Tinción de Hoechst

tinciones de Hoechst son parte de una familia de tintes fluorescentes azules que se utilizan para teñir el ADN. Estas bisbencimid fueron desarrolladas originalmente por Hoechst AG, que numeró todos sus compuestos de modo que el tinte Hoechst 33342 es el compuesto número 33.342 fabricado por la empresa. Hay tres tinciones de Hoechst relacionadas: Hoechst 33258, Hoechst 33342 y Hoechst 34580. Los tintes Hoechst 33258 y Hoechst 33342 son los más utilizados y tienen espectros de excitación-emisión similares.

Características moleculares

Ambos tintes son excitados por luz ultravioleta a alrededor de 350 nm, y ambos emiten luz fluorescente azul-cian alrededor de un espectro de emisión máximo a 461 nm. El tinte no unido tiene su máxima emisión de fluorescencia en el rango de 510 a 540 nm. Las tinciones de Hoechst se pueden excitar con una lámpara de arco de xenón o de mercurio o con un láser ultravioleta. Existe un cambio de Stokes considerable entre los espectros de excitación y emisión que hace que los tintes Hoechst sean útiles en experimentos en los que se utilizan múltiples fluoróforos. La intensidad de fluorescencia de los tintes Hoechst también aumenta con el pH del disolvente.

Los tintes Hoechst son solubles en agua y en disolventes orgánicos como la dimetilformamida o el dimetilsulfóxido. Se pueden alcanzar concentraciones de hasta 10 mg/ml. Las soluciones acuosas son estables entre 2 y 6 °C durante al menos seis meses cuando se protegen de la luz. Para el almacenamiento a largo plazo, las soluciones se congelan a -20 °C o menos.

Los colorantes se unen al surco menor del ADN bicatenario con preferencia por secuencias ricas en adenina y timina. Aunque los colorantes pueden unirse a todos los ácidos nucleicos, las cadenas de ADN bicatenario ricas en AT mejoran considerablemente la fluorescencia. Los colorantes Hoechst son permeables a las células y pueden unirse al ADN en células vivas o fijas. Por lo tanto, estas tinciones suelen denominarse supravitales, lo que significa que las células vivas sobreviven a un tratamiento con estos compuestos. Las células que expresan proteínas transportadoras de casetes de unión a ATP específicas también pueden transportar activamente estas tinciones fuera de su citoplasma.

Aplicaciones

Comúnmente se utiliza una concentración de 0,1 a 12 μg/ml para teñir el ADN de bacterias o células eucariotas. Las células se tiñen durante 1 a 30 minutos a temperatura ambiente o 37 °C y luego se lavan para eliminar el tinte no unido. Se puede observar una fluorescencia verde del tinte Hoechst no unido en muestras teñidas con demasiado tinte o que se lavan parcialmente. Los tintes Hoechst se utilizan a menudo como sustitutos de otra tinción de ácido nucleico llamada DAPI.

Las diferencias clave entre los tintes Hoechst y DAPI son:

• Los tintes Hoechst son menos tóxicos que DAPI, lo que garantiza una mayor viabilidad de las células manchadas.
• El grupo de etilo adicional en ciertos tintes de Hoechst (Hoechst 33342) los hace más permeables.
• Hay nuclei tintes que permiten la viabilidad de las células después de manchar.

Hoechst 33342 y 33258 se desactivan con bromodesoxiuridina (BrdU), que se utiliza comúnmente para detectar células en división. Hoechst 33342 exhibe una permeabilidad celular 10 veces mayor que H 33258. Las células pueden integrar BrdU en el ADN recién sintetizado como sustituto de la timidina. Cuando BrdU se integra en el ADN, se supone que el bromo deforma el surco menor, de modo que los colorantes Hoechst no pueden alcanzar su sitio de unión óptimo. La unión de los tintes Hoechst es aún más fuerte con el ADN sustituido con BrdU; sin embargo, no se produce ninguna fluorescencia. Los tintes Hoechst se pueden utilizar con BrdU para controlar la progresión del ciclo celular.

Los tintes Hoechst se utilizan habitualmente para teñir el ADN genómico en las siguientes aplicaciones:

• Microscopia de fluorescencia e inmunohistoquímica, a menudo con otros fluorofos
• Citometría lenta para contar o ordenar células. Un ejemplo es el uso de tintes de Hoechst para analizar cuántas células de una población son en qué fase del ciclo celular
• Detectar ADN en presencia de ARN en geles de agarose
• Determinación automatizada del ADN
• Clasificación cromosómica

El eflujo de Hoechst también se utiliza para estudiar células madre hematopoyéticas y embrionarias. Como estas células son capaces de expulsar eficazmente el tinte, pueden detectarse mediante citometría de flujo en lo que se denomina población lateral. Esto se hace pasando la fluorescencia emitida por el hoechst excitado a través de filtros rojo y azul, y trazando el rojo y el azul del hoechst uno contra el otro.

Toxicidad y seguridad

Debido a que las tinciones de Hoechst se unen al ADN, interfieren con la replicación del ADN durante la división celular. En consecuencia, son potencialmente mutagénicos y cancerígenos, por lo que se debe tener cuidado en su manipulación y eliminación. La tinción de Hoechst se utiliza para clasificar el esperma en ganado y humanos. Se ha debatido su seguridad.