Zygosaccharomyces bailii

Zygosaccharomyces bailii es una especie del género Zygosaccharomyces. Fue descrita inicialmente como Saccharomyces bailii por Lindner en 1895, pero en 1983 fue reclasificada como Zygosaccharomyces bailii en el trabajo de Barnett et al.

El deterioro provocado por el crecimiento de la levadura Zygosaccharomyces está muy extendido, lo que ha provocado importantes pérdidas económicas a la industria alimentaria. Dentro de este género, Z. bailii es una de las especies más problemáticas debido a su excepcional tolerancia a diversas condiciones de estrés. Una amplia gama de productos ácidos y/o con alto contenido de azúcar, como concentrados de frutas, vino, refrescos, jarabes, kétchup, mayonesa, encurtidos, aliños para ensaladas, etc., normalmente se consideran estables, es decir, que inactivan fácilmente una amplia gama de microorganismos transmitidos por los alimentos. Sin embargo, estos productos siguen siendo susceptibles al deterioro por Z. bailii.

Las células vegetativas de Zygosaccharomyces bailii son generalmente elipsoides, no móviles y se reproducen asexualmente por gemación multilateral, es decir, las yemas pueden surgir de varios sitios en las células. Durante el proceso de gemación, una célula madre produce una yema en su superficie exterior. A medida que la yema se alarga, el núcleo de la célula madre se divide y un núcleo migra hacia la yema. El material de la pared celular se llena en el espacio entre la yema y la célula madre; finalmente, la yema se separa para formar una célula hija de tamaño desigual. El tamaño de las células de Z. bailii varía dentro de un rango de (3,5 - 6,5) x (4,5 - 11,5) μm y las células existen solas o en pares, rara vez en cadena corta. Se ha observado que el tiempo de duplicación de esta levadura es de aproximadamente 3 horas a 23 °C en un caldo de levadura a base de nitrógeno que contiene 20% (p/v) de fructosa (pH 4,0). En condiciones más estresantes, este tiempo de generación se prolonga significativamente.

Además del modo de reproducción asexual, bajo ciertas condiciones (por ejemplo, estrés nutricional) Z. bailii produce esporas sexuales (ascosporas) en un saco llamado asca (plural: ascos). Normalmente, cada asca contiene de una a cuatro ascas, que generalmente son lisas, de paredes delgadas, esféricas o elipsoidales. Cabe mencionar que las ascasporas rara vez se observan ya que es difícil y puede llevar mucho tiempo inducir su formación; además, muchas cepas de levadura pierden la capacidad de producir ascosporas en subcultivos repetidos en el laboratorio. En varios agares nutritivos, las colonias de Z. bailii son lisas, redondas, convexas y de color blanco a crema, con un diámetro de 2 a 3 mm a los 3 a 7 días. Como las propiedades morfológicas de Zygosaccharomyces son idénticas a las de otros géneros de levaduras como Saccharomyces, Candida y Pichia, es imposible diferenciar Zygosaccharomyces de otras levaduras o especies individuales dentro del género basándose en observaciones morfológicas macroscópicas y microscópicas. Por lo tanto, la identificación de la levadura a nivel de especie depende más de características fisiológicas y genéticas que de criterios morfológicos.

En general, cualquier medio que contenga glucosa es adecuado para el cultivo y recuento de levaduras, por ejemplo, medio Sabouraud, agar de extracto de malta (MEA), agar de extracto de levadura triptona glucosa (TGY), agar de levadura glucosa cloranfenicol (YGC). Para la detección de levaduras resistentes a los ácidos como Z. bailii, se recomiendan medios acidificados, como MEA o TGY con 0,5 % (v/v) de ácido acético añadido. La siembra con medios de agar se utiliza a menudo para el recuento de levaduras, siendo preferible la técnica de esparcimiento superficial al método de vertido en placa porque la primera técnica proporciona una mejor recuperación de células con menores errores de dilución. Las condiciones de incubación habituales son atmósfera aeróbica, temperatura de 25 °C durante un período de 5 días. Sin embargo, se puede aplicar una temperatura de incubación más alta (30 °C) y un tiempo de incubación más corto (3 días) para Z. bailii, ya que la levadura crece más rápido a esta temperatura elevada.

Entre las especies de Zygosaccharomyces que provocan la descomposición, la Z. bailii posee las características de resistencia más pronunciadas y diversificadas, lo que le permite sobrevivir y proliferar en condiciones muy estresantes. Parece que la Z. bailii prefiere entornos ecológicos caracterizados por condiciones osmóticas elevadas. Los hábitats naturales descritos con más frecuencia son las frutas secas o fermentadas, los exudados de los árboles (en viñedos y huertos frutales) y en diversas etapas de la refinación del azúcar y la producción de jarabe. Además, rara vez se encuentra a la Z. bailii como un importante agente de descomposición en alimentos no procesados; por lo general, la levadura solo alcanza importancia en los productos procesados cuando la competencia con las bacterias y los mohos se reduce por factores intrínsecos como el pH, la actividad del agua (a_w), los conservantes, etc.

Una característica sobresaliente de Z. bailii es su excepcional resistencia a los conservantes de ácidos débiles comúnmente utilizados en alimentos y bebidas, como los ácidos acético, láctico, propiónico, benzoico, sórbico y dióxido de azufre. Además, se informa que la levadura puede tolerar altas concentraciones de etanol (≥ 15% (v/v)). Los rangos de pH y a_w para el crecimiento son amplios, 2,0 - 7,0 y 0,80 - 0,99, respectivamente. Además de ser resistente a los conservantes, otras características que contribuyen a la capacidad de descomposición de Z. bailii son: (i) su capacidad de fermentar vigorosamente los azúcares hexosos (p. ej., glucosa y fructosa), (ii) su capacidad de causar el deterioro a partir de un inóculo extremadamente bajo (p. ej., una célula viable por paquete de cualquier tamaño), (iii) una osmotolerancia moderada (en comparación con Zygosaccharomyces rouxii). Por lo tanto, los alimentos con un riesgo particular de deterioro por esta levadura suelen tener un pH bajo (de 2,5 a 5,0), una a_w baja y contener cantidades suficientes de azúcares fermentables.

Muchos autores han informado sobre la extrema resistencia a los ácidos de Z. bailii. En varias ocasiones, se ha observado el crecimiento de la levadura en alcoholes a base de frutas (pH 2,8-3,0, 40-45% (p/v) de sacarosa) conservados con 0,08% (p/v) de ácido benzoico, y en bebidas (pH 3,2) que contienen 0,06% (p/v) de ácido sórbico, 0,07% (p/v) de ácido benzoico o 2% (p/v) de ácido acético. Cabe destacar que las células individuales en cualquier población de Z. bailii difieren considerablemente en su resistencia al ácido sórbico, con una pequeña fracción capaz de crecer en niveles de conservante que duplican los de la población promedio. En algunos tipos de alimentos, la levadura es capaz incluso de crecer en presencia de ácidos benzoico y sórbico en concentraciones superiores a las permitidas legalmente y a valores de pH inferiores al pK_a de los ácidos. Por ejemplo, según la legislación de la Unión Europea (UE), el ácido sórbico está limitado a 0,03% (p/v) en refrescos (pH 2,5 - 3,2); sin embargo, Z. bailii puede crecer en refrescos que contengan 0,05% (p/v) de este ácido (pK_a 4,8). En particular, existe una fuerte evidencia de que la resistencia de Z. bailii es estimulada por la presencia de múltiples conservantes. Por lo tanto, la levadura puede sobrevivir y vencer las combinaciones sinérgicas de conservantes que normalmente proporcionan estabilidad microbiológica a los alimentos procesados. Se ha observado que la captación celular de ácido acético se inhibió cuando se incorporó ácido sórbico o benzoico al medio de cultivo. De manera similar, los niveles de etanol de hasta 10% (v/v) no influyeron negativamente en la resistencia de la levadura al ácido sórbico y benzoico a pH 4,0 - 5,0. Además, Sousa et al. (1996) han demostrado que en Z. bailii, el etanol desempeña un papel protector contra el efecto negativo del ácido acético al inhibir el transporte y la acumulación de este ácido intracelularmente.

Al igual que otros microorganismos, Z. bailii tiene la capacidad de adaptarse a niveles subinhibitorios de un conservante, lo que le permite sobrevivir y crecer en concentraciones mucho más altas del conservante que antes de la adaptación. Además, parece que la resistencia de Z. bailii al ácido acético, benzoico y propiónico está fuertemente correlacionada, ya que las células que se adaptaron al ácido benzoico también mostraron tolerancias mejoradas a otros conservantes.

Algunos estudios han revelado los efectos insignificantes de diferentes azúcares en la resistencia a los conservantes de Z. bailii; por ejemplo, se observó una resistencia comparable al ácido sórbico y benzoico independientemente de si las células se cultivaron en un medio de cultivo que contenía glucosa o fructosa como sustratos fermentables. Sin embargo, la resistencia a los conservantes de la levadura está influenciada por el nivel de glucosa, y la resistencia máxima se obtiene con concentraciones de azúcar del 10 al 20 % (p/v). Como Z. bailii es moderadamente osmotolerante, los niveles de sal y azúcar en los alimentos suelen ser insuficientes para controlar su crecimiento. La mayor tolerancia a la sal se ha observado con valores de pH bajos; por ejemplo, el NaCl máximo que permite el crecimiento fue del 12,5 % (p/v) a un pH de 3,0, mientras que fue solo del 5,0 % (p/v) a un pH de 5,0. Además, la presencia de sal o azúcar tiene un efecto positivo en la capacidad de Z. bailii para iniciar el crecimiento a niveles de pH extremos, por ejemplo, La levadura no mostró crecimiento a pH 2,0 en ausencia de NaCl y sacarosa, pero creció a este pH en NaCl al 2,5 % (p/v) o sacarosa al 50 % (p/v).

La mayoría de las especies de levaduras de fermentación facultativa no pueden crecer en ausencia total de oxígeno. Esto significa que la limitación de la disponibilidad de oxígeno podría ser útil para controlar el deterioro de los alimentos causado por levaduras fermentativas. Sin embargo, se ha observado que Z. bailii es capaz de crecer rápidamente y fermentar el azúcar vigorosamente en un medio complejo bajo condiciones estrictamente anaeróbicas, lo que indica que los componentes del medio complejo satisfacen los requerimientos nutricionales para el crecimiento anaeróbico. Por lo tanto, la restricción de la entrada de oxígeno en alimentos y bebidas, que son ricos en nutrientes, no es una estrategia prometedora para prevenir el riesgo de deterioro por esta levadura. Además, Leyva et al. (1999) han informado que las células de Z. bailii pueden conservar su capacidad de deterioro al producir una cantidad significativa de gas incluso en condiciones de no crecimiento (es decir, presencia de azúcares pero ausencia de una fuente de nitrógeno).

Se han sugerido diferentes estrategias para explicar la resistencia de Z. bailii a los conservantes de ácidos débiles, que incluyen: (i) degradación de los ácidos, (ii) prevención de la entrada o eliminación de ácidos de las células, (iii) alteración del objetivo del inhibidor o mejora del daño causado. En particular, los mecanismos de resistencia intrínsecos de Z. bailii son extremadamente adaptables y robustos. Su funcionalidad y eficacia no se ven afectadas o se suprimen marginalmente por condiciones ambientales como un pH bajo, una a_w baja y nutrientes limitados.

Desde hace mucho tiempo se sabe que Z. bailii puede mantener un gradiente ácido a través de la membrana celular, lo que indica la inducción de un sistema por el cual las células pueden reducir la acumulación de ácido intracelular. Según Warth (1977), Z. bailii utiliza una bomba de transporte activa e inducible para expulsar aniones ácidos de las células para contrarrestar los efectos tóxicos de los ácidos. Como la bomba requiere energía para funcionar de manera óptima, los altos niveles de azúcar aumentan la resistencia de Z. bailii a los conservantes. Sin embargo, esta opinión fue cuestionada a partir de una observación de que la concentración de ácido era exactamente la predicha a partir de los pH y pK_a intracelulares y extracelulares del ácido. Además, es poco probable que una extrusión activa de ácido por sí sola sea suficiente para lograr una distribución desigual del ácido a través de la membrana celular. En cambio, Z. bailii podría haber desarrollado formas mucho más eficientes de alterar su membrana celular para limitar la entrada difusional de ácidos a las células. Esto, a su vez, reducirá drásticamente cualquier necesidad de extrusión activa de protones y aniones ácidos, ahorrando así mucha energía. De hecho, Warth (1989) ha informado que la tasa de absorción de ácido propiónico por difusión en Z. bailii es mucho menor que en otras levaduras sensibles al ácido (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae). Por lo tanto, es concebible que Z. bailii se esfuerce más por limitar la entrada de ácidos para mejorar su resistencia a los ácidos.

Otro mecanismo de la Z. bailii para hacer frente al desafío ácido es que la levadura utiliza una adenosina trifosfatasa H+ (H+-ATPasa) de la membrana plasmática para expulsar protones de las células, evitando así la acidificación intracelular. Además, Cole y Keenan (1987) han sugerido que la resistencia de la Z. bailii incluye una capacidad para tolerar caídas crónicas del pH intracelular. Además, el hecho de que la levadura sea capaz de metabolizar conservantes también puede contribuir a su tolerancia al ácido. Con respecto a la resistencia de la Z. bailii al SO₂, se ha propuesto que las células reducen la concentración de SO₂ mediante la producción de compuestos extracelulares que se unen a los sulfitos, como el acetaldehído.

El comportamiento fructófilo es bien conocido en Z. bailii. A diferencia de la mayoría de otras levaduras, Z. bailii metaboliza la fructosa más rápidamente que la glucosa y crece mucho más rápido en alimentos que contienen ≥ 1% (p/p) de fructosa. Además, se ha observado que la fermentación alcohólica en condiciones aeróbicas (efecto Crabtree) en Z. bailii está influenciada por la fuente de carbono, es decir, el etanol se produce a una mayor velocidad y con un mayor rendimiento en fructosa que en glucosa. Esto se debe a que en Z. bailii, la fructosa es transportada por un sistema específico de alta capacidad, mientras que la glucosa es transportada por un sistema de menor capacidad, que es parcialmente inactivado por la fructosa y también acepta la fructosa como sustrato.

La fermentación lenta de la sacarosa está directamente relacionada con el metabolismo de la fructosa. Según Pitt y Hocking (1997), Z. bailii no puede crecer en alimentos que tengan sacarosa como única fuente de carbono. Como requiere tiempo hidrolizar la sacarosa en glucosa y fructosa (en condiciones de pH bajo), existe un largo retraso entre la fabricación y el deterioro de los productos contaminados con esta levadura cuando se utiliza sacarosa como ingrediente principal de carbohidratos. Esto suele estar precedido por un retraso de 2 a 4 semanas y el deterioro aparente de la calidad del producto solo se muestra 2 a 3 meses después de la fabricación. Por lo tanto, el uso de sacarosa como edulcorante (en lugar de glucosa o fructosa) es muy recomendable en productos sintéticos como los refrescos.

La fermentación de azúcares (p. ej. glucosa, fructosa y sacarosa) es una reacción metabólica clave de la mayoría de las levaduras (incluida Z. bailii) cuando se cultivan en condiciones anaeróbicas facultativas. Como los azúcares son componentes comunes de alimentos y bebidas, la fermentación es una característica típica del proceso de descomposición. Principalmente, estos azúcares se convierten en etanol y CO2, lo que hace que los productos pierdan dulzura y adquieran un aroma alcohólico distintivo junto con gases. Además, se forman muchos productos secundarios en pequeñas cantidades, como ácidos orgánicos, ésteres, aldehídos, etc. Z. bailii se destaca por su fuerte producción de metabolitos secundarios, p. ej. ácido acético, acetato de etilo y acetaldehído. En concentraciones suficientemente altas, estas sustancias pueden tener un efecto dominante en la calidad sensorial de los productos. La mayor resistencia de Z. bailii a los ácidos débiles que S. cerevisiae puede explicarse en parte por su capacidad de metabolizar conservantes. Se ha demostrado que Z. bailii es capaz de consumir ácido acético en presencia de azúcares fermentables, mientras que los sistemas de captación y utilización de acetato de S. cerevisiae están todos reprimidos por la glucosa. Además, Z. bailii también puede degradar oxidativamente el sorbato y el benzoato (y utilizar estos compuestos como única fuente de carbono), mientras que S. cerevisiae no tiene esta capacidad.

Según Thomas y Davenport (1985), los primeros informes de deterioro en mayonesa y aderezo de ensalada debido a Z. bailii se remontan a principios del siglo XX. Investigaciones más detalladas en los años 1940 y 1950 confirmaron que Z. bailii era el principal causante de deterioro en encurtidos de pepino, diversas mezclas de verduras encurtidas, salsas acidificadas, etc. Casi al mismo tiempo, ocasionalmente aparecieron incidentes de deterioro por fermentación en jarabes de frutas y bebidas conservadas con niveles moderados de ácido benzoico (0,04 - 0,05% (p/p)). Nuevamente, se identificó a Z. bailii como la fuente de deterioro. Hoy en día, a pesar de las grandes mejoras en el control de la formulación, el equipo de procesamiento de alimentos y las tecnologías de saneamiento (p. ej., limpieza automatizada en el lugar), la levadura sigue siendo muy problemática en salsas, alimentos acidificados, verduras encurtidas o en salmuera, concentrados de frutas y varias bebidas de frutas sin gas. Z. bailii también es reconocida como uno de los principales causantes de deterioro en los vinos debido a su alta resistencia a las combinaciones de etanol y ácidos orgánicos a pH bajo. Además, el deterioro causado por esta levadura se ha extendido a nuevas categorías de alimentos, como las mostazas preparadas, los refrescos carbonatados con sabor a frutas que contienen concentrados de cítricos, manzana y jugo de uva. La capacidad de Z. bailii para estropear una amplia gama de alimentos es un reflejo de su alta resistencia a muchos factores de estrés. Por lo tanto, varios autores la han incluido en la lista de las levaduras causantes de deterioro más peligrosas.

El deterioro por Z. bailii ocurre a menudo en alimentos ácidos estables en almacenamiento, que dependen de los efectos combinados de la acidez (p. ej. vinagre), sal y azúcar para suprimir el crecimiento microbiano. Los alimentos estropeados suelen mostrar cambios sensoriales que pueden ser fácilmente reconocidos por los consumidores, lo que resulta en pérdidas económicas significativas debido a quejas de los consumidores o retiradas de productos. Los signos observables de deterioro incluyen fugas de producto de los envases, cambio de color, emisión de olores desagradables a levadura, separación de la emulsión (en mayonesas, aderezos), turbidez, floculación o formación de sedimentos (en vinos, bebidas) y colonias visibles o desarrollo de película marrón en las superficies del producto. El sabor desagradable específico que se ha atribuido a Z. bailii está relacionado con H2S. Además, el sabor de los alimentos estropeados puede modificarse por la producción de ácido acético y ésteres frutales. Se ha informado que el crecimiento de Z. bailii también produce una importante formación de gas y etanol, lo que provoca un sabor alcohólico típico. La producción excesiva de gas es una consecuencia directa de la alta capacidad fermentativa de esta levadura y, en alimentos más sólidos, pueden aparecer burbujas de gas dentro del producto. En circunstancias extremas, la presión del gas producido dentro de frascos o botellas de vidrio puede alcanzar un nivel tal que pueden producirse explosiones, lo que crea un peligro adicional de lesiones por rotura de vidrio. Cabe mencionar que, en general, el deterioro detectable por levaduras requiere la presencia de un alto número de células, aproximadamente 5 - 6 log UFC/ml.

Además de estropear los alimentos, como consecuencia directa de su crecimiento, la Z. bailii puede modificar la textura y la composición del producto, de modo que otros microorganismos causantes de la descomposición puedan colonizarlo con mayor facilidad. Por ejemplo, al utilizar ácido acético, la levadura puede elevar el pH de los encurtidos lo suficiente como para permitir el crecimiento de bacterias menos tolerantes al ácido. Además, al igual que con otras levaduras, la concentración de azúcar fermentable en un producto afecta la tasa de descomposición por parte de la Z. bailii; por ejemplo, la levadura crece más rápido en presencia de un 10 % (p/p) que de un 1 % (p/p) de glucosa. En particular, la Z. bailii puede crecer y causar descomposición a partir de inóculos extremadamente bajos, tan solo una célula viable en ≥ 10 litros de bebidas. Esto significa que la detección de un número bajo de células de levadura en un producto no garantiza su estabilidad. Ningún programa de control de calidad microbiológico o de saneamiento puede hacer frente a este grado de riesgo. Por lo tanto, las únicas alternativas serían la reformulación de los alimentos para aumentar la estabilidad y/o la aplicación de parámetros de procesamiento térmico de alta letalidad.

Aparte de provocar alteraciones no deseadas, esta levadura también está presente en la fermentación del vinagre balsámico tradicional italiano (Zygosaccharomyces rouxii junto con Zygosaccharomyces bailii, Z. pseudorouxii, Z. mellis, Z. bisporus, Z. lentus, Hanseniaspora valbyensis, Hanseniaspora osmophila, Candida lactis-condensi, Candida stellata, Saccharomycodes ludwigii, Saccharomyces cerevisiae)

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