Tinción de Leishman

La tinción de Leishman, también conocida como tinción de Leishman, se utiliza en microscopía para teñir frotis de sangre. Generalmente se utiliza para diferenciar e identificar glóbulos blancos, parásitos de la malaria y tripanosomas. Se basa en una mezcla metanólica de minerales "policromados". azul de metileno (es decir, desmetilado en varios azules) y eosina. La solución madre metanólica es estable y también sirve para fijar directamente el frotis eliminando un paso de prefijación. Si se prepara una solución de trabajo mediante dilución con un tampón acuoso, la mezcla resultante es muy inestable y no se puede utilizar por mucho tiempo. La tinción de Leishman lleva el nombre de su inventor, el patólogo escocés William Boog Leishman. Es una versión de la tinción de Romanowsky y, por lo tanto, es similar y parcialmente reemplazable por la tinción de Giemsa, la tinción de Jenner y la tinción de Wright.

Preparación y almacenamiento

Muchas empresas venden Leishman Stain en forma de polvo seco, que luego se reconstituye con metanol. El calor y la luz brillante oxidan la mancha y provocan la precipitación de precipitados insolubles, como violeta de metileno (Bernthsen) o sales de eosinato de azur.

Ventajas y desventajas

Ventajas

Según el libro de texto de Sir John Vivian Dacie, Hematología práctica, "entre las tinciones de Romanowsky que se utilizan actualmente, la de Jenner es la más sencilla y la de Giemsa. Es el más complejo. La tinción de Leishman, que ocupa una posición intermedia, todavía se utiliza ampliamente en la tinción de rutina."

El protocolo de la OMS menciona:

Hay varias combinaciones diferentes de estos tintes que varían en sus características de mancha. May-Grunwald-Giemsa es un buen método para el trabajo de rutina. La mancha de Wright es un método más simple, mientras que la de Leishman es también un método simple que es especialmente adecuado cuando se requiere urgentemente una película de sangre manchada o la mancha rutinaria no está disponible (por ejemplo, por la noche). La mancha de campo es una mancha rápida utilizada principalmente en películas finas para parásitos malariales. Cualquier método que se utilice, es importante seleccionar los tintes que no estén contaminados con otros tintes o sales metálicas.

Sir William Boog Leishman de Londres y Karl Reuter de Alemania descubrieron de forma independiente en 1901 lo que se considera "quizás las modificaciones más prácticas de la tinción de Malachowski" Adoptaron los mejores aspectos de las tinciones desarrolladas por Malachowski y Jenner, es decir, utilizaron azul de metileno policromado (realizado accidentalmente por Romanowsky, que recibió el nombre, realizado sistemáticamente por Ernst Malachowski incluso antes de Romanowsky, y redescubierto por Bernhard Nocht, pero desconocido para Jenner, May, Grunwald y muchos otros que usaron azul de metileno simple) y filtrar el precipitado de eosinato de azur de la mezcla acuosa y volver a disolverlo en un solvente alcohólico (sabiduría de Jenner). Las diferencias entre los métodos de Leishman y Reuters fueron: Leishman usó metanol (como Jenner) y sustituyó la eosina Y por eosina B, mientras que Reuter usó alcohol etílico y destacó con razón la importancia de usar un solvente absolutamente puro. Ambos métodos produjeron una tinción estable y el color púrpura deseado.

Buen contraste

La tinción de Leishman generalmente muestra el color violeta brillante del núcleo y los gránulos de neutrófilos, por lo que el recuento diferencial resulta conveniente y hace que la calidad de la tinción sea mejor que las tinciones que son simples a base de azul de metileno y eosina, que no producen suficiente contraste entre los citoplasma y el núcleo. Dado que Leishman, al igual que otras tinciones de Romanowsky, tiñen mejor los detalles citoplasmáticos y los gránulos, los hematólogos generalmente las prefieren (sin embargo, consulte más adelante sobre los citólogos). En comparación con los costosos y tóxicos reactivos sintéticos puros basados en AZure B y Eosin Y utilizados por los métodos de referencia ICSH, que tampoco están exentos de la desventaja de oxidarse y eventualmente dar un tono gris en lugar de los colores azules óptimos para el citoplasma, Leishman es una opción barata. Técnica fácilmente disponible y fácil de realizar que proporciona un contraste bastante aceptable.

Buena sensibilidad al parásito de la malaria

Se ha documentado que la tinción de Leishman es más sensible que la tinción de Field y tan buena como las tinciones fluorescentes para la detección del parásito de la malaria.

Desventajas

Dificultad para controlar la relación molar

La composición del azul de metileno policromado mezclado con Eosina nunca es tan buena como las proporciones directamente pesadas y mezcladas en los tintes tipo Giemsa. Albert Plehn en 1890 había descubierto que la proporción molar de colorantes básicos a ácidos debía aumentarse de 2:1 a 3:1, sin embargo, a partir de la época de Jenners (1899) el uso de cristales de eosinato de azur devolvió la proporción a un nivel insatisfactorio. 2:1 y la profundidad del color se hizo menor. Sólo el trabajo de Gustav Giemsa y similares, que nuevamente controlaron manualmente la proporción de estos dos componentes, devolvió la profundidad de la tinción. Sin embargo, Giemsa y otros que controlaron artificialmente la proporción a veces llegaron al otro extremo (un gran exceso molar de Azure hasta una proporción de 16,1), lo que probablemente era innecesario. según ICSH, la proporción óptima es de 6,5 a 7,3.

Inestabilidad

La tinción de Leishman, si se reconstituye con tampón, se vuelve muy inestable (en contraste con Giemsa, que es relativamente más estable debido al glicerol, o las tinciones de referencia ICSH que usan metanol + DMSO en una proporción de 6:4 v/v) y comienza a precipitar y necesita filtrado repetido. Si no se supervisa cuidadosamente, la absorción de agua, la evaporación del metanol de un recipiente abierto y el filtrado repetido cambian la composición y requieren cambios frecuentes y hacen que este método sea un desperdicio. Si no se filtran, los depósitos de precipitado en el frotis pueden confundirse con plaquetas. Es importante no agitar el frasco de tinte antes de usarlo; de lo contrario, los precipitados sedimentados se resuspenderían y se depositarían en las películas durante la tinción y provocarían numerosos artefactos y dificultarían mucho la microscopía.

El contraste citoplasmático es bueno, pero el contraste nuclear no es tan bueno como el H&E

Como todos los demás métodos de Malachowski-Romanowsky-Giemsa, se desvanece con el tiempo y no se puede archivar de forma estable por mucho tiempo. Además, sus homólogos anteriores tiñen los núcleos de color púrpura oscuro y los detalles de las características nucleares no son tan claros como el hematoxileno y la eosina, que por tanto son los preferidos por algunos citopatólogos. Pero de esa manera es un método complementario (ya que tiñe los detalles citoplasmáticos, los gránulos, etc. mejor que la tinción H&E).