Uridina monofosfato sintasa
La enzima uridina monofosfato sintasa (EC 4.1.1.23, UMPS) (orotato fosforribosil transferasa y orotidina-5'-descarboxilasa) cataliza la formación de monofosfato de uridina (UMP), una molécula portadora de energía en muchas vías biosintéticas importantes. En humanos, el gen que codifica esta enzima se encuentra en el brazo largo del cromosoma 3 (3q13).
Estructura y función
Esta enzima bifuncional tiene dos dominios principales, una subunidad de orotato fosforribosiltransferasa (OPRTasa, EC 2.4.2.10) y una subunidad de orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (ODCase, EC 4.1.1.23). Estos dos sitios catalizan los dos últimos pasos de la ruta biosintética del monofosfato de uridina (UMP) de novo. Después de la adición de ribosa-P al orotato mediante OPRTasa para formar orotidina-5'-monofosfato (OMP), la OMP se descarboxila para formar uridina monofosfato mediante ODCasa. En los microorganismos, estos dos dominios son proteínas separadas, pero en los eucariotas multicelulares, los dos sitios catalíticos se expresan en una sola proteína, la uridina monofosfato sintasa.
UMPS existe en varias formas, dependiendo de las condiciones externas. Las UMPS monoméricas in vitro, con un coeficiente de sedimentación S20,w de 3,6 se convertirán en un dímero, S20,w = 5,1 después de la adición de aniones como el fosfato. En presencia de OMP, el producto de la OPRTasa, el dímero cambia a una forma de sedimentación más rápida S20,w 5.6. Estas formas conformacionales separadas exhiben diferentes actividades enzimáticas, con el monómero UMP sintasa mostrando baja actividad descarboxilasa, y solo el dímero 5.6 S exhibiendo actividad descarboxilasa completa.
Se cree que los dos sitios catalíticos separados se fusionaron en una sola proteína para estabilizar su forma monomérica. La unión covalente en UMPS estabiliza los dominios que contienen los respectivos centros catalíticos, mejorando su actividad en organismos multicelulares donde las concentraciones tienden a ser 1/10 de las contrapartes separadas en procariotas. Otros microorganismos con enzimas separadas deben retener concentraciones más altas para mantener sus enzimas en su forma dimérica más activa.
Fusión
Los eventos de fusión entre OPRTasa y ODCasa, que han llevado a la formación de la enzima bifuncional UMPS, han ocurrido claramente en diferentes ramas del árbol de la vida. Por un lado, aunque la OPRTasa se encuentra en el extremo N y la ODCasa en el extremo C en la mayoría de los eucariotas (p. ej., Metazoa, Amoebozoa, Plantae y Heterolobosea), también se ha demostrado que existe la fusión invertida, es decir, OPRTasa en el extremo C y ODCasa en el extremo N (p. ej., protistas parásitos, tripanosomátidos y estramenópilas). Además, otros grupos eucariotas, como los hongos, conservan ambas enzimas como proteínas separadas.
Por muy importante que sea el orden de fusión, el origen evolutivo de cada dominio catalítico en UMPS también es objeto de estudio. Tanto OPRTasa como ODCasa han pasado a través de la transferencia lateral de genes, dando como resultado eucariotas & # 39; teniendo enzimas de origen bacteriano y eucariótico. Por ejemplo, Metazoa, Amoebozoa, Plantae y Heterolobosea tienen ODCase y OPRTase eucariotas, mientras que Alveolata y stramenopiles tienen bacterias. También son posibles otros reordenamientos, ya que los hongos tienen OPRTasa bacteriana y ODCasa eucariótica, mientras que los cinetoplástidos tienen la combinación inversa.
Fusionando tanto el orden de fusión como el origen evolutivo, los organismos acaban fusionando UMPS donde uno de sus dominios catalíticos proviene de bacterias y el otro de eucariotas.
La fuerza impulsora de estos eventos de fusión parece ser la estabilidad térmica adquirida. Homo sapiens Las actividades OPRTasa y ODCasa disminuyen en mayor medida cuando se calientan que la proteína fusionada.
Para determinar la fuerza impulsora de la asociación de proteínas, se han realizado varios experimentos separando ambos dominios y cambiando el péptido conector que los mantiene unidos. En Plasmodium falciparum, el complejo OPRTase-OMPDCase aumenta la estabilidad cinética y térmica en comparación con las enzimas monofuncionales. En H. sapiens, aunque los dominios separados y fusionados tienen una actividad similar, los primeros tienen una mayor sensibilidad a las condiciones que promueven la disociación de monómeros. Además, el péptido enlazador se puede eliminar sin inactivar la catálisis. En Leishmania donovani, la OPRTasa separada no tiene actividad detectable, posiblemente debido a una menor estabilidad térmica oa la falta de su péptido enlazador.
Regulación
UMPS está sujeta a una regulación compleja por parte de OMP, el producto de su OPRTasa y el sustrato de la ODCase. OMP es un activador alostérico de la actividad descarboxilasa de OMP. A bajas concentraciones de enzima y bajas concentraciones de OMP, la OMP descarboxilasa muestra una cooperatividad negativa, mientras que a concentraciones más altas de OMP, la enzima muestra una cooperatividad positiva. Sin embargo, cuando las concentraciones de enzima son más altas, esta cinética compleja no se manifiesta. La actividad de orotato PRtasa se activa con bajas concentraciones de OMP, fosfato y ADP.
Mecanismo
OPRTasa
P. falciparum OPRTase sigue una ruta aleatoria en la síntesis y degradación de OMP. Los análisis del estado de transición han utilizado efectos isotópicos y cálculos cuánticos para revelar una estructura de orotato dianiónico completamente disociada, un ribocatión y una molécula de pirofosfato nucleófilo. No obstante, esto es inesperado, ya que la mayoría de las N-ribosiltransferasas involucran grupos salientes protonados y neutros, mientras que el orotato desprotonado no es bueno en el estado de transición catiónico.
La OPRTasa, como miembro de las PRTasas de tipo I, tiene un bucle prominente junto a su sitio activo. Es flexible en su estado abierto y apenas se puede ver en los mapas electrónicos de densidad para algunas OPRTasas. Para que ocurra la catálisis, debe existir un dímero en el que un bucle de una subunidad cubra el sitio activo de la otra. En Salmonella typhimurium, se crea un nuevo par de hojas β antiparalelas y se forman cinco nuevos contactos interatómicos en el asa, entre el asa y el resto de la proteína y entre el asa y los ligandos.
Hay dos posibilidades en lo que se refiere al movimiento del bucle: podría moverse de manera rígida o podría provenir de una estructura desordenada que adquiere orden. El segundo escenario parece más probable que ocurra en OPRTase. Debe haber un balance de energía entre el nuevo orden del péptido y la formación de enlaces de hidrógeno en el bucle, entre el bucle y el resto de la proteína, y entre el bucle y los ligandos. Hay un equilibrio de 30:1 entre las estructuras cerradas y abiertas en el complejo enzima-Mg-PRPP, lo que sugiere que se favorece la conformación cerrada.
Se han propuesto varias funciones para los residuos del bucle catalítico. En primer lugar, parece haber una correlación entre el movimiento del bucle y el posicionamiento de la catálisis del sustrato. En la reacción biológica, una transferencia de protones a la molécula de pirofosfato (PPi) podría minimizar la acumulación de carga negativa aunque el pKa para PPi sea 9. Lys26, His105 y Lys103 son candidatos para esta transferencia a la posición de fosfato α. Sin embargo, podría no ser el caso, ya que las cadenas laterales y el ion metálico podrían neutralizar parte de la carga negativa del PPi producido. La estabilización geométrica del estado de transición también podría obtenerse mediante la participación en bucle.
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Callahan &erio; Miller (2007) resume los mecanismos de ODCase en tres propuestas. El primero es la activación del carboxilo del sustrato a través del estrés electrostático. La unión del grupo fosforilo implica la yuxtaposición entre el grupo carboxilato y un residuo de Asp cargado negativamente (a saber, Asp91 en Saccharomyces cerevisiae). La repulsión entre las cargas negativas elevaría el valor de la energía cerca del estado de transición. No obstante, los análisis cristalográficos y la falta de S. cerevisiae la afinidad de la enzima a los análogos de sustrato donde los grupos carboxilato se reemplazan por un sustituyente catiónico han mostrado alguna evidencia en contra de esta teoría.
También se ha considerado la protonación de OMP en O4 u O2 antes de la descarboxilación, que implica la formación de iluros en N1. La ausencia de donantes de protones cerca de O4 u O2 en las estructuras cristalográficas es evidencia en su contra, junto con la exclusión de la generación de iluro como paso limitante en los experimentos con 15N. Además, han surgido dudas sobre la viabilidad del intermedio protonado debido a la ausencia de estabilizadores electrónicos. Como consecuencia, se ha propuesto la ruptura del enlace entre C6 y C7 debido a la protonación del primero pasando por un estado carbaniónico.
Finalmente, la catálisis podría tener lugar por simple atracción electrostática. La formación de carbaniones C6 crearía interacciones dipolares con una Lys catiónica del sitio activo. Esto no explica el aumento de velocidad en comparación con el proceso no catalizado.
Importancia clínica
Una deficiencia de UMP sintasa puede provocar un trastorno metabólico llamado aciduria orótica.
La deficiencia de esta enzima es un rasgo autosómico recesivo heredado en el ganado Holstein y causará la muerte antes del nacimiento.
La deficiencia de la enzima se puede estudiar en el organismo modelo Caenorhabditis elegans. La cepa rad-6 tiene un codón de parada prematuro que elimina el dominio orotidina 5'-descarboxilasa de la proteína; este dominio no se encuentra en ninguna otra proteína codificada por el genoma. La cepa tiene un fenotipo pleiotrópico que incluye viabilidad y fertilidad reducidas, crecimiento lento y sensibilidad a la radiación.
Importancia farmacológica
UMPS y sus dos dominios separados, ODCasa y OPRTasa, han demostrado ser esenciales para la viabilidad en parásitos del taxón Chromoalveolata como L. donovani o P. falciparum. Dado que UMPS, ODCasa y OPRTasa son diferentes entre organismos, se han realizado investigaciones sobre inhibidores específicos de especies.
Inhibición
OPRTasa
Los estudios sobre la inhibición de la OPRTasa se basan en análogos de sustrato. En Mycobacterium tuberculosis, dos de los inhibidores más prometedores son el ácido 2,6-dihidroxipiridina-4-carboxílico y el 3-bencilideno-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahidropiridina-4 -ácido carboxílico. La entalpía de unión y la entropía de este último corresponden a ligandos de alta afinidad. Se están estudiando propiedades como la lipofilia, la solubilidad, la permeabilidad y las constantes de equilibrio.
También se han utilizado productos de selenilación. Abdo et al. (2010) realizaron reacciones en ácido 2-etoxietanselénico usando sustratos aromáticos ricos en electrones para producir (2-etoxietil)seleno éteres. Estos son capaces de convertirse en productos aril-selenilados como la familia 5-uridinil, que ha mostrado inhibición a concentraciones submicromolares en P. falciparum y H. sapiens.
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Los inhibidores de ODCasa también provienen de análogos de sustrato, como modificaciones en los anillos OMP o UMP. En H. sapiens, la ODCasa ha sido inhibida por compuestos de haluro derivados de UMP (p. ej., 5-FUMP, 5-BrUMP, 5-IUMP y 6-IUMP).
En Methanobacterium thermoautotrophicum, se ha aplicado una estrategia diferente, modificando ligandos de interacción débil como citidina-5'-monofosfato, que deriva en barbitúrico ribonucleósido-5'-monofosfato, xantosina-5'-monofosfato. P. falciparum ODCasa ha sido inhibida con éxito por modificaciones en citidina-5'-monofosfato N3 y N4.
Mapa interactivo de rutas
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- ^ El mapa interactivo se puede editar en WikiPathways: "FluoropyrimidineActivity_WP1601".
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