Tinción de Gram

La tinción de Gram o coloración de Gram, también llamada método de Gram, es un método de tinción utilizado para clasificar las especies bacterianas en dos grandes grupos: bacterias Gram-positivas y bacterias Gram-negativas. El nombre proviene del bacteriólogo danés Hans Christian Gram, quien desarrolló la técnica en 1884.

La tinción de Gram diferencia las bacterias por las propiedades químicas y físicas de sus paredes celulares. Las células grampositivas tienen una capa gruesa de peptidoglicano en la pared celular que retiene la tinción primaria, el cristal violeta. Las células gramnegativas tienen una capa de peptidoglicano más delgada que permite que el cristal violeta se lave al agregar etanol. Se tiñen de rosa o rojo por la contratinción, comúnmente safranina o fucsina. La solución de yodo de Lugol siempre se agrega después de la adición de cristal violeta para fortalecer los enlaces de la tinción con la membrana celular.

La tinción de Gram es casi siempre el primer paso en la identificación preliminar de un organismo bacteriano. Si bien la tinción de Gram es una valiosa herramienta de diagnóstico tanto en entornos clínicos como de investigación, no todas las bacterias pueden clasificarse definitivamente mediante esta técnica. Esto da lugar a grupos Gram variables y Gram indeterminados.

Historia

El método lleva el nombre de su inventor, el científico danés Hans Christian Gram (1853–1938), quien desarrolló la técnica mientras trabajaba con Carl Friedländer en la morgue del hospital de la ciudad de Berlín en 1884. Gram ideó su técnica no con el propósito de distinguir un tipo de bacteria de otro sino hacer que las bacterias sean más visibles en secciones teñidas de tejido pulmonar. Publicó su método en 1884 e incluyó en su breve informe la observación de que el bacilo del tifus no retenía la mancha.

Usos

La tinción de Gram es una técnica de laboratorio bacteriológica utilizada para diferenciar especies bacterianas en dos grandes grupos (grampositivas y gramnegativas) en función de las propiedades físicas de sus paredes celulares. La tinción de Gram no se usa para clasificar las arqueas, anteriormente arqueobacterias, ya que estos microorganismos producen respuestas muy variables que no siguen sus grupos filogenéticos.

Algunos organismos son gramvariables (lo que significa que pueden teñirse de forma negativa o positiva); algunos no se tiñen con ninguno de los colorantes utilizados en la técnica de Gram y no se ven. En un laboratorio moderno de microbiología ambiental o molecular, la mayor parte de la identificación se realiza mediante secuencias genéticas y otras técnicas moleculares, que son mucho más específicas e informativas que la tinción diferencial.

Médico

Las tinciones de Gram se realizan en fluidos corporales o una biopsia cuando se sospecha una infección. Las tinciones de Gram producen resultados mucho más rápidos que los cultivos y son especialmente importantes cuando la infección marcaría una diferencia importante en el tratamiento y el pronóstico del paciente; ejemplos son el líquido cefalorraquídeo para la meningitis y el líquido sinovial para la artritis séptica.

Mecanismo de tinción

Las bacterias grampositivas tienen una pared celular similar a una malla gruesa hecha de peptidoglicano (50–90 % de la envoltura celular) y, como resultado, se tiñen de púrpura con el cristal violeta, mientras que las bacterias gramnegativas tienen una capa más delgada (10 % de la envoltura celular). sobre), por lo que no retienen la mancha morada y se tiñen de rosa por la safranina. Hay cuatro pasos básicos de la tinción de Gram:

• Aplicación de una tinción primaria (cristal violeta) a un frotis de un cultivo bacteriano fijado con calor. La fijación por calor mata algunas bacterias, pero se usa principalmente para fijar las bacterias al portaobjetos para que no se enjuaguen durante el procedimiento de tinción.
• La adición de yodo, que se une al cristal violeta y lo atrapa en la célula.
• Decoloración rápida con etanol o acetona
• Contratinción con safranina. La fucsina de carbol a veces se sustituye por safranina, ya que tiñe más intensamente las bacterias anaerobias, pero se usa con menos frecuencia como contratinción.

Aplicación de	Reactivo	color de celda
Gram positivas	Gram-negativo
tinte primario	cristal violeta	púrpura	púrpura
mordaz	yodo	púrpura	púrpura
decolorante	alcohol/acetona	púrpura	incoloro
contramancha	safranina/carbol fucsina	púrpura	rosa o rojo

El cristal violeta (CV) se disocia en soluciones acuosas en CVy cloruro (Cl) iones. Estos iones penetran en la pared celular de las células grampositivas y gramnegativas. el currículumEl ion interactúa con los componentes cargados negativamente de las células bacterianas y tiñe las células de color púrpura.

Yoduro (Io yo₃) interactúa con CVy forma grandes complejos de cristal violeta y yodo (CV-I) dentro de las capas interna y externa de la célula. El yodo a menudo se denomina mordiente, pero es un agente atrapante que impide la eliminación del complejo CV-I y, por lo tanto, colorea la célula.

Cuando se agrega un decolorante como el alcohol o la acetona, interactúa con los lípidos de la membrana celular. Una célula gramnegativa pierde su membrana externa de lipopolisacárido y la capa interna de peptidoglicano queda expuesta. Los complejos CV-I se lavan de la célula gramnegativa junto con la membrana externa. Por el contrario, una célula grampositiva se deshidrata por un tratamiento con etanol. Los grandes complejos CV-I quedan atrapados dentro de la célula grampositiva debido a la naturaleza multicapa de su peptidoglicano. El paso de decoloración es crítico y debe programarse correctamente; la tinción de cristal violeta se elimina tanto de las células grampositivas como de las negativas si el agente decolorante se deja demasiado tiempo (cuestión de segundos).

Después de la decoloración, la célula grampositiva permanece de color púrpura y la célula gramnegativa pierde su color púrpura. La contratinción, que suele ser safranina cargada positivamente o fucsina básica, se aplica en último lugar para dar a las bacterias gramnegativas decoloradas un color rosa o rojo. Tanto las bacterias grampositivas como las gramnegativas captan la contratinción. La contratinción, sin embargo, no se ve en las bacterias grampositivas debido a la tinción de cristal violeta más oscura.

Ejemplos

Bacterias grampositivas

Las bacterias grampositivas generalmente tienen una sola membrana (monodermo) rodeada por un peptidoglucano espeso. Esta regla es seguida por dos filos: Bacillota (excepto las clases Mollicutes y Negativicutes) y Actinomycetota. Por el contrario, los miembros de la cloroflexota (bacteria verde sin azufre) son monodermos pero poseen un peptidoglicano delgado o ausente (clase Dehalococcoidetes) y pueden teñirse de forma negativa, positiva o indeterminada; los miembros de Deinococcota se tiñen pero son didérmicos con un peptidoglucano espeso.

Históricamente, las formas grampositivas componían el phylum Firmicutes, un nombre que ahora se usa para el grupo más grande. Incluye muchos géneros bien conocidos como Lactobacillus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus y Clostridium. También se ha ampliado para incluir Mollicutes, bacterias como Mycoplasma y Thermoplasma que carecen de paredes celulares y, por lo tanto, no pueden teñirse con Gram, pero se derivan de tales formas.

Algunas bacterias tienen paredes celulares que son particularmente hábiles para retener las manchas. Estos aparecerán positivos por tinción de Gram aunque no estén estrechamente relacionados con otras bacterias grampositivas. Estas se denominan bacterias acidorresistentes y solo se pueden diferenciar de otras bacterias grampositivas mediante procedimientos especiales de tinción.

Bacterias Gram-negativo

Las bacterias gramnegativas generalmente poseen una capa delgada de peptidoglicano entre dos membranas (didermo). El lipopolisacárido (LPS) es el antígeno más abundante en la superficie celular de la mayoría de las bacterias Gram negativas y contribuye hasta en un 80 % a la membrana externa de E. coli y Salmonella. La mayoría de los filos bacterianos son gramnegativos, incluidas las cianobacterias, las bacterias verdes del azufre y la mayoría de las Pseudomonadota (con la excepción de algunos miembros de Rickettsiales y los endosimbiontes de insectos de Enterobacteriales).

Bacterias Gram-variables y Gram-indeterminadas

Algunas bacterias, después de teñirse con la tinción de Gram, producen un patrón variable de Gram: se observa una mezcla de células rosadas y moradas. En cultivos de Bacillus, Butyrivibrio y Clostridium, una disminución en el espesor de peptidoglicano durante el crecimiento coincide con un aumento en el número de células que tiñen gramnegativas. Además, en todas las bacterias teñidas con la tinción de Gram, la edad del cultivo puede influir en los resultados de la tinción.

Las bacterias gramindeterminadas no responden de manera predecible a la tinción de Gram y, por lo tanto, no se pueden determinar como grampositivas o gramnegativas. Los ejemplos incluyen muchas especies de Mycobacterium, incluyendo Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis, los dos últimos de los cuales son los agentes causantes de la lepra y la tuberculosis, respectivamente. Las bacterias del género Mycoplasma carecen de una pared celular alrededor de sus membranas celulares, lo que significa que no se tiñen por el método de Gram y son resistentes a los antibióticos que se dirigen a la síntesis de la pared celular.

Nota ortográfica

El término tinción de Gram se deriva del apellido de Hans Christian Gram; por lo tanto, el epónimo (Gram) está en mayúscula pero no el sustantivo común (mancha) como es habitual en los términos científicos. Las letras iniciales de grampositivo y gramnegativo, que son adjetivos epónimos, pueden ser G mayúscula o g minúscula, según la guía de estilo (si la hay) que rige el documento que se está escribiendo. El estilo en minúsculas es utilizado por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU. y otros regímenes de estilo, como el estilo AMA. Los diccionarios pueden usar minúsculas, mayúsculas o ambas. Mayúsculas Gram-positivo o Gram-negativoel uso también es común en muchos artículos y publicaciones de revistas científicas. Cuando los artículos se envían a revistas, cada revista puede o no aplicar el estilo propio a la versión posterior a la impresión. Las versiones preliminares contienen cualquier estilo que haya usado el autor. Incluso los regímenes de estilo que usan minúsculas para los adjetivos grampositivo y gramnegativo todavía usan mayúsculas para la tinción de Gram.