Unidad de formación de Colonia

En microbiología, unidad formadora de colonias (UFC, ufc o UFC) es una unidad que estima el número de células microbianas (bacterias, hongos, virus, etc.) en una muestra que sean viables, capaces de multiplicarse mediante fisión binaria en condiciones controladas. Para contar las unidades formadoras de colonias es necesario cultivar los microbios y contar sólo las células viables, a diferencia del examen microscópico que cuenta todas las células, vivas o muertas. La apariencia visual de una colonia en un cultivo celular requiere un crecimiento significativo y, al contar las colonias, no se sabe si la colonia surgió de una célula o de un grupo de células. Expresar los resultados como unidades formadoras de colonias refleja esta incertidumbre.

Teoría

El propósito del recuento en placa es estimar el número de células presentes en función de su capacidad para dar lugar a colonias en condiciones específicas de medio nutritivo, temperatura y tiempo. Teóricamente, una célula viable puede dar lugar a una colonia mediante replicación. Sin embargo, las células solitarias son una excepción en la naturaleza y lo más probable es que el progenitor de la colonia fuera una masa de células depositadas juntas. Además, muchas bacterias crecen en cadenas (p. ej., estreptococos) o grupos (p. ej., estafilococos). La estimación del número de microbios mediante UFC, en la mayoría de los casos, subestimará el número de células vivas presentes en una muestra por estos motivos. Esto se debe a que el recuento de UFC supone que cada colonia está separada y fundada por una única célula microbiana viable.

El recuento en placa es lineal para E. coli en el rango de 30 a 300 UFC en una placa de Petri de tamaño estándar. Por lo tanto, para garantizar que una muestra produzca UFC en este rango es necesario diluir la muestra y sembrar en placas varias diluciones. Normalmente, se utilizan diluciones diez veces mayores y la serie de diluciones se siembra en réplicas de 2 o 3 en el rango de diluciones elegido. A menudo se siembran en placas 100 µL, pero también se utilizan cantidades mayores, de hasta 1 ml. Los volúmenes de recubrimiento más altos aumentan los tiempos de secado, pero a menudo no dan como resultado una mayor precisión, ya que pueden ser necesarios pasos de dilución adicionales. Las UFC/placa se leen de una placa en el rango lineal y luego las UFC/g (o UFC/mL) del original se deducen matemáticamente, teniendo en cuenta la cantidad sembrada y su factor de dilución.

Una ventaja de este método es que diferentes especies microbianas pueden dar lugar a colonias que son claramente diferentes entre sí, tanto microscópica como macroscópicamente. La morfología de la colonia puede ser de gran utilidad en la identificación del microorganismo presente.

Una comprensión previa de la anatomía microscópica del organismo puede brindar una mejor comprensión de cómo las UFC/mL observadas se relacionan con la cantidad de células viables por mililitro. Alternativamente, en algunos casos es posible disminuir el número promedio de células por UFC agitando la muestra antes de realizar la dilución. Sin embargo, muchos microorganismos son delicados y sufrirían una disminución en la proporción de células viables si se colocaran en un vórtice.

Notación de registro

Las concentraciones de unidades formadoras de colonias se pueden expresar usando notación logarítmica, donde el valor mostrado es el logaritmo en base 10 de la concentración. Esto permite calcular la reducción logarítmica de un proceso de descontaminación como una simple resta.

Usos

Las unidades formadoras de colonias se utilizan para cuantificar los resultados en muchos métodos de recuento y siembra en placas microbiológicas, incluidos:

• El método de la placa de verter donde la muestra se suspende en un plato Petri usando agar molten refrigerado a aproximadamente 40–45 °C (justo por encima del punto de solidificación para minimizar la muerte celular inducida por calor). Después de que el agar nutriente solidifica la placa está incubada.
• El método de la placa de diseminación donde la muestra (en un pequeño volumen) se disemina a través de la superficie de una placa de agar nutriente y permite secar antes de la incubación para contar.
• El método de filtro de membrana en el que se filtra la muestra a través de un filtro de membrana, luego el filtro colocado en la superficie de una placa de agar de nutrientes (lado de la bacteria hacia arriba). Durante la incubación los nutrientes se extienden a través del filtro para apoyar las células crecientes. Como la superficie de la mayoría de los filtros es menor que la de un plato estándar Petri, la gama lineal del recuento de placa será menor.
• Los métodos Miles y Misra o método de gota-plate en el que un ali muy pequeño (generalmente unos 10 microlitros) de la muestra de cada dilución en serie se deja caer sobre un plato Petri. El plato de gota debe ser leído mientras que las colonias son muy pequeñas para prevenir la pérdida de la CFU mientras crecen juntas.

Sin embargo, con las técnicas que requieren el uso de una placa de agar, no se puede utilizar ninguna solución líquida porque no se puede identificar la pureza de la muestra y no es posible contar las células una por una en el líquido.

Herramientas para contar colonias

El recuento de colonias se realiza tradicionalmente de forma manual utilizando un bolígrafo y un contador de clics. Esta es generalmente una tarea sencilla, pero puede resultar muy laboriosa y consumir mucho tiempo cuando es necesario enumerar muchas placas. Alternativamente, se pueden utilizar soluciones semiautomáticas (software) y automáticas (hardware + software).

Software para contar UFC

Las colonias se pueden enumerar a partir de fotografías de placas utilizando herramientas de software. Los experimentadores generalmente toman una fotografía de cada placa que necesitan contar y luego analizan todas las imágenes (esto se puede hacer con una simple cámara digital o incluso una cámara web). Dado que se necesitan menos de 10 segundos para tomar una sola fotografía, a diferencia de varios minutos para contar las UFC manualmente, este método generalmente ahorra mucho tiempo. Además, es más objetivo y permite extraer otras variables como el tamaño y color de las colonias.

• OpenCFU es un programa gratuito y de código abierto diseñado para optimizar la amistad del usuario, la velocidad y la robustez. Ofrece una amplia gama de filtros y control, así como una moderna interfaz de usuario. OpenCFU está escrito en C++ y utiliza OpenCV para el análisis de imágenes.
• NICE es un programa escrito en MATLAB que proporciona una manera fácil de contar colonias de imágenes.
• ImageJ y CellProfiler: Algunas imágenes Macros y plugins J y algunos oleoductos CellProfiler se pueden utilizar para contar colonias. Esto a menudo requiere que el usuario cambie el código para lograr un flujo de trabajo eficiente, pero puede ser útil y flexible. Un problema principal es la ausencia de GUI específico que puede hacer la interacción con los algoritmos de procesamiento tedious.

Además del software basado en computadoras de escritorio tradicionales, hay aplicaciones disponibles para dispositivos Android e iOS para el recuento de colonias automatizado y semiautomático. La cámara integrada se utiliza para tomar fotografías de la placa de agar y se utiliza un algoritmo interno o externo para procesar los datos de las imágenes y estimar el número de colonias.

Sistemas automatizados

Muchos de los sistemas automatizados se utilizan para contrarrestar el error humano, ya que muchas de las técnicas de investigación realizadas por humanos que cuentan células individuales tienen una alta probabilidad de error. Debido al hecho de que los investigadores cuentan regularmente las células manualmente con la ayuda de una luz transmitida, esta técnica propensa a errores puede tener un efecto significativo en la concentración calculada en el medio líquido principal cuando las células están en cantidades bajas.

Algunos fabricantes de biotecnología también ofrecen sistemas completamente automatizados. Por lo general, son costosos y no tan flexibles como el software independiente, ya que el hardware y el software están diseñados para funcionar juntos en una configuración específica. Alternativamente, algunos sistemas automáticos utilizan el paradigma del revestimiento en espiral.

Algunos de los sistemas automatizados como los sistemas de MATLAB permiten contar las células sin tener que teñirlas. Esto permite reutilizar las colonias para otros experimentos sin el riesgo de matar los microorganismos con tinciones. Sin embargo, una desventaja de estos sistemas automatizados es que es extremadamente difícil diferenciar entre los microorganismos con polvo o rayones en placas de agar sangre porque tanto el polvo como los rayones pueden crear una combinación muy diversa de formas y apariencias.

Unidades alternativas

En lugar de unidades formadoras de colonias, se pueden utilizar los parámetros Número más probable (MPN) y Unidades Fishman modificadas (MFU). El método del número más probable cuenta células viables y es útil cuando se enumeran concentraciones bajas de células o se enumeran microbios en productos donde las partículas hacen que el recuento en placa no sea práctico. Las unidades Fishman modificadas tienen en cuenta bacterias que son viables, pero no cultivables.