Tinción de Romanowsky

La tinción de Romanowsky (Romanowsky-Giemsa) es una técnica de tinción prototípica que fue la precursora de varias tinciones diferentes ampliamente utilizadas en hematología (estudio de la sangre) y citopatología (estudio de células enfermas). Las tinciones de tipo Romanowsky se usan durante el examen microscópico para diferenciar células en muestras patológicas, especialmente frotis de sangre y médula ósea, y para detectar parásitos en la sangre como la malaria.

Esta técnica utiliza mezclas de colorantes, generalmente azul de metileno y eosina Y, que brindan un alto contraste al teñir los componentes celulares. Los componentes ácidos de las células se tiñen de azul, mientras que los básicos toman tonos entre rosa y rojo. Esto permite estudiar en detalle la morfología celular, incluyendo núcleo, citoplasma y orgánulos.

Las tinciones relacionadas o derivadas de la tinción de tipo Romanowsky incluyen las tinciones de Giemsa, Jenner, Wright, Field, May-Grünwald, Pappenheim y Leishman. Cada una adaptada a diferentes tipos de muestras o propósitos diagnósticos, diferenciándose en protocolos y aditivos, aunque en la práctica sus nombres a menudo se confunden entre sí. La técnica de tinción lleva el nombre del médico ruso Dmitri Leonidovich Romanowsky (1861- 1921), quien en 1891 fue uno de los primeros en reconocer su potencial uso como tinción de sangre.

El desarrollo de esta técnica, representa un punto crucial para el avance de la hematología. Su facilidad de uso y la información valiosa que proporciona han convertido a la tinción de Romanowsky, y sus variaciones, en herramientas indispensables en la medicina de laboratorio.

Aplicaciones de la tinción de Romanowsky

• Diferenciación de células sanguíneas (glóbulos rojos, blancos y plaquetas) para análisis microscópico.
• Detección de parásitos en la sangre, como Plasmodium falciparum (causante de la malaria).
• Diagnóstico de enfermedades hematológicas como leucemia, anemia y trombocitopenia.
• Estudio de células en frotis de médula ósea.
• Evaluación de la maduración de las células sanguíneas en el estudio de la eritropoyesis y la leucopoyesis.
• Detección de inclusiones intracelulares, como los cuerpos de Howell-Jolly en la anemia ferropénica.
• Diagnóstico de enfermedades hemolíticas, como la esferocitosis hereditaria y la talasemia.
• Estudio de la morfología de los glóbulos rojos.
• Detección de células neoplásicas.

Preparación de la tinción

La tinción de Romanowsky emplea una mezcla de colorantes que incluye azul de metileno y eosina Y. La preparación de esta solución requiere de productos químicos especializados y debe realizarse con cuidado para garantizar resultados óptimos. En primer lugar, los colorantes en polvo se disuelven en metanol o etanol absoluto para alcanzar las concentraciones deseadas. Posteriormente, se mezclan las disoluciones de ambos colorantes en proporciones específicas según la variante de la tinción. Generalmente, las soluciones de los colorantes se mezclan en una proporción aproximada de 2 partes de azul de metileno por 1 parte de eosina Y.

La solución de Romanowsky debe madurar durante un tiempo variable dependiendo del tipo de tinción que se prepare; esto permite la formación de colorantes secundarios que mejoran la diferenciación celular. Antes de su uso, la solución suele filtrarse para evitar la presencia de precipitados que puedan interferir con la calidad de la tinción. Es importante destacar que, debido a la complejidad de la preparación y los estándares de seguridad necesarios, en muchos laboratorios se suele adquirir la solución de tinción de Romanowsky ya preparada para facilitar el proceso.

HSD

Mecanismo de acción

El valor de la tinción de Romanowsky radica en su capacidad para producir una amplia gama de tonos, lo que permite diferenciar fácilmente los componentes celulares. Este fenómeno se conoce como efecto Romanowsky, o más generalmente como metacromasia.

Efecto Romanowsky

 

Película de sangre manchada con Giemsa mostrando Plasmodium (centro de la imagen), el parásito que causa infecciones de malaria.

En 1891, Romanowsky desarrolló una tinción usando una mezcla de eosina (típicamente eosina Y) y soluciones envejecidas de azul de metileno que formaban tonalidades que no se pueden atribuir a los componentes de la tinción únicamente: tonalidades distintivas de púrpura en la cromatina del núcleo celular y dentro de los gránulos en el citoplasma de algunos glóbulos blancos. Esto se conoció como el efecto Romanowsky o Romanowsky-Giemsa. La eosina y el azul de metileno puro solos (o en combinación) no producen el efecto Romanowsky, y ahora se considera que las tinciones activas que producen el efecto son azur B y eosina.

Azul de metileno policromado

Las tinciones de tipo Romanowsky se pueden hacer a partir de una combinación de tintes puros o de azul de metileno que se ha sometido a desmetilación oxidativa, lo que da como resultado la descomposición del azul de metileno en muchas otras tinciones, algunas de las cuales son necesarias para producir el efecto Romanowsky. El azul de metileno que ha sufrido este proceso oxidativo se conoce como "azul de metileno policromado". El azul de metileno policromado puede contener hasta 11 tintes, incluidos azul de metileno, azul A, azul B, azul C, tionina, violeta de metileno Bernthesen, metil tionolina y tionolina. La composición exacta del azul de metileno policromado depende del método utilizado, e incluso los lotes del tinte del mismo fabricante pueden variar en composición.

Aunque se ha demostrado que el azur B y la eosina son los componentes necesarios para producir el efecto Romanowsky, estos colorantes en sus formas puras no siempre se han utilizado en la formulación de las soluciones colorantes. Las fuentes originales de azur B (uno de los productos de oxidación del azul de metileno) procedían de soluciones de azul de metileno policromadas, que se trataban con agentes oxidantes o se dejaban envejecer naturalmente en el caso de Romanowsky. Ernst Malachowsky en 1891 fue el primero en policromar deliberadamente el azul de metileno para su uso en una tinción de tipo Romanowsky.

Tipos de tinción de Romanowsky

Mayo-Grünwald-Giemsa

La tinción de May-Grünwald-Giemsa es un procedimiento de dos pasos que incluye la primera tinción con la tinción de May-Grünwald, que no produce el efecto Romanowsky, seguida de la tinción con la tinción de Giemsa que sí produce el efecto Romanowsky.

Tinciones de Wright y Wright-Giemsa

La tinción de Wright se puede usar sola o en combinación con la tinción de Giemsa, que se conoce como tinción de Wright-Giemsa. La tinción de Wright lleva el nombre de James Homer Wright, quien en 1902 publicó un método que usa calor para producir azul de metileno policromado, que se combina con eosina Y. El azul de metileno policromado se combina con eosina y se deja precipitar, formando un eosinato que se vuelve a disolver en metanol. La adición de Giemsa a la tinción de Wright aumenta el brillo del color "rojizo-púrpura" color de los gránulos citoplasmáticos. Las tinciones de Wright y Wright-Giemsa son dos de las tinciones de tipo Romanowsky de uso común en los Estados Unidos y se utilizan principalmente para teñir películas de sangre y médula ósea.

Tinción de Leishman

En 1901, William Leishman desarrolló una tinción similar a la de Louis Jenner pero reemplazando el azul de metileno puro por azul de metileno policromado. La tinción de Leishman se prepara a partir del eosinato de azul de metileno policromado y eosina Y utilizando metanol como disolvente.

Tinción de Giemsa

La tinción de Giemsa se compone de "Azure II" y eosina Y con metanol y glicerol como disolvente. "Azure II" se cree que es una mezcla de azur B (que Giemsa llamó "azur I") y azul de metileno, aunque la composición exacta de "azur I" se considera un secreto comercial. Se han publicado formulaciones comparables que usan tintes conocidos y están disponibles comercialmente. La tinción de Giemsa se considera la tinción estándar para la detección e identificación del parásito de la malaria.

Importancia clínica de la tinción

Patología de la sangre y la médula ósea

 

Espécimen de lavaje Bronchoalveolar manchado con Diff-Quik, una variante comercial de la mancha Romanowsky ampliamente utilizada en la citopatología

Las manchas de tipo Romanowsky se usan ampliamente en el examen de la sangre, en forma de películas de sangre y en el examen microscópico de biopsias de médula ósea y manchas aspiradas. El examen de la sangre y la médula ósea puede ser importante en el diagnóstico de una variedad de enfermedades sanguíneas. En los Estados Unidos, las variantes Wright y Wright-Giemsa de las manchas de tipo Romanowsky se usan ampliamente, mientras que en Europa se emplea comúnmente la tinción de Giemsa.

Detección de malaria y otros parásitos

De las tinciones de tipo Romanowsky, la tinción de Giemsa es especialmente importante en la detección e identificación de parásitos de la malaria en muestras de sangre. Las pruebas de detección del antígeno de la malaria son una alternativa a la tinción y el examen microscópico de extensiones de sangre para la detección de la malaria.

Uso en citopatología

Las tinciones de tipo Romanowsky también se utilizan para la tinción de muestras citopatológicas, como las producidas a partir de aspirados con aguja fina y líquido cefalorraquídeo de punciones lumbares.

Historia de la tinción de Romanowsky

Dmitri Leonidovich Romanowsky (1861-1921).

Aunque existe un debate sobre quién merece crédito por este método general de tinción, el uso popular lo atribuye a Dmitri Leonidovich Romanowsky.

En la década de 1870, Paul Ehrlich utilizó una mezcla de colorantes ácidos y básicos, incluida la fucsina ácida (colorante ácido) y el azul de metileno (colorante básico) para examinar extensiones de sangre. En 1888, Cheslav Ivanovich Chenzinsky utilizó azul de metileno, pero sustituyó la fucsina ácida utilizada por Ehrlich por eosina. La combinación de tinción de Chenzinsky pudo teñir el parásito de la malaria (un miembro del género Plasmodium). Ni la tinción de Ehrlich ni la de Chenzinsky produjeron el efecto Romanowsky ya que el azul de metileno que utilizaron no estaba policromado.

Dmitri Romanowsky en 1890 publicó los resultados preliminares de su mancha de sangre (una combinación de azul de metileno envejecido y eosina), incluidos los resultados cuando se aplicó a sangre infectada con paludismo. Este uso de azul de metileno policromado diferenció la tinción de Romanowsky (y las formulaciones posteriores) de las de Ehrlich y Chenzinsky, que carecían del tono púrpura asociado con el efecto Romanowsky. La publicación de Romanowsky de 1890 no incluía una descripción de cómo modificó su solución de azul de metileno, pero en su tesis doctoral de 1891 describió mejor el uso del azul de metileno después de que comenzó a formarse moho en la superficie. Aparte del uso de una solución de azul de metileno envejecido, la tinción de Romanowsky se basó en la técnica de tinción de Chenzinsky. El uso de Romanowsky de su método para estudiar el parásito de la malaria se ha atribuido al continuo interés en su método de tinción.

Ernst Malachowsky

A Ernst Malachowsky se le atribuye la observación independiente de la misma combinación de manchas que Dmitri Romanowsky en 1891, aunque también se le atribuye ser el primero en hacerlo. Malachowsky fue el primero en utilizar una solución de azul de metileno policromada deliberadamente, lo que Malachowsky logró mediante la adición de bórax a la mezcla de tinción. Se informa que Malachowsky hizo una demostración de la mancha el 15 de junio de 1890 y ese mismo año publicó un artículo "describiendo su demostración pública". Tanto el método de Romanowsky como el de Malachowsky fueron capaces de teñir el núcleo y el citoplasma del parásito de la malaria, cuando hasta este punto las tinciones utilizadas sólo habían teñido el citoplasma.

Gustav Giemsa.

En 1899, Louis Leopold Jenner desarrolló una versión más estable de la tinción de azul de metileno y eosina recolectando el precipitado que se forma en mezclas a base de agua y redislándola en metanol. Las manchas de tipo Romanowsky preparadas a partir de los precipitados recolectados a veces se conocen como eosinates . Además de aumentar la estabilidad de la mancha, el uso de metanol en la mancha de Jenner tuvo el efecto de fijar las muestras de sangre, aunque la versión de la mancha de Jenner no produce el efecto Romanowsky.

Richard May y Ludwig Grünwald en 1892 publicaron una versión de la mancha (ahora conocida como la mancha de mayo -Grünwald) que es similar a la versión propuesta por Jenner en 1899, y también no produce el efecto Romanowsky.

En 1901, tanto Karl Reuter como William Leishman desarrollaron manchas que combinaron el uso de alcohol de Louis Jenner como el uso de solvente y azul de metileno policromado. La mancha de Reuter difería de Jenner en el uso de alcohol etílico en lugar de metanol, y Leishman difería de Jenner usando Eosin B en lugar de Eosin Y.

James Homer Wright en 1902 publicó un método que usa calor para policromo el azul de metileno, que combinó con Eosin Y. Esta técnica se conoce como mancha de Wright.

El nombre de Gustav Giemsa también se ha asociado con la mancha, ya que se le atribuye la publicación de una formulación y protocolo útiles en 1902. Giemsa intentó usar combinaciones de colorantes puros en lugar de soluciones de azul metileno policromado que son altamente variables en composición. Giemsa vendió los derechos para producir su mancha, pero nunca publicó detalles sobre cómo la produjo, aunque se cree que usó una combinación de Azure B y Metileno Azul. Giemsa publicó una serie de modificaciones de sus manchas entre 1902 y 1934. En 1904 sugirió agregar glicerina a su mancha, junto con el metanol, para aumentar su estabilidad.

Los colorantes en polvo de Giemsa producidos en Alemania se utilizaron ampliamente en los Estados Unidos hasta la interrupción del suministro durante la Primera Guerra Mundial, lo que provocó una mayor utilización del método de James Homer Wright para policromar el azul de metileno.