Agarose
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usado para eletroforese de gel
Agarose é um heteropolissacarídeo, geralmente extraído de certas algas vermelhas. É um polímero linear formado pela unidade repetitiva da agarobiose, que é um dissacarídeo formado por D-galactose e 3,6-anidro-L-galactopiranose. A agarose é um dos dois componentes principais do agar e é purificada do agar pela remoção do outro componente do agar, agaropectina.
A agarose é freqüentemente usada em biologia molecular para a separação de grandes moléculas, especialmente DNA, por eletroforese. Placas de géis de agarose (geralmente 0,7 - 2%) para eletroforese são prontamente preparadas despejando a solução líquida quente em um molde. Uma vasta gama de diferentes agaroses de vários pesos moleculares e propriedades estão comercialmente disponíveis para esta finalidade. A agarose também pode ser transformada em grânulos e usada em vários métodos cromatográficos para purificação de proteínas.
Estrutura
Agarose é um polímero linear com um peso molecular de cerca de 120.000, consistindo em D-galactose alternada e 3,6-anidro-L-galactopiranose ligados por α- (1→3) e β-(1→4) ligações glicosídicas. A 3,6-anidro-L-galactopiranose é uma L-galactose com uma ponte anidra entre as posições 3 e 6, embora alguns L -unidades de galactose no polímero podem não conter a ponte. Algumas unidades de D-galactose e L-galactose podem ser metiladas, e piruvato e sulfato também são encontrados em pequenas quantidades.
Cada cadeia de agarose contém ~800 moléculas de galactose, e as cadeias de polímero de agarose formam fibras helicoidais que se agregam em uma estrutura superenrolada com um raio de 20-30 nm. As fibras são quase rígidas e têm uma ampla faixa de comprimento, dependendo da concentração de agarose. Quando solidificadas, as fibras formam uma malha tridimensional de canais de diâmetro variando de 50 nm a >200 nm, dependendo da concentração de agarose usada - concentrações mais altas produzem diâmetros médios de poros mais baixos. A estrutura 3-D é mantida unida por pontes de hidrogênio e pode, portanto, ser interrompida pelo aquecimento de volta ao estado líquido.
Propriedades
A agarose está disponível como um pó branco que se dissolve em água quase fervente e forma um gel quando esfria. A agarose exibe o fenômeno de histerese térmica em sua transição líquido para gel, ou seja, gelifica e funde em diferentes temperaturas. As temperaturas de gelificação e fusão variam dependendo do tipo de agarose. As agaroses padrão derivadas de Gelidium têm uma temperatura de gelificação de 34–38 °C (93–100 °F) e uma temperatura de fusão de 90–95 °C (194–203 °F), enquanto as derivadas de Gracilaria, devido aos seus substituintes metoxi superiores, tem uma temperatura de gelificação de 40–52 °C (104–126 °F) e temperatura de fusão de 85–90 °C (185–194 °F). As temperaturas de fusão e gelificação podem depender da concentração do gel, particularmente em baixas concentrações de gel de menos de 1%. As temperaturas de gelificação e fusão são, portanto, dadas a uma concentração de agarose especificada.
A agarose natural contém grupos metil não carregados e a extensão da metilação é diretamente proporcional à temperatura de gelificação. A metilação sintética, no entanto, tem o efeito inverso, pelo que o aumento da metilação reduz a temperatura de gelificação. Uma variedade de agaroses quimicamente modificadas com diferentes temperaturas de fusão e gelificação estão disponíveis através de modificações químicas.
A agarose no gel forma uma malha que contém poros, e o tamanho dos poros depende da concentração de agarose adicionada. Em repouso, os géis de agarose são propensos à sinérese (extrusão de água através da superfície do gel), mas o processo é lento o suficiente para não interferir no uso do gel.
O gel de agarose pode ter alta força de gel em baixa concentração, tornando-o adequado como meio anticonvecção para eletroforese em gel. Géis de agarose tão diluídos quanto 0,15% podem formar placas para eletroforese em gel. O polímero de agarose contém grupos carregados, em particular piruvato e sulfato. Esses grupos carregados negativamente podem retardar o movimento das moléculas de DNA em um processo chamado eletroendosmose (EEO), e a agarose de baixa EEO é, portanto, geralmente preferida para uso em eletroforese em gel de agarose de ácidos nucleicos. As agaroses zero EEO também estão disponíveis, mas podem ser indesejáveis para algumas aplicações, pois podem ser produzidas pela adição de grupos carregados positivamente que podem afetar as reações enzimáticas subsequentes. A eletroendosmose é uma razão pela qual a agarose é usada preferencialmente sobre o agar, pois a agaropectina no agar contém uma quantidade significativa de sulfato e grupos carboxila carregados negativamente. A remoção de agaropectina em agarose reduz substancialmente o EEO, bem como reduz a adsorção não específica de biomoléculas à matriz do gel. No entanto, para algumas aplicações, como a eletroforese de proteínas séricas, um EEO alto pode ser desejável e agaropectina pode ser adicionada ao gel usado.
Agaroses de baixa temperatura de fusão e gelificação
As temperaturas de fusão e gelificação da agarose podem ser modificadas por modificações químicas, mais comumente por hidroxietilação, que reduz o número de pontes de hidrogênio intrafita, resultando em temperaturas de fusão e fixação mais baixas em comparação com as agaroses padrão. A temperatura exata é determinada pelo grau de substituição, e muitas agaroses de baixo ponto de fusão (LMP) disponíveis podem permanecer fluidas na faixa de 30–35 °C (86–95 °F). Esta propriedade permite que as manipulações enzimáticas sejam realizadas diretamente após a eletroforese em gel de DNA, adicionando fatias de gel fundido contendo o fragmento de DNA de interesse a uma mistura de reação. A agarose LMP contém menos sulfatos que podem afetar algumas reações enzimáticas e, portanto, é preferencialmente usada para algumas aplicações.
Agarose hidroxietilada também tem um tamanho de poro menor (~ 90 nm) do que as agaroses padrão. A hidroxietilação pode reduzir o tamanho dos poros reduzindo a densidade de empacotamento dos feixes de agarose, portanto o gel LMP também pode ter um efeito no tempo e na separação durante a eletroforese. As agaroses com temperatura ultrabaixa de fusão ou gelificação podem gelificar apenas a 8–15 °C (46–59 °F).
Aplicativos
A agarose é uma matriz preferencial para trabalhar com proteínas e ácidos nucléicos, pois possui uma ampla gama de estabilidade física, química e térmica, e seu menor grau de complexidade química também a torna menos propensa a interagir com biomoléculas. A agarose é mais comumente usada como meio para separação eletroforética em escala analítica em eletroforese em gel de agarose. Os géis feitos de agarose purificada têm um tamanho de poro relativamente grande, tornando-os úteis para a separação de moléculas grandes, como proteínas e complexos de proteínas >200 quilodaltons, bem como fragmentos de DNA >100 pares de bases. A agarose também é amplamente utilizada para várias outras aplicações, por exemplo, imunodifusão e imunoeletroforese, pois as fibras de agarose funcionam como uma âncora para imunocomplexos.
Eletroforese em gel de agarose
A eletroforese em gel de agarose é o método de rotina para resolução de DNA em laboratório. Os géis de agarose têm menor poder de resolução para o DNA do que os géis de acrilamida, mas têm maior intervalo de separação e, portanto, são geralmente usados para fragmentos de DNA com comprimentos de 50 a 20.000 pb (pares de bases), embora a resolução de mais de 6 Mb seja possível com pulsos eletroforese em gel de campo (PFGE). Também pode ser usado para separar grandes moléculas de proteína e é a matriz preferida para a eletroforese em gel de partículas com raios efetivos maiores que 5-10 nm.
O tamanho dos poros do gel afeta o tamanho do DNA que pode ser peneirado. Quanto menor a concentração do gel, maior o tamanho do poro e maior o DNA que pode ser peneirado. No entanto, géis de baixa concentração (0,1 - 0,2%) são frágeis e, portanto, difíceis de manusear, e a eletroforese de grandes moléculas de DNA pode levar vários dias. O limite de resolução para eletroforese em gel de agarose padrão é de cerca de 750 kb. Este limite pode ser superado pelo PFGE, onde campos elétricos ortogonais alternados são aplicados ao gel. Os fragmentos de DNA se reorientam quando o campo aplicado muda de direção, mas as moléculas maiores de DNA demoram mais para se realinhar quando o campo elétrico é alterado, enquanto as menores são mais rápidas e, portanto, o DNA pode ser fracionado de acordo com o tamanho.
Os géis de agarose são moldados em um molde e, quando endurecidos, geralmente são executados horizontalmente submersos em uma solução tampão. Tampões Tris-acetato-EDTA e Tris-Borato-EDTA são comumente usados, mas outros tampões como Tris-fosfato, ácido barbitúrico-barbitúrico de sódio ou tampões Tris-barbitúrico podem ser usados em outras aplicações. O DNA é normalmente visualizado por coloração com brometo de etídio e depois visualizado sob luz ultravioleta, mas outros métodos de coloração estão disponíveis, como SYBR Green, GelRed, azul de metileno e cristal violeta. Se os fragmentos de DNA separados forem necessários para experimentos posteriores, eles podem ser cortados do gel em fatias para posterior manipulação.
Purificação de proteínas
A matriz de gel de agarose é frequentemente usada para purificação de proteínas, por exemplo, em separação em escala preparativa baseada em coluna, como em cromatografia de filtração em gel, cromatografia de afinidade e cromatografia de troca iônica. No entanto, não é usado como um gel contínuo, mas é formado em grânulos porosos ou resinas de finura variável. Os grânulos são altamente porosos para que a proteína possa fluir livremente através dos grânulos. Esses grânulos à base de agarose são geralmente macios e facilmente esmagados, portanto, devem ser usados sob fluxo de gravidade, centrifugação de baixa velocidade ou procedimentos de baixa pressão. A resistência das resinas pode ser melhorada pelo aumento da reticulação e endurecimento químico das resinas de agarose, no entanto, tais alterações também podem resultar em uma menor capacidade de ligação para proteínas em alguns procedimentos de separação, como cromatografia de afinidade.
A agarose é um material útil para cromatografia porque não absorve biomoléculas de forma significativa, tem boas propriedades de fluxo e pode tolerar extremos de pH e força iônica, bem como alta concentração de desnaturantes, como uréia 8M ou guanidina HCl 6M. Exemplos de matriz à base de agarose para cromatografia de filtração em gel são Sepharose e WorkBeads 40 SEC (agarose com contas reticuladas), Praesto e Superose (agaroses com contas altamente reticuladas) e Superdex (dextran ligado covalentemente a agarose).
Para cromatografia de afinidade, agarose frisada é a resina de matriz mais comumente usada para a ligação dos ligantes que se ligam à proteína. Os ligantes são ligados covalentemente através de um espaçador aos grupos hidroxila ativados do polímero de contas de agarose. As proteínas de interesse podem então ser seletivamente ligadas aos ligantes para separá-los de outras proteínas, após o que podem ser eluídas. As esferas de agarose usadas são tipicamente de densidades de 4% e 6% com uma alta capacidade de ligação para proteínas.
Meios de cultura sólidos
Às vezes, a placa de agarose pode ser usada em vez de agar para cultivar organismos, pois o agar pode conter impurezas que podem afetar o crescimento do organismo ou alguns procedimentos a jusante, como a reação em cadeia da polimerase (PCR). A agarose também é mais dura do que o agar e pode, portanto, ser preferível onde é necessária uma maior resistência do gel, e sua temperatura de gelificação mais baixa pode evitar causar choque térmico ao organismo quando as células são suspensas em líquido antes da gelificação. Pode ser usado para a cultura de bactérias autotróficas estritas, protoplastos vegetais, Caenorhabditis elegans, outros organismos e várias linhas celulares.
Ensaios de motilidade
Às vezes, a agarose é usada em vez do ágar para medir a motilidade e a mobilidade do microrganismo. Espécies móveis serão capazes de migrar, embora lentamente, ao longo do gel poroso e as taxas de infiltração podem ser visualizadas. A porosidade do gel está diretamente relacionada à concentração de ágar ou agarose no meio, portanto, diferentes géis de concentração podem ser usados para avaliar a motilidade de natação, enxame, deslizamento e contração de uma célula. O ensaio de migração celular sob agarose pode ser usado para medir a quimiotaxia e a quimiocinese. Uma camada de gel de agarose é colocada entre uma população de células e um quimioatraente. À medida que um gradiente de concentração se desenvolve a partir da difusão do quimioatraente para o gel, várias populações de células que requerem diferentes níveis de estimulação para migrar podem ser visualizadas ao longo do tempo usando microfotografia à medida que escavam o túnel para cima através do gel contra a gravidade ao longo do gradiente.