Vacuna de ADN

La elaboración de una vacuna contra el ADN

Una vacuna de ADN es un tipo de vacuna que transfecta una secuencia de ADN que codifica un antígeno específico en las células de un organismo como mecanismo para inducir una respuesta inmunitaria.

Las vacunas de ADN funcionan mediante la inyección de un plásmido modificado genéticamente que contiene la secuencia de ADN que codifica los antígenos contra los que se busca una respuesta inmunitaria, de modo que las células produzcan directamente el antígeno, provocando así una respuesta inmunológica protectora. Las vacunas de ADN tienen ventajas teóricas sobre las vacunas convencionales, incluida la "capacidad de inducir una gama más amplia de tipos de respuesta inmunitaria". Se han probado varias vacunas de ADN para uso veterinario. En algunos casos, se ha obtenido protección contra enfermedades en animales, en otros no. Se están realizando investigaciones sobre el enfoque para enfermedades virales, bacterianas y parasitarias en humanos, así como para el cáncer. En agosto de 2021, las autoridades indias dieron la aprobación de emergencia a ZyCoV-D. Desarrollada por Cadila Healthcare, es la primera vacuna de ADN aprobada para humanos.

Historia

Las vacunas convencionales contienen antígenos específicos de un patógeno o virus atenuados que estimulan una respuesta inmunitaria en el organismo vacunado. Las vacunas de ADN son miembros de las vacunas genéticas, porque contienen una información genética (ADN o ARN) que codifica la producción celular (biosíntesis de proteínas) de un antígeno. Las vacunas de ADN contienen ADN que codifica antígenos específicos de un patógeno. El ADN se inyecta en el cuerpo y es absorbido por las células, cuyos procesos metabólicos normales sintetizan proteínas basadas en el código genético del plásmido que han absorbido. Debido a que estas proteínas contienen regiones de secuencias de aminoácidos que son características de las bacterias o los virus, se las reconoce como extrañas y, cuando las células huésped las procesan y las muestran en su superficie, el sistema inmunitario recibe una alerta, lo que desencadena respuestas inmunitarias. Alternativamente, el ADN se puede encapsular en proteína para facilitar la entrada en la célula. Si esta proteína de la cápside se incluye en el ADN, la vacuna resultante puede combinar la potencia de una vacuna viva sin riesgos de reversión.

En 1983, Enzo Paoletti y Dennis Panicali, del Departamento de Salud de Nueva York, diseñaron una estrategia para producir vacunas de ADN recombinante mediante el uso de ingeniería genética para transformar la vacuna común contra la viruela en vacunas que puedan prevenir otras enfermedades. Alteraron el ADN del virus de la viruela bovina insertando un gen de otros virus (a saber, el virus del herpes simple, la hepatitis B y la influenza). En 1993, Jeffrey Ulmer y sus compañeros de trabajo en Merck Research Laboratories demostraron que la inyección directa de ratones con ADN plasmídico que codificaba un antígeno de la gripe protegía a los animales contra infecciones experimentales posteriores con el virus de la gripe. En 2016, una vacuna de ADN para el virus Zika comenzó a probarse en humanos en los Institutos Nacionales de Salud. Se planeó que en el estudio participaran hasta 120 sujetos de entre 18 y 35 años. Por separado, Inovio Pharmaceuticals y GeneOne Life Science comenzaron las pruebas de una vacuna de ADN diferente contra el Zika en Miami. La vacuna NIH se inyecta en la parte superior del brazo bajo alta presión. La fabricación de las vacunas en volumen seguía sin resolverse en agosto de 2016. Se están realizando ensayos clínicos de vacunas de ADN para prevenir el VIH.

En agosto de 2021, las autoridades indias aprobaron de emergencia el ZyCoV-D. Desarrollada por Cadila Healthcare, es la primera vacuna de ADN contra la COVID-19.

Aplicaciones

Hasta 2021, no se han aprobado vacunas de ADN para uso humano en los Estados Unidos. Pocos ensayos experimentales han evocado una respuesta lo suficientemente fuerte como para proteger contra la enfermedad y la utilidad de la técnica aún no se ha probado en humanos. Se ha aprobado una vacuna veterinaria de ADN para proteger a los caballos del virus del Nilo Occidental. La inmunización con ADN también se está investigando como un medio para desarrollar sueros antiofídicos. La inmunización con ADN se puede utilizar como plataforma tecnológica para la inducción de anticuerpos monoclonales.

Ventajas

• No hay riesgo de infección
• Presentación de antígeno por moléculas de clase I y clase II
• Polarise Respuesta de células T hacia el tipo 1 o el tipo 2
• Respuesta inmune centrada en el antígeno de interés
• Facilidad de desarrollo y producción
• Estabilidad para almacenamiento y envío
• Eficacia de los costos
• Obvia la necesidad de síntesis de péptidos, expresión y purificación de proteínas recombinantes y uso de adyuvantes tóxicos
• Persistencia a largo plazo de inmunogeno
• In vivo expresión asegura que la proteína se asemeja más a la estructura eucariotica normal, con modificaciones post-translacionales acompañantes

Desventajas

• Limitada a proteínas inmunógenas (no útil para antígenos basados en no proteínas, como polisacáridos bacterianos)
• Potencial para el procesamiento atípico de proteínas bacterianas y parásitos
• Potential when using nasal spray administration of plasmid DNA nanoparticles to transfect non-target cells, such as brain cells
• Contaminación cruzada al fabricar diferentes tipos de vacunas en vivo en las mismas instalaciones

Vectores de plásmidos

Diseño vectorial

Las vacunas de ADN provocan la mejor respuesta inmunitaria cuando se utilizan vectores de alta expresión. Estos son plásmidos que generalmente consisten en un fuerte promotor viral para impulsar la transcripción y traducción in vivo del gen (o ADN complementario) de interés. A veces se puede incluir el intrón A para mejorar la estabilidad del ARNm y, por lo tanto, aumentar la expresión de proteínas. Los plásmidos también incluyen una fuerte señal de poliadenilación/terminación de la transcripción, como la hormona de crecimiento bovina o secuencias de poliadenilación de beta-globulina de conejo. Los vectores policistrónicos (con múltiples genes de interés) a veces se construyen para expresar más de un inmunógeno o para expresar un inmunógeno y una proteína inmunoestimuladora.

Debido a que el plásmido, que lleva un código genético relativamente pequeño de hasta aproximadamente 200 Kbp, es el "vehículo" a partir del cual se expresa el inmunógeno, es esencial optimizar el diseño del vector para lograr la máxima expresión de proteínas. Una forma de mejorar la expresión de proteínas es optimizar el uso de codones de mRNA patogénicos para células eucariotas. Los patógenos a menudo tienen diferentes contenidos de AT que las especies objetivo, por lo que la alteración de la secuencia del gen del inmunógeno para reflejar los codones más comúnmente utilizados en la especie objetivo puede mejorar su expresión.

Otra consideración es la elección del promotor. El promotor SV40 se usaba convencionalmente hasta que la investigación mostró que los vectores impulsados por el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) tenían tasas de expresión mucho más altas. Más recientemente, la expresión y la inmunogenicidad se han incrementado aún más en sistemas modelo mediante el uso del promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) y un elemento transcripcional retroviral que actúa en cis. Las modificaciones adicionales para mejorar las tasas de expresión incluyen la inserción de secuencias potenciadoras, intrones sintéticos, secuencias líder tripartita de adenovirus (TPL) y modificaciones a las secuencias de poliadenilación y terminación transcripcional. Un ejemplo de plásmido de vacuna de ADN es pVAC, que utiliza el promotor SV40.

Los fenómenos de inestabilidad estructural son motivo de especial preocupación para la fabricación de plásmidos, la vacunación con ADN y la terapia génica. Las regiones accesorias pertenecientes a la columna vertebral del plásmido pueden participar en una amplia gama de fenómenos de inestabilidad estructural. Los catalizadores bien conocidos de inestabilidad genética incluyen repeticiones directas, invertidas y en tándem, que son conspicuas en muchos vectores de clonación y expresión disponibles comercialmente. Por lo tanto, la reducción o eliminación completa de secuencias de columna vertebral no codificantes extrañas reduciría significativamente la propensión a que ocurran tales eventos y, en consecuencia, el potencial recombinogénico general del plásmido.

Mecanismo de plásmidos

Una vez que el plásmido se inserta en el núcleo de la célula transfectada, codifica una cadena peptídica de un antígeno extraño. En su superficie, la célula muestra el antígeno extraño con moléculas del complejo de histocompatibilidad (MHC) de clase I y clase II. La célula presentadora de antígeno luego viaja a los ganglios linfáticos y presenta el péptido antigénico y la molécula coestimuladora que envía señales a las células T, lo que inicia la respuesta inmunitaria.

Diseño de inserto de vacunas

Los inmunógenos se pueden dirigir a varios compartimentos celulares para mejorar las respuestas de anticuerpos o de células T citotóxicas. Los antígenos secretados o unidos a la membrana plasmática son más efectivos para inducir respuestas de anticuerpos que los antígenos citosólicos, mientras que las respuestas de células T citotóxicas se pueden mejorar dirigiendo antígenos para la degradación citoplasmática y la posterior entrada en la vía del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I. Esto generalmente se logra mediante la adición de señales de ubiquitina N-terminal.

La conformación de la proteína también puede afectar las respuestas de los anticuerpos. Las estructuras "ordenadas" (como las partículas virales) son más eficaces que las estructuras desordenadas. Cadenas de minigenes (o epítopos MHC de clase I) de diferentes patógenos aumentan las respuestas de células T citotóxicas a algunos patógenos, especialmente si también se incluye un epítopo TH.

Entrega

La vacuna contra el ADN y las técnicas de terapia genética son similares.

Las vacunas de ADN se han introducido en tejidos animales mediante múltiples métodos. En 1999, los dos enfoques más populares fueron la inyección de ADN en solución salina: mediante el uso de una aguja hipodérmica estándar o mediante el uso de una pistola genética. Varias otras técnicas han sido documentadas en los años intermedios.

Inyección de solución salina

La inyección de solución salina normalmente se realiza por vía intramuscular (IM) en el músculo esquelético, o por vía intradérmica (ID), entregando el ADN a los espacios extracelulares. Esto puede ser asistido ya sea 1) por electroporación; 2) al dañar temporalmente las fibras musculares con miotoxinas como la bupivacaína; o 3) mediante el uso de soluciones hipertónicas de solución salina o sacarosa. Las respuestas inmunitarias a este método pueden verse afectadas por factores que incluyen el tipo de aguja, la alineación de la aguja, la velocidad de la inyección, el volumen de la inyección, el tipo de músculo y la edad, el sexo y el estado fisiológico del receptor.

Pistola de genes

La aplicación de armas de genes acelera balísticamente el ADN plasmídico (pDNA) que se ha absorbido en micropartículas de oro o tungsteno en las células objetivo, utilizando helio comprimido como acelerador.

Entrega en la superficie de la mucosa

Las alternativas incluían la instilación en aerosol de ADN desnudo en las superficies de las mucosas, como la mucosa nasal y pulmonar, y la administración tópica de pDNA en el ojo y la mucosa vaginal. La liberación en la superficie de la mucosa también se ha logrado utilizando preparaciones catiónicas de liposomas-ADN, microesferas biodegradables, vectores atenuados de Salmonalla, Shigella o Listeria para la administración oral al mucosa intestinal y vectores de adenovirus recombinantes.

Vehículo de polímero

Se ha empleado un vehículo híbrido compuesto por células bacterianas y polímeros sintéticos para la administración de vacunas de ADN. Una E. coli el núcleo interno y la capa externa de poli(beta-aminoéster) funcionan sinérgicamente para aumentar la eficiencia al abordar las barreras asociadas con la entrega de genes de células presentadoras de antígenos que incluyen la captación e internalización celular, el escape fagosomal y la concentración de carga intracelular. Probado en ratones, se encontró que el vector híbrido induce una respuesta inmune.

Vacunación ELI

Otro enfoque para la vacunación con ADN es la inmunización con biblioteca de expresión (ELI). Con esta técnica, potencialmente todos los genes de un patógeno pueden administrarse a la vez, lo que puede ser útil para patógenos que son difíciles de atenuar o cultivar. ELI se puede utilizar para identificar qué genes inducen una respuesta protectora. Esto se ha probado con Mycoplasma pulmonis, un patógeno pulmonar murino con un genoma relativamente pequeño. Incluso las bibliotecas de expresión parcial pueden inducir la protección contra el desafío posterior.

Comparación tabular útil

Dosificación

El método de administración determina la dosis necesaria para generar una respuesta inmunitaria eficaz. Las inyecciones de solución salina requieren cantidades variables de ADN, de 10 μg a 1 mg, mientras que las entregas con pistolas de genes requieren de 100 a 1000 veces menos. En general, se requieren de 0,2 μg a 20 μg, aunque se han informado cantidades tan bajas como 16 ng. Estas cantidades varían según la especie. Los ratones, por ejemplo, requieren aproximadamente 10 veces menos ADN que los primates. Las inyecciones de solución salina requieren más ADN porque el ADN se envía a los espacios extracelulares del tejido objetivo (normalmente músculo), donde tiene que superar barreras físicas (como la lámina basal y grandes cantidades de tejido conjuntivo) antes de que lo absorba el tejido conectivo. las células, mientras que las entregas de pistolas de genes impulsan/fuerzan el ADN directamente en las células, lo que resulta en menos "desperdicio".

Respuesta inmune

Respuestas de células T colaboradoras

La presentación del antígeno estimula Células T para convertirse en células CD8+ "citotóxicas" o células CD4+ "ayudar". Las células citotóxicas atacan directamente a otras células que transportan ciertas moléculas extranjeras o anormales en sus superficies. Las células T del ayudante, o las células Th, coordinan las respuestas inmunitarias comunicándose con otras células. En la mayoría de los casos, las células T sólo reconocen un antígeno si se lleva sobre la superficie de una célula por uno de los propios MHC del cuerpo, o complejo de histocompatibilidad principal, moléculas.

La inmunización con ADN puede generar múltiples respuestas T_H, incluida la linfoproliferación y la generación de una variedad de perfiles de citoquinas. Una de las principales ventajas de las vacunas de ADN es la facilidad con la que se pueden manipular para sesgar el tipo de ayuda de las células T hacia una respuesta TH1 o TH2. Cada tipo tiene patrones distintivos de expresión de linfocinas y quimiocinas, tipos específicos de inmunoglobulinas, patrones de tráfico de linfocitos y tipos de respuestas inmunitarias innatas.

Otros tipos de ayuda de células T

El tipo de ayuda de células T generada está influenciado por el método de administración y el tipo de inmunógeno expresado, así como por la orientación de los diferentes compartimentos linfoides. En general, las inyecciones con aguja de solución salina (ya sea IM o ID) tienden a inducir respuestas TH1, mientras que la administración de pistola de genes aumenta las respuestas TH2. Esto es cierto para los antígenos intracelulares y unidos a la membrana plasmática, pero no para los antígenos secretados, que parecen generar respuestas TH2, independientemente del método de administración.

Por lo general, el tipo de ayuda de linfocitos T generado es estable a lo largo del tiempo y no cambia cuando es desafiado o después de inmunizaciones posteriores que normalmente habrían generado el tipo de respuesta opuesto en un espécimen ingenuo. Sin embargo, Mor et al.. (1995) inmunizaron y reforzaron ratones con pDNA que codifica la proteína circumsporozoite del parásito de la malaria de ratón Plasmodium yoelii (PyCSP) y descubrieron que la respuesta TH2 inicial cambiaba, después del refuerzo, a una respuesta TH1.

Base para diferentes tipos de ayuda de células T

No se comprende cómo funcionan estos diferentes métodos, las formas de antígeno expresadas y los diferentes perfiles de ayuda de las células T. Se pensó que las cantidades relativamente grandes de ADN utilizadas en la inyección IM eran responsables de la inducción de las respuestas TH1. Sin embargo, la evidencia no muestra diferencias relacionadas con la dosis en el tipo de TH. El tipo de ayuda de células T generada está determinado por el estado diferenciado de las células presentadoras de antígenos. Las células dendríticas pueden diferenciarse para secretar IL-12 (que respalda el desarrollo de células TH1) o IL-4 (que respalda las respuestas TH2). El pDNA inyectado con aguja se somete a endocitosis en la célula dendrítica, que luego se estimula para diferenciarse para la producción de citoquinas TH1 (IL-12), mientras que la pistola de genes bombardea el ADN directamente en la célula, evitando así la estimulación TH1.

Usos prácticos de la ayuda de células T polarizadas

La polarización en la ayuda de las células T es útil para influir en las respuestas alérgicas y las enfermedades autoinmunes. En las enfermedades autoinmunes, el objetivo es cambiar la respuesta TH1 autodestructiva (con su actividad de células T citotóxicas asociada) a una respuesta TH2 no destructiva. Esto se ha aplicado con éxito en la preparación previa a la enfermedad para el tipo de respuesta deseado en modelos preclínicos y tiene cierto éxito en cambiar la respuesta para una enfermedad establecida.

Respuestas de células T citotóxicas

Una de las ventajas de las vacunas de ADN es que pueden inducir linfocitos T citotóxicos (CTL) sin el riesgo inherente asociado con las vacunas vivas. Las respuestas de CTL pueden generarse contra epítopos de CTL inmunodominantes e inmunorrecesivos, así como contra epítopos de CTL subdominantes, de una manera que parece imitar la infección natural. Esto puede resultar una herramienta útil para evaluar los epítopos CTL y su papel en la provisión de inmunidad.

Las células T citotóxicas reconocen péptidos pequeños (8-10 aminoácidos) complejados con moléculas MHC de clase I. Estos péptidos se derivan de proteínas citosólicas que se degradan y se entregan a la molécula MHC de clase I naciente dentro del retículo endoplásmico (RE). Dirigir los productos génicos directamente al ER (mediante la adición de una secuencia de señal de inserción del ER en el extremo N) debería mejorar las respuestas de CTL. Esto se demostró con éxito usando virus vaccinia recombinantes que expresan proteínas de influenza, pero el principio también debería ser aplicable a las vacunas de ADN. Se demostró que la selección de antígenos para la degradación intracelular (y, por lo tanto, la entrada en la ruta del MHC de clase I) mediante la adición de secuencias señal de ubiquitina o la mutación de otras secuencias señal es eficaz para aumentar las respuestas de CTL.

Las respuestas de CTL se pueden mejorar mediante la coinoculación con moléculas coestimuladoras como B7-1 o B7-2 para vacunas de ADN contra la nucleoproteína de la influenza, o GM-CSF para vacunas de ADN contra el modelo murino de malaria P. yoelii. Se demostró que la coinoculación con plásmidos que codifican moléculas coestimuladoras IL-12 y TCA3 aumenta la actividad de CTL contra antígenos de nucleoproteína de influenza y VIH-1.

Respuesta humoral (de anticuerpos)

Diagrama esquemático de un anticuerpo y antígenos

Las respuestas de anticuerpos provocadas por las vacunas de ADN están influenciadas por múltiples variables, incluido el tipo de antígeno; ubicación del antígeno (es decir, intracelular frente a secretado); número, frecuencia y dosis de inmunización; sitio y método de administración del antígeno.

Cinética de la respuesta de anticuerpos

Las respuestas humorales después de una sola inyección de ADN pueden durar mucho más que después de una sola inyección con una proteína recombinante. Las respuestas de anticuerpos contra la proteína de la cubierta (HBsAg) del virus de la hepatitis B (VHB) se mantuvieron durante hasta 74 semanas sin refuerzo, mientras que se demostró en ratones el mantenimiento de por vida de la respuesta protectora a la hemaglutinina de la influenza después de la administración de armas genéticas. Las células secretoras de anticuerpos (ASC) migran a la médula ósea y al bazo para la producción de anticuerpos a largo plazo y, por lo general, se localizan allí después de un año.

Las comparaciones de respuestas de anticuerpos generadas por infección natural (viral), inmunización con proteína recombinante e inmunización con pDNA se resumen en la Tabla 4. Las respuestas de anticuerpos generadas por ADN aumentan mucho más lentamente que cuando ocurre una infección natural o una inmunización con proteína recombinante. Pueden ser necesarias hasta 12 semanas para alcanzar los títulos máximos en ratones, aunque el refuerzo puede reducir el intervalo. Esta respuesta probablemente se deba a los bajos niveles de antígeno expresados durante varias semanas, lo que respalda tanto Fases primaria y secundaria de la respuesta de anticuerpos. Se inyectó una vacuna de ADN que expresa la proteína de envoltura pequeña y mediana del VHB en adultos con hepatitis crónica. La vacuna resultó en la producción específica de células gamma de interferón. También se desarrollaron células T específicas para antígenos de proteínas de envoltura media. La respuesta inmune de los pacientes no fue lo suficientemente robusta para controlar la infección por VHB

Además, los títulos de anticuerpos específicos generados por la vacunación con ADN son inferiores a los obtenidos tras la vacunación con una proteína recombinante. Sin embargo, los anticuerpos inducidos por inmunización con ADN muestran una mayor afinidad por los epítopos nativos que los anticuerpos inducidos por proteínas recombinantes. En otras palabras, la inmunización con ADN induce una respuesta cualitativamente superior. Los anticuerpos se pueden inducir después de una vacunación con ADN, mientras que las vacunas con proteínas recombinantes generalmente requieren un refuerzo. La inmunización con ADN se puede utilizar para sesgar el perfil de TH de la respuesta inmunitaria y, por lo tanto, el isotipo del anticuerpo, lo que no es posible ni con la infección natural ni con la inmunización con proteínas recombinantes. Las respuestas de anticuerpos generadas por el ADN son útiles como herramienta de preparación. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos policlonales y monoclonales para su uso como reactivos.

Base mecánica de las respuestas inmunitarias generadas por el ADN

Mecanismo de captación de ADN

Cuando se demostró por primera vez in vivo en células musculares la captación de ADN y su posterior expresión, se pensó que estas células eran únicas debido a su extensa red de túbulos T. Usando microscopía electrónica, se propuso que la captación de ADN fue facilitada por caveolas (o fosas no recubiertas de clatrina). Sin embargo, investigaciones posteriores revelaron que otras células (como los queratinocitos, los fibroblastos y las células epiteliales de Langerhans) también podían internalizar el ADN. El mecanismo de captación de ADN no se conoce.

Dominan dos teorías: que la captación de ADN in vivo se produce de forma no específica, en un método similar a la fago o pinocitosis, oa través de receptores específicos. Estos pueden incluir un receptor de superficie de 30 kDa o receptores depuradores de macrófagos. El receptor de superficie de 30 kDa se une específicamente a fragmentos de ADN de 4500 pb (que luego se internalizan) y se encuentra en APC y células T profesionales. Los receptores depuradores de macrófagos se unen a una variedad de macromoléculas, incluidos los polirribonucleótidos y, por lo tanto, son candidatos para la captación de ADN. La captación de ADN mediada por receptores podría facilitarse mediante la presencia de secuencias de poliguanilato. Los sistemas de administración de pistolas de genes, el empaquetamiento de liposomas catiónicos y otros métodos de administración eluden este método de entrada, pero comprenderlo puede ser útil para reducir los costos (p. ej., al reducir la necesidad de citofectinas), lo que podría importante en la ganadería.

Presentación de antígenos por células derivadas de la médula ósea

Una célula dendriática

Estudios con ratones quiméricos han demostrado que el antígeno es presentado por células derivadas de la médula ósea, que incluyen células dendríticas, macrófagos y células B especializadas llamadas células presentadoras de antígeno profesionales (APC). Después de la inoculación con pistola de genes en la piel, las células de Langerhans transfectadas migran al ganglio linfático de drenaje para presentar antígenos. Después de las inyecciones IM e ID, las células dendríticas presentan antígeno en el ganglio linfático de drenaje y se han encontrado macrófagos transfectados en la sangre periférica.

Además de la transfección directa de células dendríticas o macrófagos, el cebado cruzado se produce después de las entregas de ADN IM, ID y pistola de genes. El cebado cruzado ocurre cuando una célula derivada de la médula ósea presenta péptidos de proteínas sintetizadas en otra célula en el contexto del MHC de clase 1. Esto puede estimular las respuestas de las células T citotóxicas y parece ser importante para una respuesta inmunitaria primaria completa.

Rol objetivo en el sitio

La administración de ADN IM e ID inicia las respuestas inmunitarias de manera diferente. En la piel, los queratinocitos, fibroblastos y células de Langerhans captan y expresan antígenos y son responsables de inducir una respuesta primaria de anticuerpos. Las células de Langerhans transfectadas migran fuera de la piel (en un plazo de 12 horas) al ganglio linfático de drenaje donde preparan las respuestas secundarias de células B y T. En el músculo esquelético, las células del músculo estriado se transfectan con mayor frecuencia, pero parecen no tener importancia en la respuesta inmunitaria. En cambio, el ADN inoculado por vía IM se “lava” en el ganglio linfático de drenaje en minutos, donde las células dendríticas distales se transfectan y luego inician una respuesta inmune. Los miocitos transfectados parecen actuar como un "reservorio" de antígeno para el tráfico de APC profesionales.

Mantenimiento de la respuesta inmune

La vacunación con ADN genera una memoria inmunitaria eficaz mediante la visualización de complejos antígeno-anticuerpo en las células dendríticas foliculares (FDC), que son potentes estimuladores de las células B. Las células T pueden ser estimuladas por células dendríticas del centro germinal similares. Las FDC pueden generar una memoria inmunitaria porque la producción de anticuerpos se "superpone" a la expresión a largo plazo del antígeno, lo que permite que se formen inmunocomplejos antígeno-anticuerpo y que las FDC los muestren.

Interferones

Tanto las células T auxiliares como las citotóxicas pueden controlar las infecciones virales mediante la secreción de interferones. Las células T citotóxicas generalmente matan las células infectadas por virus. Sin embargo, también pueden estimularse para que secreten citoquinas antivirales como IFN-γ y TNF-α, que no matan la célula, pero limitan la infección viral al regular a la baja la expresión de los componentes virales. Las vacunas de ADN se pueden usar para frenar las infecciones virales mediante el control no destructivo mediado por IFN. Esto se demostró para la hepatitis B. El IFN-γ tiene una importancia crítica en el control de las infecciones por paludismo y es una consideración para las vacunas de ADN contra el paludismo.

Modulación de la respuesta inmune

Modulación de citoquinas

Una vacuna eficaz debe inducir una respuesta inmunitaria adecuada para un patógeno determinado. Las vacunas de ADN pueden polarizar la ayuda de células T hacia los perfiles TH1 o TH2 y generar CTL y/o anticuerpos cuando sea necesario. Esto se puede lograr modificando la forma del antígeno expresado (es decir, intracelular frente a secretado), el método y la vía de administración o la dosis. También se puede lograr mediante la administración conjunta de ADN plasmídico que codifica moléculas reguladoras inmunitarias, es decir, citoquinas, linfoquinas o moléculas coestimuladoras. Estos “adyuvantes genéticos” se pueden administrar como:

• mezcla de 2 plasmides, una codificación del inmunógeno y la otra codificación de la citocina
• único vector bi- o policistronico, separado por regiones espaciadoras
• quimera codificada o proteína de fusión

En general, la administración conjunta de agentes proinflamatorios (como varias interleucinas, factor de necrosis tumoral y GM-CSF) más citocinas inductoras de TH2 aumentan las respuestas de anticuerpos, mientras que los agentes proinflamatorios y las citocinas inductoras de TH1 disminuyen la respuesta humoral. respuestas y aumentar las respuestas citotóxicas (más importante en la protección viral). A veces se utilizan moléculas coestimuladoras como B7-1, B7-2 y CD40L.

Este concepto se aplicó en la administración tópica de pDNA que codifica IL-10. El plásmido que codifica B7-1 (un ligando de las APC) mejoró con éxito la respuesta inmunitaria en modelos tumorales. Mezcla de plásmidos que codifican GM-CSF y la proteína circumsporozoite de P. yoelii (PyCSP) mejoró la protección contra el desafío posterior (mientras que PyCSP codificado por plásmido solo no lo hizo). Se propuso que el GM-CSF provocaba que las células dendríticas presentaran el antígeno de forma más eficaz y potenciaran la producción de IL-2 y la activación de las células TH, lo que impulsaría una mayor respuesta inmunitaria. Esto se puede mejorar aún más cebando primero con una mezcla de pPyCSP y pGM-CSF, seguido de un refuerzo con un poxvirus recombinante que exprese PyCSP. Sin embargo, la coinyección de plásmidos que codifican GM-CSF (o IFN-γ o IL-2) y una proteína de fusión de P. La proteína de superficie de merozoito chabaudi 1 (terminal C)-proteína de superficie del virus de la hepatitis B (PcMSP1-HBs) anuló la protección contra el desafío, en comparación con la protección adquirida por la administración de pPcMSP1-HBs solo.

Las ventajas de los adyuvantes genéticos son su bajo costo y su administración simple, así como la evitación de citoquinas recombinantes inestables y adyuvantes "convencionales" potencialmente tóxicos (como alumbre, fosfato de calcio, monofosforil lípido A, toxina del cólera, catiónico y manano). liposomas recubiertos, QS21, carboximetilcelulosa y ubenimix). Sin embargo, no se ha establecido la toxicidad potencial de la expresión prolongada de citoquinas. En muchas especies animales comercialmente importantes, los genes de citoquinas no han sido identificados ni aislados. Además, varias citocinas codificadas por plásmidos modulan el sistema inmunitario de manera diferente según el tiempo de entrega. Por ejemplo, algunos ADN de plásmidos de citoquinas se administran mejor después del pDNA de inmunógeno, porque la administración previa o conjunta puede disminuir las respuestas específicas y aumentar las respuestas no específicas.

Motivos CpG inmunoestimuladores

El propio ADN plásmido parece tener un efecto adyuvante sobre el sistema inmunitario. El ADN derivado de bacterias puede desencadenar mecanismos de defensa inmune innatos, la activación de células dendríticas y la producción de citoquinas TH1. Esto se debe al reconocimiento de ciertas secuencias de dinucleótidos CpG que son inmunoestimuladoras. Las secuencias estimulantes de CpG (CpG-S) ocurren veinte veces más frecuentemente en el ADN derivado de bacterias que en los eucariotas. Esto se debe a que los eucariotas exhiben "supresión de CpG", es decir, los pares de dinucleótidos CpG ocurren con mucha menos frecuencia de lo esperado. Además, las secuencias CpG-S están hipometiladas. Esto ocurre con frecuencia en el ADN bacteriano, mientras que los motivos CpG que se encuentran en los eucariotas están metilados en el nucleótido de citosina. Por el contrario, las secuencias de nucleótidos que inhiben la activación de una respuesta inmunitaria (denominada neutralización de CpG o CpG-N) están sobrerrepresentadas en los genomas eucarióticos. La secuencia inmunoestimuladora óptima es un dinucleótido CpG no metilado flanqueado por dos purinas 5' y dos pirimidinas 3'. Además, las regiones flanqueantes fuera de este hexámero inmunoestimulador deben ser ricas en guanina para garantizar la unión y la absorción en las células diana.

El sistema innato trabaja con el sistema inmunitario adaptativo para generar una respuesta contra la proteína codificada por ADN. Las secuencias CpG-S inducen la activación de células B policlonales y la regulación positiva de la expresión y secreción de citocinas. Los macrófagos estimulados secretan IL-12, IL-18, TNF-α, IFN-α, IFN-β e IFN-γ, mientras que las células B estimuladas secretan IL-6 y algo de IL-12.

La manipulación de las secuencias CpG-S y CpG-N en la columna vertebral del plásmido de las vacunas de ADN puede garantizar el éxito de la respuesta inmunitaria al antígeno codificado e impulsar la respuesta inmunitaria hacia un fenotipo TH1. Esto es útil si un patógeno requiere una respuesta TH para su protección. Las secuencias CpG-S también se han utilizado como adyuvantes externos para la vacunación con ADN y proteínas recombinantes con tasas de éxito variables. Otros organismos con motivos CpG hipometilados han demostrado la estimulación de la expansión de células B policlonales. El mecanismo detrás de esto puede ser más complicado que la simple metilación: no se ha encontrado que el ADN murino hipometilado genere una respuesta inmune.

La mayor parte de la evidencia de las secuencias CpG inmunoestimuladoras proviene de estudios murinos. La extrapolación de estos datos a otras especies requiere precaución: las especies individuales pueden requerir diferentes secuencias flanqueantes, ya que las especificidades de unión de los receptores carroñeros varían entre especies. Además, especies como los rumiantes pueden ser insensibles a las secuencias inmunoestimuladoras debido a su gran carga gastrointestinal.

Mejoras alternativas

Las respuestas inmunitarias basadas en el ADN se pueden potenciar mediante la administración de proteína recombinante o poxvirus recombinantes. "Principal-refuerzo" Las estrategias con proteína recombinante han aumentado con éxito tanto el título de anticuerpos neutralizantes como la avidez y persistencia de los anticuerpos para inmunógenos débiles, como la proteína de la cubierta del VIH-1. Se ha demostrado que los refuerzos de virus recombinantes son muy eficaces para potenciar las respuestas de CTL cebadas por ADN. El cebado con ADN enfoca la respuesta inmunitaria en el inmunógeno requerido, mientras que el refuerzo con el virus recombinante proporciona una mayor cantidad de antígeno expresado, lo que conduce a un gran aumento en las respuestas específicas de CTL.

Las estrategias de refuerzo primario han tenido éxito en la inducción de protección contra el desafío de la malaria en una serie de estudios. Los ratones cebados con ADN plasmídico que codifica la proteína de superficie de circunsporozoito de Plasmodium yoelii (PyCSP), luego reforzados con un virus vaccinia recombinante que expresa la misma proteína, tenían niveles significativamente más altos de anticuerpos, actividad de CTL e IFN-γ, y por lo tanto más altos. niveles de protección, que los ratones inmunizados y reforzados con ADN plasmídico solo. Esto se puede mejorar aún más cebando con una mezcla de plásmidos que codifican PyCSP y GM-CSF murino, antes de reforzar con el virus vaccinia recombinante. Una estrategia efectiva de refuerzo para el modelo de malaria en simios P. knowlesi también ha sido demostrado. Se prepararon monos Rhesus con una vacuna de ADN multicomponente y multietapa que codifica dos antígenos de la etapa hepática: la proteína de superficie del circunsporozoíto (PkCSP) y la proteína de superficie del esporozoíto 2 (PkSSP2), y dos antígenos de la etapa sanguínea: la proteína de superficie del merozoíto apical 1 (PkAMA1) y proteína de superficie de merozoito 1 (PkMSP1p42). Luego fueron reforzados con un virus canarypox recombinante que codifica los cuatro antígenos (ALVAC-4). Los monos inmunizados desarrollaron anticuerpos contra esporozoitos y eritrocitos infectados, y respuestas de células T secretoras de IFN-γ contra péptidos de PkCSP. Se logró una protección parcial contra el desafío con esporozoítos y se redujo significativamente la parasitemia media, en comparación con los monos de control. Estos modelos, aunque no son ideales para la extrapolación a P. falciparum en humanos, será importante en los ensayos preclínicos.

Mejora de las respuestas inmunitarias

ADN

La eficiencia de la inmunización con ADN se puede mejorar estabilizando el ADN contra la degradación y aumentando la eficiencia de la entrega de ADN en las células presentadoras de antígenos. Esto se ha demostrado al recubrir micropartículas catiónicas biodegradables (como poli(láctido-co-glicólido) formulado con bromuro de cetiltrimetilamonio) con ADN. Tales micropartículas recubiertas de ADN pueden ser tan efectivas para generar CTL como los virus recombinantes, especialmente cuando se mezclan con alumbre. Las partículas de 300 nm de diámetro parecen ser más eficientes para la absorción por parte de las células presentadoras de antígenos.

Vectores de alfavirus

Se han utilizado vectores basados en alfavirus recombinantes para mejorar la eficacia de la vacunación con ADN. El gen que codifica el antígeno de interés se inserta en el replicón del alfavirus, reemplazando los genes estructurales pero dejando intactos los genes de replicasa no estructurales. El virus Sindbis y el virus Semliki Forest se han utilizado para construir replicones de alfavirus recombinantes. A diferencia de las vacunas de ADN convencionales, los vectores de alfavirus matan las células transfectadas y solo se expresan de forma transitoria. Los genes de replicasa de alfavirus se expresan además del inserto de vacuna. No está claro cómo los replicones de alfavirus generan una respuesta inmunitaria, pero puede deberse a los altos niveles de proteína expresados por este vector, las respuestas de citoquinas inducidas por replicón o la apoptosis inducida por replicón que conduce a una mayor captación de antígeno por parte de las células dendríticas.