: as proteínas inseticidas vegetativas (Vip; InterPro: IPR022180). As proteínas Vip não compartilham homologia de sequência com as proteínas Cry, em geral não competem pelos mesmos receptores e algumas matam insetos diferentes das proteínas Cry.
Em 2000, um novo subgrupo de proteína Cry, designado por parasporina, foi descoberto a partir de não inseticida B. thuringiensis isolados. As proteínas do grupo das parasporinas são definidas como B. thuringiensis e proteínas parasporais bacterianas relacionadas que não são hemolíticas, mas capazes de matar preferencialmente células cancerígenas. Em janeiro de 2013, as parasporinas compreendem seis subfamílias: PS1 a PS6.
Uso de esporos e proteínas no controle de pragas
Esporos e proteínas inseticidas cristalinas produzidas por B. thuringiensis têm sido usados para controlar pragas de insetos desde a década de 1920 e são frequentemente aplicados como sprays líquidos. Eles agora são usados como inseticidas específicos sob nomes comerciais como DiPel e Thuricide. Devido à sua especificidade, esses pesticidas são considerados ecologicamente corretos, com pouco ou nenhum efeito sobre os seres humanos, animais selvagens, polinizadores e a maioria dos outros insetos benéficos, e são usados na agricultura orgânica; no entanto, os manuais para esses produtos contêm muitos avisos ambientais e de saúde humana, e uma revisão por pares regulatória europeia de 2012 de cinco cepas aprovadas encontradas, embora existam dados para apoiar algumas alegações de baixa toxicidade para os seres humanos e o meio ambiente, os dados são insuficientes para justificar muitas dessas afirmações.
Novas cepas de Bt são desenvolvidas e introduzidas ao longo do tempo, à medida que os insetos desenvolvem resistência ao Bt, ou ocorre o desejo de forçar mutações para modificar as características do organismo, ou usar engenharia genética recombinante homóloga para melhorar o tamanho do cristal e aumentar a atividade pesticida, ou ampliar a gama de hospedeiros de Bt e obter formulações mais eficazes. Cada nova cepa recebe um número único e é registrada na EPA dos EUA, e permissões podem ser concedidas para modificação genética, dependendo de "suas cepas parentais, o padrão de uso de pesticidas proposto e a maneira e a extensão em que o organismo foi geneticamente modificado". modificado". As formulações de Bt que são aprovadas para agricultura orgânica nos EUA estão listadas no site do Organic Materials Review Institute (OMRI) e vários sites de extensão universitária oferecem conselhos sobre como usar esporos de Bt ou preparações de proteína na agricultura orgânica.
Uso de genes Bt na engenharia genética de plantas para controle de pragas
A empresa belga Plant Genetic Systems (agora parte da Bayer CropScience) foi a primeira empresa (em 1985) a desenvolver culturas geneticamente modificadas (tabaco) com tolerância a insetos, expressando genes cry de B. thuringiensis; as colheitas resultantes contêm endotoxina delta. O tabaco Bt nunca foi comercializado; as plantas de tabaco são usadas para testar modificações genéticas, pois são fáceis de manipular geneticamente e não fazem parte da alimentação.
Uso
Em 1985, plantas de batata produzindo a toxina CRY 3A Bt foram aprovados como seguros pela Agência de Proteção Ambiental, tornando-se a primeira cultura produtora de pesticidas modificada pelo homem a ser aprovada nos EUA, embora muitas plantas produzam pesticidas naturalmente, incluindo tabaco, pés de café, cacau, algodão e nogueira preta. Esta foi a 'Nova Folha' batata, e foi retirado do mercado em 2001 por falta de interesse.
Em 1996, modificou geneticamente milho produtor de proteína Bt Cry foi aprovado, que matou a broca européia do milho e espécies relacionadas; foram introduzidos genes Bt subsequentes que mataram as larvas da lagarta da raiz do milho.
Os genes Bt modificados em culturas e aprovados para liberação incluem, isoladamente e empilhados: Cry1A.105, CryIAb, CryIF, Cry2Ab, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, mCry3A e VIP, e as culturas modificadas incluem milho e algodão.
O milho geneticamente modificado para produzir VIP foi aprovado pela primeira vez nos EUA em 2010.
Na Índia, até 2014, mais de sete milhões de produtores de algodão, ocupando vinte e seis milhões de acres, adotaram Algodão Bt.
A Monsanto desenvolveu uma soja expressando Cry1Ac e o glifosato -gene de resistência para o mercado brasileiro, que concluiu o processo regulatório brasileiro em 2010.
Bt aspen - especificamente híbridos Populus - foram desenvolvidos. Eles sofrem menos danos nas folhas devido à herbivoria de insetos. No entanto, os resultados não foram totalmente positivos: o resultado pretendido - melhor rendimento de madeira - não foi alcançado, sem vantagem de crescimento, apesar da redução dos danos causados por herbívoros; uma de suas principais pragas ainda ataca as árvores transgênicas; além disso, sua serapilheira se decompõe de forma diferente devido às toxinas transgênicas, resultando em alterações nas populações de insetos aquáticos próximos.
Estudos de segurança
O uso de toxinas Bt como protetores incorporados a plantas levou à necessidade de uma avaliação extensiva de sua segurança para uso em alimentos e potenciais impactos não intencionais no meio ambiente.
Avaliação de risco alimentar
As preocupações com a segurança do consumo de materiais vegetais geneticamente modificados que contêm proteínas Cry foram abordadas em extensos estudos de avaliação de risco dietético. Como um mecanismo tóxico, as proteínas cry se ligam a receptores específicos nas membranas das células do intestino médio (epiteliais) das pragas visadas, resultando em sua ruptura. Enquanto as pragas-alvo são expostas às toxinas principalmente por meio de material de folhas e caules, as proteínas Cry também são expressas em outras partes da planta, incluindo vestígios em grãos de milho que são consumidos por humanos e animais. No entanto, outros organismos (incluindo humanos, outros animais e insetos não-alvo) que não possuem os receptores apropriados em seus intestinos não podem ser afetados pela proteína cry e, portanto, não são afetados pelo Bt.
Estudos toxicológicos
Modelos animais têm sido usados para avaliar o risco à saúde humana decorrente do consumo de produtos contendo proteínas Cry. A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos reconhece estudos de alimentação oral aguda em camundongos em que doses de até 5.000 mg/kg de peso corporal não resultaram em efeitos adversos observados. Pesquisas sobre outras proteínas tóxicas conhecidas sugerem que a toxicidade ocorre em doses muito mais baixas, sugerindo ainda que as toxinas Bt não são tóxicas para os mamíferos. Os resultados dos estudos toxicológicos são reforçados pela falta de toxicidade observada em décadas de uso de B. thuringiensis e suas proteínas cristalinas como um spray inseticida.
Estudos de alergenicidade
A introdução de uma nova proteína levantou preocupações sobre o potencial de respostas alérgicas em indivíduos sensíveis. A análise bioinformática de alérgenos conhecidos indicou que não há preocupação com reações alérgicas como resultado do consumo de toxinas Bt. Além disso, o teste cutâneo por picada usando proteína Bt purificada não resultou em produção detectável de anticorpos IgE específicos para toxina, mesmo em pacientes atópicos.
Estudos de digestibilidade
Estudos foram conduzidos para avaliar o destino das toxinas Bt que são ingeridas nos alimentos. Foi demonstrado que as proteínas da toxina Bt digerem minutos após a exposição a fluidos gástricos simulados. A instabilidade das proteínas nos fluidos digestivos é uma indicação adicional de que é improvável que as proteínas Cry sejam alergênicas, uma vez que a maioria dos alérgenos alimentares conhecidos resiste à degradação e são finalmente absorvidos no intestino delgado.
Avaliação de risco ecológico
A avaliação de risco ecológico visa garantir que não haja impacto não intencional em organismos não visados e nenhuma contaminação de recursos naturais como resultado do uso de uma nova substância, como o uso de Bt em culturas geneticamente modificadas. O impacto das toxinas Bt nos ambientes onde as plantas transgênicas são cultivadas foi avaliado para garantir que não haja efeitos adversos fora das pragas-alvo das culturas.
Persistência no ambiente
Preocupações sobre o possível impacto ambiental do acúmulo de toxinas Bt nos tecidos das plantas, dispersão do pólen e secreção direta das raízes foram investigadas. As toxinas Bt podem persistir no solo por mais de 200 dias, com meias-vidas entre 1,6 e 22 dias. Grande parte da toxina é inicialmente degradada rapidamente por microorganismos no ambiente, enquanto parte é adsorvida por matéria orgânica e persiste por mais tempo. Alguns estudos, ao contrário, afirmam que as toxinas não persistem no solo. As toxinas Bt são menos propensas a se acumular em corpos d'água, mas o derramamento de pólen ou o escoamento do solo podem depositá-los em um ecossistema aquático. Espécies de peixes não são suscetíveis a toxinas Bt se expostas.
Impacto em organismos não visados
A natureza tóxica das proteínas Bt tem um impacto adverso em muitas das principais pragas das culturas, mas avaliações de risco ecológico foram realizadas para garantir a segurança de organismos benéficos não-alvo que podem entrar em contato com as toxinas. Preocupações generalizadas sobre toxicidade em lepidópteros não-alvo, como a borboleta monarca, foram refutadas por meio da caracterização adequada da exposição, onde foi determinado que organismos não-alvo não são expostos a quantidades suficientes de toxinas Bt para ter um efeito adverso sobre a população. Organismos que vivem no solo, potencialmente expostos a toxinas Bt através de exsudatos radiculares, não são afetados pelo crescimento de culturas Bt.
Resistência a insetos
Vários insetos desenvolveram resistência a B. thuringiensis. Em novembro de 2009, cientistas da Monsanto descobriram que a lagarta rosada do algodão havia se tornado resistente à primeira geração do algodão Bt em partes de Gujarat, Índia - essa geração expressa um gene Bt, Cry1Ac. Este foi o primeiro caso de resistência ao Bt confirmado pela Monsanto em qualquer lugar do mundo. A Monsanto respondeu introduzindo um algodão de segunda geração com múltiplas proteínas Bt, que foi rapidamente adotado. A resistência da lagarta ao algodão Bt de primeira geração também foi identificada na Austrália, China, Espanha e Estados Unidos. Além disso, a resistência ao Bt foi documentada na população de campo da traça-das-crucíferas no Havaí, nos Estados Unidos continental e na Ásia. Estudos na lagarta falsa-medideira sugeriram que uma mutação no transportador de membrana ABCC2 pode conferir resistência ao Bt Cry1Ac.
Pragas secundárias
Vários estudos documentaram surtos de "pragas sugadoras" (que não são afetados pelas toxinas Bt) dentro de alguns anos após a adoção do algodão Bt. Na China, o principal problema tem sido com os mirídeos, que em alguns casos “estragaram completamente todos os benefícios do cultivo do algodão Bt”. O aumento de pragas sugadoras dependeu da temperatura local e das condições pluviométricas e aumentou em metade das aldeias estudadas. O aumento no uso de inseticidas para o controle desses insetos secundários foi muito menor do que a redução no uso total de inseticidas devido à adoção do algodão Bt. Outro estudo em cinco províncias da China constatou que a redução no uso de pesticidas em cultivares de algodão Bt é significativamente menor do que a relatada em pesquisas em outros lugares, consistente com a hipótese sugerida por estudos recentes de que mais pulverizações de pesticidas são necessárias ao longo do tempo para controlar pragas secundárias emergentes, como como pulgões, ácaros e insetos lygus.
Problemas semelhantes foram relatados na Índia, com cochonilhas e pulgões, embora uma pesquisa em pequenas fazendas indianas entre 2002 e 2008 tenha concluído que a adoção do algodão Bt levou a maiores rendimentos e menor uso de pesticidas, diminuindo com o tempo.
Controvérsias
As controvérsias em torno do uso de Bt estão entre as muitas controvérsias sobre alimentos geneticamente modificados mais amplamente.
Toxicidade de lepidópteros
O problema mais divulgado associado às culturas Bt é a alegação de que o pólen do milho Bt poderia matar a borboleta-monarca. O jornal produziu alvoroço público e manifestações contra o milho Bt; no entanto, em 2001, vários estudos de acompanhamento coordenados pelo USDA afirmaram que "os tipos mais comuns de pólen de milho Bt não são tóxicos para larvas de monarca em concentrações que os insetos encontrariam nos campos." Da mesma forma, B. thuringiensis tem sido amplamente utilizado para controlar o crescimento de larvas de Spodoptera littoralis devido às suas atividades de pragas prejudiciais na África e no sul da Europa. No entanto, S. littoralis apresentou resistência a muitas cepas de B. thuriginesis e foram efetivamente controlados apenas por algumas cepas.
Mistura genética de milho selvagem
Um estudo publicado na Nature em 2001 relatou que genes de milho contendo Bt foram encontrados no milho em seu centro de origem, Oaxaca, México. Outro artigo da Nature publicado em 2002 afirmou que a conclusão do artigo anterior foi o resultado de um artefato causado por uma reação em cadeia da polimerase inversa e que "as evidências disponíveis não são suficientes para justificar a publicação do artigo original." Uma controvérsia significativa aconteceu sobre o jornal e o aviso sem precedentes da Nature'.
Um estudo subsequente em larga escala em 2005 não conseguiu encontrar nenhuma evidência de mistura genética em Oaxaca. Um estudo de 2007 descobriu que as "proteínas transgênicas expressas no milho foram encontradas em duas (0,96%) das 208 amostras de agricultores' campos, localizados em dois (8%) das 25 comunidades amostradas." O México importa uma quantidade substancial de milho dos EUA e, devido às redes de sementes formais e informais entre os agricultores rurais, muitas rotas potenciais estão disponíveis para o milho transgênico entrar nas teias alimentares. Um estudo descobriu a introdução em pequena escala (cerca de 1%) de sequências transgênicas em campos amostrados no México; não encontrou evidências a favor ou contra o fato de o material genético introduzido ser herdado pela próxima geração de plantas. Esse estudo foi imediatamente criticado, com o revisor escrevendo: "Geneticamente, qualquer planta deve ser não transgênica ou transgênica, portanto, para o tecido foliar de uma única planta transgênica, um nível de OGM próximo a 100% é esperado. Em seu estudo, os autores optaram por classificar as amostras de folhas como transgênicas, apesar dos níveis de OGM de cerca de 0,1%. Afirmamos que resultados como esses são interpretados incorretamente como positivos e são mais prováveis de serem indicativos de contaminação no laboratório."
Transtorno do colapso das colônias
A partir de 2007, um novo fenômeno chamado distúrbio do colapso da colônia (CCD) começou a afetar as colmeias de abelhas em toda a América do Norte. A especulação inicial sobre as possíveis causas incluía novos parasitas, uso de pesticidas e o uso de culturas transgênicas Bt. O Mid-Atlantic Apicultura Research and Extension Consortium não encontrou evidências de que o pólen das culturas Bt esteja afetando adversamente as abelhas. De acordo com o USDA, “Culturas geneticamente modificadas (GM), mais comumente milho Bt, têm sido apontadas como a causa do CCD. Mas não há correlação entre onde as culturas GM são plantadas e o padrão de incidentes de CCD. Além disso, as culturas GM têm sido amplamente plantadas desde o final dos anos 1990, mas o CCD não apareceu até 2006. Além disso, o CCD foi relatado em países que não permitem o plantio de culturas GM, como a Suíça. Pesquisadores alemães observaram em um estudo uma possível correlação entre a exposição ao pólen Bt e a imunidade comprometida a Nosema." A causa real do CCD era desconhecida em 2007, e os cientistas acreditam que pode ter várias causas de exacerbação.
Beta-exotoxinas
Alguns isolados de B. thuringiensis produzem uma classe de pequenas moléculas inseticidas chamadas beta-exotoxinas, cujo nome comum é turingiensina. Um documento de consenso produzido pela OCDE diz: "Beta-exotoxinas são conhecidas por serem tóxicas para humanos e quase todas as outras formas de vida e sua presença é proibida em B. thuringiensis produtos microbianos". Turingiensinas são análogos de nucleosídeos. Eles inibem a atividade da RNA polimerase, um processo comum a todas as formas de vida, tanto em ratos quanto em bactérias.
Outros hosts
Patógeno oportunista de outros animais que não insetos, causando necrose, infecção pulmonar e/ou intoxicação alimentar. Quão comum isso é, é desconhecido, porque estes são sempre considerados B. cereus e raramente são testados para as proteínas Cry e Cyt que são o único fator que distingue B. thuringiensis de B. cereus.
Nova nomenclatura para proteínas pesticidas (toxinas Bt)
Bacillus thuringiensis não é mais a única fonte de proteínas pesticidas. O Bacterial Pesticidal Protein Resource Center (BPPRC) fornece informações sobre o campo em rápida expansão de proteínas pesticidas para acadêmicos, reguladores e pessoal de pesquisa e desenvolvimento