Síntesis de ADN

La síntesis de ADN es la creación natural o artificial de moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN). El ADN es una macromolécula formada por unidades de nucleótidos, que están unidas por enlaces covalentes y enlaces de hidrógeno, en una estructura repetitiva. La síntesis de ADN ocurre cuando estas unidades de nucleótidos se unen para formar ADN; esto puede ocurrir de forma artificial (in vitro) o de forma natural (in vivo). Las unidades de nucleótidos están formadas por una base nitrogenada (citosina, guanina, adenina o timina), un azúcar pentosa (desoxirribosa) y un grupo fosfato. Cada unidad se une cuando se forma un enlace covalente entre su grupo fosfato y el azúcar pentosa del siguiente nucleótido, formando una columna vertebral de azúcar-fosfato. El ADN es una estructura bicatenaria complementaria, ya que el emparejamiento de bases específicas (adenina y timina, guanina y citosina) se produce de forma natural cuando se forman enlaces de hidrógeno entre las bases de nucleótidos.

Hay varias definiciones diferentes para la síntesis de ADN: puede referirse a la replicación del ADN - biosíntesis de ADN (in vivo amplificación de ADN), reacción en cadena de la polimerasa - síntesis enzimática de ADN (in vitro amplificación de ADN) o síntesis de genes: creación física de secuencias de genes artificiales. Aunque cada tipo de síntesis es muy diferente, comparten algunas características. Los nucleótidos que se han unido para formar polinucleótidos pueden actuar como plantilla de ADN para que se produzca una forma de síntesis de ADN: la PCR. La replicación del ADN también funciona mediante el uso de una plantilla de ADN: la doble hélice del ADN se desenrolla durante la replicación, exponiendo bases no apareadas para que nuevos nucleótidos formen enlaces de hidrógeno. Sin embargo, la síntesis de genes no requiere una plantilla de ADN y los genes se ensamblan de novo.

La síntesis de ADN ocurre en todos los eucariotas y procariotas, así como en algunos virus. La síntesis precisa del ADN es importante para evitar mutaciones en el ADN. En los seres humanos, las mutaciones podrían provocar enfermedades como el cáncer, por lo que la síntesis de ADN y la maquinaria implicada in vivo se han estudiado exhaustivamente a lo largo de décadas. En el futuro, estos estudios podrán utilizarse para desarrollar tecnologías que impliquen la síntesis de ADN y que se utilicen en el almacenamiento de datos.

Replicación del ADN

En la naturaleza, las moléculas de ADN son sintetizadas por todas las células vivas mediante el proceso de replicación del ADN. Esto suele ocurrir como parte de la división celular. La replicación del ADN se produce de modo que, durante la división celular, cada célula hija contiene una copia exacta del material genético de la célula. La síntesis de ADN (replicación) in vivo depende de un complejo conjunto de enzimas que han evolucionado para actuar durante la fase S del ciclo celular, de forma concertada. Tanto en eucariotas como en procariotas, la replicación del ADN se produce cuando topoisomerasas, helicasas y girasas específicas (proteínas iniciadoras de la replicación) desenrollan la doble cadena del ADN, exponiendo las bases nitrogenadas. Estas enzimas, junto con las proteínas accesorias, forman una máquina macromolecular que garantiza una duplicación precisa de las secuencias de ADN. Se produce un emparejamiento de bases complementarias, formando una nueva molécula de ADN bicatenario. Esto se conoce como replicación semiconservativa, ya que una hebra de la nueva molécula de ADN proviene de la cadena 'padre' hebra.

Continuamente, las enzimas eucariotas encuentran daños en el ADN que pueden perturbar la replicación del ADN. Este daño se presenta en forma de lesiones del ADN que surgen espontáneamente o debido a agentes que dañan el ADN. Por lo tanto, la maquinaria de replicación del ADN está altamente controlada para evitar el colapso cuando se produce un daño. El control del sistema de replicación del ADN garantiza que el genoma se replique sólo una vez por ciclo; la replicación excesiva induce daño en el ADN. La desregulación de la replicación del ADN es un factor clave en la inestabilidad genómica durante el desarrollo del cáncer.

Esto resalta la especificidad de la maquinaria de síntesis de ADN in vivo. Existen varios medios para estimular artificialmente la replicación del ADN natural o para crear secuencias genéticas artificiales. Sin embargo, la síntesis de ADN in vitro puede ser un proceso muy propenso a errores.

Síntesis de reparación de ADN

El ADN dañado está sujeto a reparación mediante varios procesos de reparación enzimática diferentes, donde cada proceso individual está especializado para reparar tipos particulares de daño. El ADN de los humanos está sujeto a daños provenientes de múltiples fuentes naturales y una reparación insuficiente se asocia con enfermedades y envejecimiento prematuro. La mayoría de los procesos de reparación del ADN forman huecos monocatenarios en el ADN durante una etapa intermedia de la reparación, y estos huecos se llenan mediante la síntesis de reparación. Los procesos de reparación específicos que requieren llenar espacios mediante la síntesis de ADN incluyen la reparación por escisión de nucleótidos, la reparación por escisión de bases, la reparación de desajustes, la reparación recombinante homóloga, la unión de extremos no homólogos y la unión de extremos mediada por microhomología.

Transcripción inversa

La transcripción inversa es parte del ciclo de replicación de familias de virus particulares, incluidos los retrovirus. Implica copiar ARN en ADN complementario bicatenario (ADNc), utilizando enzimas transcriptasas inversas. En los retrovirus, el ARN viral se inserta en el núcleo de la célula huésped. Allí, una enzima transcriptasa inversa viral agrega nucleótidos de ADN a la secuencia de ARN, generando ADNc que se inserta en el genoma de la célula huésped mediante la enzima integrasa, que codifica proteínas virales.

Reacción en cadena de la polimerasa

Una reacción en cadena de la polimerasa es una forma de síntesis enzimática de ADN en el laboratorio, que utiliza ciclos de calentamiento y enfriamiento repetidos de la reacción para la fusión del ADN y la replicación enzimática del ADN.

La síntesis de ADN durante la PCR es muy similar a la de las células vivas pero tiene reactivos y condiciones muy específicos. Durante la PCR, el ADN se extrae químicamente de las proteínas chaperonas del huésped y luego se calienta, lo que provoca la disociación térmica de las cadenas de ADN. Se construyen dos nuevas cadenas de ADNc a partir de la cadena original; estas cadenas se pueden dividir nuevamente para actuar como plantilla para otros productos de PCR. El ADN original se multiplica mediante muchas rondas de PCR. Se pueden producir más de mil millones de copias de la cadena de ADN original.

Mutagénesis aleatoria

Para muchos experimentos, como estudios estructurales y evolutivos, los científicos necesitan producir una gran biblioteca de variantes de una secuencia de ADN particular. La mutagénesis aleatoria tiene lugar in vitro, cuando la replicación mutagénica con una ADN polimerasa de baja fidelidad se combina con una amplificación selectiva por PCR para producir muchas copias de ADN mutante.

RT-PCR

La RT-PCR se diferencia de la PCR convencional en que sintetiza ADNc a partir de ARNm, en lugar de ADN molde. La técnica combina una reacción de transcripción inversa con una amplificación basada en PCR, ya que una secuencia de ARN actúa como plantilla para la enzima transcriptasa inversa. La RT-PCR se utiliza a menudo para evaluar la expresión genética en determinados tipos de tejidos o células en diversas etapas del desarrollo o para detectar trastornos genéticos.

Síntesis de genes

La síntesis de genes artificiales es el proceso de sintetizar un gen in vitro sin la necesidad de muestras iniciales de ADN molde. En 2010, J. Craig Venter y su equipo fueron los primeros en utilizar ADN completamente sintetizado para crear un microbio autorreplicante, denominado Mycoplasma laboratorium.

Síntesis de oligonucleótidos

La síntesis de oligonucleótidos es la síntesis química de secuencias de ácidos nucleicos. La mayor parte de la investigación biológica y la bioingeniería involucran ADN sintético, que puede incluir oligonucleótidos, genes sintéticos o incluso cromosomas. Hoy en día, todo el ADN sintético se fabrica a medida utilizando el método de la fosforamidita de Marvin H. Caruthers. Los oligos se sintetizan a partir de bloques de construcción que replican bases naturales. El proceso ha sido automatizado desde finales de la década de 1970 y puede usarse para formar secuencias genéticas deseadas, así como para otros usos en medicina y biología molecular. Sin embargo, crear secuencias químicamente no es práctico más allá de 200-300 bases y es un proceso peligroso para el medio ambiente. Estos oligos, de alrededor de 200 bases, se pueden conectar mediante métodos de ensamblaje de ADN, creando moléculas de ADN más grandes.

Algunos estudios han explorado la posibilidad de síntesis enzimática utilizando desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), una ADN polimerasa que no requiere molde. Sin embargo, este método aún no es tan eficaz como la síntesis química y no está disponible comercialmente.

Con los avances en la síntesis artificial de ADN, se está explorando la posibilidad de almacenar datos de ADN. Con su densidad de almacenamiento ultraalta y su estabilidad a largo plazo, el ADN sintético es una opción interesante para almacenar grandes cantidades de datos. Aunque la información se puede recuperar muy rápidamente del ADN mediante tecnologías de secuenciación de próxima generación, la síntesis de novo de ADN es un importante obstáculo en el proceso. Solo se puede agregar un nucleótido por ciclo, y cada ciclo dura unos segundos, por lo que la síntesis general requiere mucho tiempo y es muy propensa a errores. Sin embargo, si la biotecnología mejora, algún día el ADN sintético podría utilizarse para almacenar datos.

Síntesis de pares de bases

Se ha informado que se pueden sintetizar nuevos pares de nucleobases, así como A-T (adenina - timina) y G-C (guanina - citosina). Se pueden utilizar nucleótidos sintéticos para ampliar el alfabeto genético y permitir modificaciones específicas de sitios del ADN. Incluso un tercer par de bases ampliaría el número de aminoácidos que el ADN puede codificar de los 20 aminoácidos existentes a 172 posibles. El ADN de Hachimoji se construye a partir de ocho letras de nucleótidos, formando cuatro pares de bases posibles. Por tanto, duplica la densidad de información del ADN natural. En estudios, incluso se ha producido ARN a partir del ADN de hachimoji. Esta tecnología también podría utilizarse para permitir el almacenamiento de datos en el ADN.