Secuenciación de ADN

La secuenciación de ADN o secuenciación genética es el proceso de determinar la secuencia del ácido nucleico, el orden de los nucleótidos en el ADN. Incluye cualquier método o tecnología que se utilice para determinar el orden de las cuatro bases: adenina, guanina, citosina y timina. El advenimiento de los métodos rápidos de secuenciación del ADN ha acelerado en gran medida la investigación y los descubrimientos biológicos y médicos.

El conocimiento de las secuencias de ADN se ha vuelto indispensable para la investigación biológica básica, los Proyectos Genográficos de ADN y en numerosos campos aplicados como el diagnóstico médico, la biotecnología, la biología forense, la virología y la sistemática biológica. La comparación de secuencias de ADN sanas y mutadas puede diagnosticar diferentes enfermedades, incluidos varios tipos de cáncer, caracterizar el repertorio de anticuerpos y puede usarse para guiar el tratamiento del paciente. Tener una forma rápida de secuenciar el ADN permite que se administre una atención médica más rápida e individualizada, y que se identifiquen y cataloguen más organismos.

La rápida velocidad de secuenciación lograda con la tecnología moderna de secuenciación de ADN ha sido fundamental en la secuenciación de secuencias completas de ADN, o genomas, de numerosos tipos y especies de vida, incluido el genoma humano y otras secuencias completas de ADN de muchos animales, plantas y microbios. especies.

Las primeras secuencias de ADN fueron obtenidas a principios de la década de 1970 por investigadores académicos que utilizaron métodos laboriosos basados ​​en cromatografía bidimensional. Tras el desarrollo de métodos de secuenciación basados ​​en fluorescencia con un secuenciador de ADN, la secuenciación de ADN se ha vuelto más fácil y mucho más rápida.

Aplicaciones

La secuenciación del ADN se puede utilizar para determinar la secuencia de genes individuales, regiones genéticas más grandes (es decir, grupos de genes u operones), cromosomas completos o genomas completos de cualquier organismo. La secuenciación del ADN también es la forma más eficiente de secuenciar indirectamente el ARN o las proteínas (a través de sus marcos de lectura abiertos). De hecho, la secuenciación del ADN se ha convertido en una tecnología clave en muchas áreas de la biología y otras ciencias como la medicina, la ciencia forense y la antropología.

Biología Molecular

La secuenciación se utiliza en biología molecular para estudiar los genomas y las proteínas que codifican. La información obtenida mediante la secuenciación permite a los investigadores identificar cambios en los genes, asociaciones con enfermedades y fenotipos, e identificar posibles dianas farmacológicas.

Biología evolucionaria

Dado que el ADN es una macromolécula informativa en términos de transmisión de una generación a otra, la secuenciación del ADN se utiliza en biología evolutiva para estudiar cómo se relacionan los diferentes organismos y cómo evolucionaron. En febrero de 2021, los científicos informaron, por primera vez, de la secuenciación de ADN de restos animales, un mamut en este caso, de más de un millón de años, el ADN más antiguo secuenciado hasta la fecha.

Metagenómica

El campo de la metagenómica implica la identificación de organismos presentes en un cuerpo de agua, aguas residuales, suciedad, desechos filtrados del aire o muestras de hisopos de organismos. Saber qué organismos están presentes en un entorno particular es fundamental para la investigación en ecología, epidemiología, microbiología y otros campos. La secuenciación permite a los investigadores determinar qué tipos de microbios pueden estar presentes en un microbioma, por ejemplo.

Virología

Como la mayoría de los virus son demasiado pequeños para ser vistos con un microscopio óptico, la secuenciación es una de las principales herramientas en virología para identificar y estudiar el virus. Los genomas virales pueden estar basados ​​en ADN o ARN. Los virus de ARN son más sensibles al tiempo para la secuenciación del genoma, ya que se degradan más rápido en las muestras clínicas. La secuenciación tradicional de Sanger y la secuenciación de próxima generación se utilizan para secuenciar virus en investigación básica y clínica, así como para el diagnóstico de infecciones virales emergentes, epidemiología molecular de patógenos virales y pruebas de resistencia a medicamentos. Hay más de 2,3 millones de secuencias virales únicas en GenBank. Recientemente, NGS ha superado al tradicional Sanger como el enfoque más popular para generar genomas virales.

Durante el brote de influenza aviar de 1990, la secuenciación viral determinó que el subtipo de influenza se originó a través del reordenamiento entre las codornices y las aves de corral. Esto condujo a una legislación en Hong Kong que prohibía vender codornices vivas y aves juntas en el mercado. La secuenciación viral también se puede usar para estimar cuándo comenzó un brote viral mediante el uso de una técnica de reloj molecular.

Medicamento

Los técnicos médicos pueden secuenciar genes (o, teóricamente, genomas completos) de pacientes para determinar si existe riesgo de enfermedades genéticas. Esta es una forma de prueba genética, aunque es posible que algunas pruebas genéticas no impliquen la secuenciación del ADN.

La secuenciación del ADN también se utiliza cada vez más para diagnosticar y tratar enfermedades raras. A medida que se identifican más y más genes que causan enfermedades genéticas raras, los diagnósticos moleculares para los pacientes se vuelven más comunes. La secuenciación del ADN permite a los médicos identificar enfermedades genéticas, mejorar el manejo de enfermedades, brindar asesoramiento reproductivo y terapias más efectivas.

Además, la secuenciación del ADN puede ser útil para determinar una bacteria específica, para permitir tratamientos con antibióticos más precisos, reduciendo así el riesgo de crear resistencia a los antimicrobianos en las poblaciones de bacterias.

Investigación forense

La secuenciación de ADN se puede utilizar junto con los métodos de perfilado de ADN para la identificación forense y las pruebas de paternidad. Las pruebas de ADN han evolucionado enormemente en las últimas décadas para finalmente vincular una huella de ADN con lo que se está investigando. Los patrones de ADN en las huellas dactilares, la saliva, los folículos pilosos, etc. separan de forma única a cada organismo vivo de otro. La prueba de ADN es una técnica que puede detectar genomas específicos en una hebra de ADN para producir un patrón único e individualizado.

Las cuatro bases canónicas

La estructura canónica del ADN tiene cuatro bases: timina (T), adenina (A), citosina (C) y guanina (G). La secuenciación del ADN es la determinación del orden físico de estas bases en una molécula de ADN. Sin embargo, hay muchas otras bases que pueden estar presentes en una molécula. En algunos virus (específicamente, bacteriófagos), la citosina puede ser reemplazada por hidroximetilo o hidroximetilglucosa citosina. En el ADN de los mamíferos, se pueden encontrar bases variantes con grupos metilo o fosfosulfato. Dependiendo de la técnica de secuenciación, una modificación particular, por ejemplo, la 5mC (5 metil citosina) común en humanos, puede o no detectarse.

Historia

Descubrimiento de la estructura y función del ADN.

El ácido desoxirribonucleico (ADN) fue descubierto y aislado por primera vez por Friedrich Miescher en 1869, pero permaneció poco estudiado durante muchas décadas porque se pensaba que las proteínas, en lugar del ADN, mantenían el plano genético de la vida. Esta situación cambió después de 1944 como resultado de algunos experimentos de Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty que demostraron que el ADN purificado podía cambiar una cepa de bacterias en otra. Esta fue la primera vez que se demostró que el ADN es capaz de transformar las propiedades de las células.

En 1953, James Watson y Francis Crick propusieron su modelo de ADN de doble hélice, basado en estructuras de rayos X cristalizadas que estudiaba Rosalind Franklin. Según el modelo, el ADN está compuesto por dos hebras de nucleótidos enrolladas entre sí, unidas por enlaces de hidrógeno y que corren en direcciones opuestas. Cada hebra se compone de cuatro nucleótidos complementarios: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T), con una A en una hebra siempre emparejada con una T en la otra y una C siempre emparejada con una G. Propusieron que tal estructura permitiera que cada hebra se usara para reconstruir la otra, una idea central para la transmisión de información hereditaria entre generaciones.

La base para la secuenciación de proteínas se estableció por primera vez con el trabajo de Frederick Sanger, quien en 1955 había completado la secuencia de todos los aminoácidos en la insulina, una pequeña proteína secretada por el páncreas. Esto proporcionó la primera evidencia concluyente de que las proteínas eran entidades químicas con un patrón molecular específico en lugar de una mezcla aleatoria de material suspendido en un líquido. El éxito de Sanger en la secuenciación de la insulina estimuló a los cristalógrafos de rayos X, incluidos Watson y Crick, que ahora estaban tratando de comprender cómo el ADN dirigía la formación de proteínas dentro de una célula. Poco después de asistir a una serie de conferencias impartidas por Frederick Sanger en octubre de 1954, Crick comenzó a desarrollar una teoría que argumentaba que la disposición de los nucleótidos en el ADN determinaba la secuencia de aminoácidos en las proteínas. que a su vez ayudó a determinar la función de una proteína. Publicó esta teoría en 1958.

Secuenciación de ARN

La secuenciación de ARN fue una de las primeras formas de secuenciación de nucleótidos. El principal hito de la secuenciación del ARN es la secuencia del primer gen completo y el genoma completo del bacteriófago MS2, identificado y publicado por Walter Fiers y sus colaboradores en la Universidad de Gante (Gante, Bélgica), en 1972 y 1976. Secuenciación de ARN tradicional los métodos requieren la creación de una molécula de ADNc que debe ser secuenciada.

Primeros métodos de secuenciación de ADN

El primer método para determinar secuencias de ADN involucró una estrategia de extensión de cebador específica de ubicación establecida por Ray Wu en la Universidad de Cornell en 1970. La catálisis de ADN polimerasa y el etiquetado de nucleótidos específicos, que ocupan un lugar destacado en los esquemas de secuenciación actuales, se utilizaron para secuenciar los extremos cohesivos. del ADN del fago lambda. Entre 1970 y 1973, Wu, R Padmanabhan y sus colegas demostraron que este método se puede emplear para determinar cualquier secuencia de ADN utilizando cebadores sintéticos específicos de ubicación. Frederick Sanger luego adoptó esta estrategia de extensión de cebadores para desarrollar métodos de secuenciación de ADN más rápidos en el Centro MRC, Cambridge, Reino Unido y publicó un método para "secuenciación de ADN con inhibidores de terminación de cadena" en 1977.Walter Gilbert y Allan Maxam en Harvard también desarrollaron métodos de secuenciación, incluido uno para "secuenciación de ADN por degradación química". En 1973, Gilbert y Maxam reportaron la secuencia de 24 pares de bases utilizando un método conocido como análisis de puntos errantes. Los avances en la secuenciación se vieron favorecidos por el desarrollo simultáneo de tecnología de ADN recombinante, lo que permitió aislar muestras de ADN de fuentes distintas a los virus.

Secuenciación de genomas completos

El primer genoma completo de ADN que se secuenció fue el del bacteriófago φX174 en 1977. Los científicos del Consejo de Investigación Médica descifraron la secuencia completa de ADN del virus Epstein-Barr en 1984 y descubrieron que contenía 172 282 nucleótidos. La finalización de la secuencia marcó un punto de inflexión significativo en la secuenciación del ADN porque se logró sin conocimiento previo del perfil genético del virus.

Herbert Pohl y sus colaboradores desarrollaron a principios de la década de 1980 un método no radiactivo para transferir las moléculas de ADN de las mezclas de reacción de secuenciación a una matriz inmovilizadora durante la electroforesis. Seguido de la comercialización del secuenciador de ADN "Direct-Blotting-Electrophoresis-System GATC 1500" de GATC Biotech, que se utilizó intensamente en el marco del programa de secuenciación del genoma de la UE, la secuencia completa de ADN de la levadura Saccharomyces cerevisiae cromosoma II. El laboratorio de Leroy E. Hood en el Instituto de Tecnología de California anunció la primera máquina de secuenciación de ADN semiautomática en 1986. A esto le siguió la comercialización de Applied Biosystems de la primera máquina de secuenciación totalmente automatizada, la ABI 370, en 1987 y Dupont'que utilizó una nueva técnica de marcaje fluorescente que permitió identificar los cuatro didesoxinucleótidos en un solo carril. Para 1990, los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de EE. UU. habían comenzado ensayos de secuenciación a gran escala en Mycoplasma capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans y Saccharomyces cerevisiae a un costo de US$0,75 por base. Mientras tanto, la secuenciación de secuencias de cDNA humano llamadas etiquetas de secuencia expresada comenzó en el laboratorio de Craig Venter, un intento de capturar la fracción codificante del genoma humano. En 1995, Venter, Hamilton Smith y sus colegas del Instituto de Investigación Genómica (TIGR) publicaron el primer genoma completo de un organismo de vida libre, la bacteria Haemophilus influenzae.. El cromosoma circular contiene 1.830.137 bases y su publicación en la revista Science marcó el primer uso publicado de la secuenciación aleatoria del genoma completo, eliminando la necesidad de esfuerzos iniciales de mapeo.

En 2001, se habían utilizado métodos de secuenciación rápida para producir un borrador de secuencia del genoma humano.

Métodos de secuenciación de alto rendimiento (HTS)

Varios métodos nuevos para la secuenciación del ADN se desarrollaron a mediados y finales de la década de 1990 y se implementaron en secuenciadores de ADN comerciales en el año 2000. En conjunto, estos se denominaron métodos de secuenciación de "próxima generación" o "segunda generación" (NGS), para distinguir de los métodos anteriores, incluida la secuenciación de Sanger. A diferencia de la primera generación de secuenciación, la tecnología NGS se caracteriza típicamente por ser altamente escalable, lo que permite secuenciar todo el genoma a la vez. Por lo general, esto se logra mediante la fragmentación del genoma en piezas pequeñas, el muestreo aleatorio de un fragmento y la secuenciación mediante una variedad de tecnologías, como las que se describen a continuación. Un genoma completo es posible porque se secuencian múltiples fragmentos a la vez (lo que le da el nombre de "masivamente paralelo"

La tecnología NGS ha empoderado enormemente a los investigadores para buscar información sobre la salud, a los antropólogos para investigar los orígenes humanos y está catalizando el movimiento de "medicina personalizada". Sin embargo, también ha abierto la puerta a más margen de error. Existen muchas herramientas de software para llevar a cabo el análisis computacional de datos NGS, a menudo compilados en plataformas en línea como CSI NGS Portal, cada una con su propio algoritmo. Incluso los parámetros dentro de un paquete de software pueden cambiar el resultado del análisis. Además, las grandes cantidades de datos producidos por la secuenciación del ADN también han requerido el desarrollo de nuevos métodos y programas para el análisis de secuencias. Se han intentado varios esfuerzos para desarrollar estándares en el campo NGS para abordar estos desafíos, la mayoría de los cuales han sido esfuerzos a pequeña escala que surgieron de laboratorios individuales.

El 26 de octubre de 1990, Roger Tsien, Pepi Ross, Margaret Fahnestock y Allan J Johnston presentaron una patente que describe la secuenciación paso a paso ("base por base") con bloqueadores 3 'removibles en matrices de ADN (transferencias y moléculas de ADN individuales). En 1996, Pål Nyrén y su alumno Mostafa Ronaghi del Instituto Real de Tecnología de Estocolmo publicaron su método de pirosecuenciación.

El 1 de abril de 1997, Pascal Mayer [ fr ] y Laurent Farinelli presentaron patentes a la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual que describen la secuenciación de colonias de ADN. Los métodos de preparación de muestras de ADN y de disposición aleatoria de la reacción en cadena de la polimerasa superficial (PCR) descritos en esta patente, junto con el método de secuenciación "base por base" de Roger Tsien et al., ahora se implementan en los secuenciadores de genoma Hi-Seq de Illumina..

En 1998, Phil Green y Brent Ewing, de la Universidad de Washington, describieron su puntaje de calidad phred para el análisis de datos del secuenciador, una técnica de análisis histórica que obtuvo una adopción generalizada y que sigue siendo la métrica más común para evaluar la precisión de una plataforma de secuenciación.

Lynx Therapeutics publicó y comercializó masivamente la secuenciación de firmas paralelas (MPSS), en 2000. Este método incorporó una tecnología de secuenciación paralelizada, basada en microesferas, mediada por adaptador/ligadura, y sirvió como el primer método de secuenciación de "próxima generación" disponible comercialmente, aunque no Se vendieron secuenciadores de ADN a laboratorios independientes.

Métodos básicos

Secuenciación de Maxam-Gilbert

Allan Maxam y Walter Gilbert publicaron un método de secuenciación de ADN en 1977 basado en la modificación química del ADN y la posterior escisión en bases específicas. Este método, también conocido como secuenciación química, permitió utilizar muestras purificadas de ADN de doble cadena sin clonación adicional. El uso de este método de marcado radiactivo y su complejidad técnica desalentaron el uso extensivo después de que se realizaron refinamientos en los métodos de Sanger.

La secuenciación de Maxam-Gilbert requiere el marcaje radiactivo en un extremo 5' del ADN y la purificación del fragmento de ADN que se va a secuenciar. Luego, el tratamiento químico genera rupturas en una pequeña proporción de una o dos de las cuatro bases de nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). La concentración de los productos químicos modificadores se controla para introducir en promedio una modificación por molécula de ADN. Así se genera una serie de fragmentos marcados, desde el extremo radiomarcado hasta el primer sitio de "corte" en cada molécula. Los fragmentos de las cuatro reacciones se someten a electroforesis uno al lado del otro en geles de acrilamida desnaturalizantes para la separación por tamaño. Para visualizar los fragmentos, el gel se expone a una película de rayos X para autorradiografía, produciendo una serie de bandas oscuras, cada una de las cuales corresponde a un fragmento de ADN radiomarcado, a partir del cual se puede inferir la secuencia.

Métodos de terminación de cadena

El método de terminación en cadena desarrollado por Frederick Sanger y colaboradores en 1977 pronto se convirtió en el método elegido, debido a su relativa facilidad y confiabilidad. Cuando se inventó, el método del terminador de cadena utilizaba menos sustancias químicas tóxicas y cantidades más bajas de radiactividad que el método de Maxam y Gilbert. Debido a su relativa facilidad, el método de Sanger pronto se automatizó y fue el método utilizado en la primera generación de secuenciadores de ADN.

La secuenciación de Sanger es el método que prevaleció desde la década de 1980 hasta mediados de la década de 2000. Durante ese período, se lograron grandes avances en la técnica, como el marcaje fluorescente, la electroforesis capilar y la automatización general. Estos desarrollos permitieron una secuenciación mucho más eficiente, lo que se tradujo en menores costos. El método Sanger, en forma de producción en masa, es la tecnología que produjo el primer genoma humano en 2001, marcando el comienzo de la era de la genómica. Sin embargo, más adelante en la década, llegaron al mercado enfoques radicalmente diferentes, lo que redujo el costo por genoma de $ 100 millones en 2001 a $ 10,000 en 2011.

Secuenciación a gran escala y secuenciación de novo

La secuenciación a gran escala a menudo tiene como objetivo secuenciar piezas de ADN muy largas, como cromosomas completos, aunque la secuenciación a gran escala también se puede utilizar para generar un gran número de secuencias cortas, como las que se encuentran en la visualización de fagos. Para objetivos más largos como los cromosomas, los enfoques comunes consisten en cortar (con enzimas de restricción) o cortar (con fuerzas mecánicas) fragmentos grandes de ADN en fragmentos de ADN más cortos. Luego, el ADN fragmentado puede clonarse en un vector de ADN y amplificarse en un huésped bacteriano como Escherichia coli.. Los fragmentos cortos de ADN purificados de colonias bacterianas individuales se secuencian individualmente y se ensamblan electrónicamente en una secuencia larga y contigua. Los estudios han demostrado que agregar un paso de selección de tamaño para recolectar fragmentos de ADN de tamaño uniforme puede mejorar la eficiencia de la secuenciación y la precisión del ensamblaje del genoma. En estos estudios, el dimensionamiento automático ha demostrado ser más reproducible y preciso que el dimensionamiento manual en gel.

El término " secuenciación de novo " se refiere específicamente a métodos utilizados para determinar la secuencia de ADN sin una secuencia conocida previamente. De novo se traduce del latín como "desde el principio". Los huecos en la secuencia ensamblada pueden llenarse con un recorrido de cebador. Las diferentes estrategias tienen diferentes ventajas y desventajas en velocidad y precisión; Los métodos de escopeta a menudo se usan para secuenciar genomas grandes, pero su ensamblaje es complejo y difícil, particularmente con repeticiones de secuencias que a menudo causan brechas en el ensamblaje del genoma.

La mayoría de los enfoques de secuenciación utilizan un paso de clonación in vitro para amplificar moléculas de ADN individuales, porque sus métodos de detección molecular no son lo suficientemente sensibles para la secuenciación de una sola molécula. La PCR en emulsión aísla moléculas de ADN individuales junto con perlas recubiertas de cebador en gotitas acuosas dentro de una fase oleosa. Luego, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cubre cada perla con copias clonales de la molécula de ADN, seguida de inmovilización para su posterior secuenciación. La PCR en emulsión se utiliza en los métodos desarrollados por Marguilis et al. (comercializado por 454 Life Sciences), Shendure y Porreca et al. (también conocida como "secuenciación de polonia") y secuenciación SOLiD (desarrollada por Agencourt, más tarde Applied Biosystems, ahora Life Technologies).Emulsion PCR también se utiliza en las plataformas GemCode y Chromium desarrolladas por 10x Genomics.

Secuencia de escopeta

La secuenciación de escopeta es un método de secuenciación diseñado para el análisis de secuencias de ADN de más de 1000 pares de bases, hasta cromosomas completos incluidos. Este método requiere que el ADN objetivo se rompa en fragmentos aleatorios. Después de secuenciar fragmentos individuales utilizando el método de terminación de cadena, las secuencias se pueden volver a ensamblar sobre la base de sus regiones superpuestas.

Métodos de alto rendimiento

La secuenciación de alto rendimiento, que incluye métodos de secuenciación de "lectura corta" de próxima generación y de "lectura larga" de tercera generación, se aplica a la secuenciación de exomas, secuenciación de genomas, resecuenciación de genomas, perfiles de transcriptomas (RNA-Seq), interacciones ADN-proteína (secuenciación ChIP) y caracterización del epigenoma.

La gran demanda de secuenciación de bajo costo ha impulsado el desarrollo de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento que paralelizan el proceso de secuenciación, produciendo miles o millones de secuencias al mismo tiempo. Las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento están destinadas a reducir el costo de la secuenciación de ADN más allá de lo que es posible con los métodos estándar de terminación de colorante. En la secuenciación de ultra alto rendimiento, se pueden ejecutar en paralelo hasta 500.000 operaciones de secuenciación por síntesis. Tales tecnologías llevaron a la capacidad de secuenciar un genoma humano completo en tan solo un día. A partir de 2019, los líderes corporativos en el desarrollo de productos de secuenciación de alto rendimiento incluyen Illumina, Qiagen y ThermoFisher Scientific.

Método	Longitud de lectura	Precisión (lectura única, no consenso)	Lecturas por ejecución	Tiempo por carrera	Costo por mil millones de bases (en US$)	Ventajas	Desventajas
Secuenciación en tiempo real de una sola molécula (Pacific Biosciences)	30.000 pb (N50);longitud máxima de lectura >100.000 bases	Precisión de lectura sin procesar del 87 %	4 000 000 por celda Sequel 2 SMRT, 100–200 gigabases	30 minutos a 20 horas	$7.2-$43.3	Rápido. Detecta 4mC, 5mC, 6mA.	Rendimiento moderado. El equipo puede ser muy costoso.
Semiconductor de iones (secuenciación de torrentes de iones)	hasta 600 pb	99,6%	hasta 80 millones	2 horas	$66.8-$950	Equipo menos costoso. Rápido.	Errores de homopolímero.
Pirosecuenciación (454)	700 pb	99,9%	1 millón	24 horas	$10,000	Tamaño de lectura larga. Rápido.	Las carreras son caras. Errores de homopolímero.
Secuenciación por síntesis (Illumina)	MiniSeq, NextSeq: 75–300 pb;MiSeq: 50–600 pb;HiSeq 2500: 50–500 pb;HiSeq 3/4000: 50–300 pb;HiSeq X: 300 pb	99,9% (Phred30)	MiniSeq/MiSeq: 1–25 millones;NextSeq: 130-00 millones;HiSeq 2500: 300 millones – 2 mil millones;HiSeq 3/4000 2500 millones;HiSeq X: 3 mil millones	De 1 a 11 días, según el secuenciador y la longitud de lectura especificada	$5 a $150	Potencial de alto rendimiento de secuencia, según el modelo de secuenciador y la aplicación deseada.	El equipo puede ser muy costoso. Requiere altas concentraciones de ADN.
Síntesis de anclaje de sonda combinatoria (cPAS-BGI/MGI)	BGISEQ-50: 35-50 pb;MGISEQ 200: 50-200 pb;BGISEQ-500, MGISEQ-2000: 50-300 pb	99,9% (Phred30)	BGISEQ-50: 160M;MGISEQ 200: 300M;BGISEQ-500: 1300M por celda de flujo;MGISEQ-2000: celda de flujo 375M FCS, celda de flujo 1500M FCL por celda de flujo.	De 1 a 9 días según el instrumento, la duración de la lectura y el número de celdas de flujo ejecutadas a la vez.	$5– $120
Secuenciación por ligación (secuenciación SOLiD)	50+35 o 50+50 pb	99,9%	1,2 a 1,4 mil millones	1 a 2 semanas	$ 60-130	Bajo costo por base.	Más lento que otros métodos. Tiene problemas para secuenciar secuencias palindrómicas.
Secuenciación de nanoporos	Depende de la preparación de la biblioteca, no del dispositivo, por lo que el usuario elige la longitud de lectura (hasta 2 272 580 pb informados).	~92–97% lectura única	depende de la longitud de lectura seleccionada por el usuario	transmisión de datos en tiempo real. Elija 1 min a 48 hrs	$7–100	Lecturas individuales más largas. Comunidad de usuarios accesible. Portátil (tamaño de la palma de la mano).	Menor rendimiento que otras máquinas, precisión de lectura única en 90 s.
Secuenciación GenapSys	Alrededor de 150 pb de un solo extremo	99,9% (Phred30)	1 a 16 millones	alrededor de 24 horas	$667	Instrumento de bajo costo ($10,000)
Terminación de cadena (secuenciación de Sanger)	400 a 900 pb	99,9%	N / A	20 minutos a 3 horas	$2,400,000	Útil para muchas aplicaciones.	Más caro y poco práctico para proyectos de secuenciación más grandes. Este método también requiere el largo paso de la clonación de plásmidos o PCR.

Métodos de secuenciación de lectura larga

Secuenciación en tiempo real de una sola molécula (SMRT)

La secuenciación SMRT se basa en el enfoque de secuenciación por síntesis. El ADN se sintetiza en guías de ondas de modo cero (ZMW): pequeños contenedores similares a pozos con las herramientas de captura ubicadas en el fondo del pozo. La secuenciación se realiza con el uso de polimerasa no modificada (unida a la parte inferior de ZMW) y nucleótidos marcados con fluorescencia que fluyen libremente en la solución. Los pocillos se construyen de forma que solo se detecta la fluorescencia que se produce en el fondo del pocillo. La etiqueta fluorescente se separa del nucleótido tras su incorporación a la cadena de ADN, dejando una cadena de ADN sin modificar. Según Pacific Biosciences (PacBio), el desarrollador de la tecnología SMRT, esta metodología permite la detección de modificaciones de nucleótidos (como la metilación de citosina). Esto sucede a través de la observación de la cinética de la polimerasa.En 2015, Pacific Biosciences anunció el lanzamiento de un nuevo instrumento de secuenciación llamado Sequel System, con 1 millón de ZMW en comparación con los 150 000 ZMW del instrumento PacBio RS II. La secuenciación SMRT se conoce como secuenciación de "tercera generación" o "lectura larga".

Secuenciación de ADN de nanoporos

El ADN que pasa a través del nanoporo cambia su corriente de iones. Este cambio depende de la forma, el tamaño y la longitud de la secuencia de ADN. Cada tipo de nucleótido bloquea el flujo de iones a través del poro durante un período de tiempo diferente. El método no requiere nucleótidos modificados y se realiza en tiempo real. La secuenciación de nanoporos se conoce como secuenciación de "tercera generación" o "lectura larga", junto con la secuenciación SMRT.

Las primeras investigaciones industriales sobre este método se basaron en una técnica llamada "secuenciación de exonucleasas", en la que la lectura de señales eléctricas se producía cuando los nucleótidos pasaban por los poros de alfa(α)-hemolisina unidos covalentemente con ciclodextrina. Sin embargo, el método comercial posterior, 'secuenciación de cadena', secuenciaba bases de ADN en una cadena intacta.

Dos áreas principales de secuenciación de nanoporos en desarrollo son la secuenciación de nanoporos en estado sólido y la secuenciación de nanoporos basada en proteínas. La secuenciación de nanoporos de proteínas utiliza complejos de proteínas de membrana como α-hemolisina, MspA (Mycobacterium smegmatis Porin A) o CssG, que son muy prometedores dada su capacidad para distinguir entre nucleótidos individuales y grupos. Por el contrario, la secuenciación de nanoporos en estado sólido utiliza materiales sintéticos como el nitruro de silicio y el óxido de aluminio y se prefiere por su capacidad mecánica superior y su estabilidad térmica y química. El método de fabricación es esencial para este tipo de secuenciación dado que la matriz de nanoporos puede contener cientos de poros con diámetros inferiores a ocho nanómetros.

El concepto se originó a partir de la idea de que las moléculas de ADN o ARN monocatenario pueden ser impulsadas electroforéticamente en una secuencia lineal estricta a través de un poro biológico que puede tener menos de ocho nanómetros, y puede detectarse dado que las moléculas liberan una corriente iónica mientras se mueven a través del poro. El poro contiene una región de detección capaz de reconocer diferentes bases, generando cada base varias señales específicas en el tiempo correspondientes a la secuencia de bases a medida que cruzan el poro que luego se evalúan. El control preciso sobre el transporte de ADN a través del poro es crucial para el éxito. Se han utilizado varias enzimas, como exonucleasas y polimerasas, para moderar este proceso colocándolas cerca de la entrada del poro.

Métodos de secuenciación de lectura corta

Secuenciación masiva de firmas en paralelo (MPSS)

La primera de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, la secuenciación de firmas paralelas masivas (o MPSS), se desarrolló en la década de 1990 en Lynx Therapeutics, una empresa fundada en 1992 por Sydney Brenner y Sam Eletr. MPSS era un método basado en perlas que utilizaba un enfoque complejo de ligadura de adaptador seguida de decodificación de adaptador, leyendo la secuencia en incrementos de cuatro nucleótidos. Este método lo hizo susceptible al sesgo específico de secuencia o pérdida de secuencias específicas. Debido a que la tecnología era tan compleja, Lynx Therapeutics solo realizaba MPSS 'internamente' y no se vendían máquinas de secuenciación de ADN a laboratorios independientes. Lynx Therapeutics se fusionó con Solexa (más tarde adquirida por Illumina) en 2004, lo que condujo al desarrollo de la secuenciación por síntesis, un enfoque más simple adquirido de Manteia Predictive Medicine, que hizo que MPSS quedara obsoleto. Sin embargo, las propiedades esenciales de la salida MPSS eran típicas de los tipos de datos de alto rendimiento posteriores, incluidos cientos de miles de secuencias cortas de ADN. En el caso de MPSS, estos se usaron típicamente para secuenciar ADNc para medir los niveles de expresión génica.

Secuenciación de polonia

El método de secuenciación de polonia, desarrollado en el laboratorio de George M. Church en Harvard, fue uno de los primeros sistemas de secuenciación de alto rendimiento y se usó para secuenciar un genoma completo de E. coli en 2005. Combinaba una biblioteca de etiquetas emparejadas in vitro con PCR en emulsión, un microscopio automatizado y química de secuenciación basada en ligación para secuenciar un genoma de E. coli con una precisión de >99,9999 % y un costo de aproximadamente 1/9 del de la secuenciación de Sanger. La tecnología se autorizó a Agencourt Biosciences, posteriormente se convirtió en Agencourt Personal Genomics y finalmente se incorporó a la plataforma SOLiD de Applied Biosystems. Applied Biosystems fue adquirida posteriormente por Life Technologies, ahora parte de Thermo Fisher Scientific.

454 pirosecuenciación

454 Life Sciences desarrolló una versión paralelizada de pirosecuenciación, que desde entonces ha sido adquirida por Roche Diagnostics. El método amplifica el ADN dentro de las gotas de agua en una solución de aceite (PCR en emulsión), y cada gota contiene una sola plantilla de ADN unida a una sola perla recubierta de cebador que luego forma una colonia clonal. La máquina de secuenciación contiene muchos pocillos con volumen de picolitros, cada uno de los cuales contiene una sola perla y enzimas de secuenciación. La pirosecuenciación usa luciferasa para generar luz para la detección de los nucleótidos individuales agregados al ADN naciente, y los datos combinados se usan para generar lecturas de secuencias. Esta tecnología proporciona una longitud de lectura intermedia y un precio por base en comparación con la secuenciación de Sanger en un extremo y Solexa y SOLiD en el otro.

Secuenciación Illumina (Solexa)

Solexa, ahora parte de Illumina, fue fundada por Shankar Balasubramanian y David Klenerman en 1998, y desarrolló un método de secuenciación basado en tecnología de terminadores de colorante reversibles y polimerasas diseñadas. El concepto de química de terminación reversible fue inventado por Bruno Canard y Simon Sarfati en el Instituto Pasteur de París. Fue desarrollado internamente en Solexa por aquellos nombrados en las patentes relevantes. En 2004, Solexa adquirió la empresa Manteia Predictive Medicine para obtener una tecnología de secuenciación paralela masiva inventada en 1997 por Pascal Mayer [fr] y Laurent Farinelli.Se basa en "clústeres de ADN" o "colonias de ADN", lo que implica la amplificación clonal de ADN en una superficie. La tecnología de clúster fue adquirida conjuntamente con Lynx Therapeutics de California. Solexa Ltd. luego se fusionó con Lynx para formar Solexa Inc.

En este método, las moléculas de ADN y los cebadores se unen primero en un portaobjetos o celda de flujo y se amplifican con polimerasa para que se formen colonias de ADN clonales locales, más tarde acuñadas como "agrupaciones de ADN". Para determinar la secuencia, se añaden cuatro tipos de bases terminadoras reversibles (bases RT) y se eliminan por lavado los nucleótidos no incorporados. Una cámara toma imágenes de los nucleótidos marcados con fluorescencia. Luego, el tinte, junto con el bloqueador terminal 3', se elimina químicamente del ADN, lo que permite que comience el siguiente ciclo. A diferencia de la pirosecuenciación, las cadenas de ADN se extienden un nucleótido a la vez y la adquisición de imágenes se puede realizar en un momento retrasado, lo que permite capturar conjuntos muy grandes de colonias de ADN mediante imágenes secuenciales tomadas desde una sola cámara.

El desacoplamiento de la reacción enzimática y la captura de imágenes permite un rendimiento óptimo y una capacidad de secuenciación teóricamente ilimitada. Con una configuración óptima, el rendimiento del instrumento finalmente alcanzable está dictado únicamente por la tasa de conversión de analógico a digital de la cámara, multiplicada por la cantidad de cámaras y dividida por la cantidad de píxeles por colonia de ADN necesarios para visualizarlos de manera óptima (aproximadamente 10 píxeles/colonia). En 2012, con cámaras que funcionan a tasas de conversión A/D de más de 10 MHz y óptica, fluídica y enzimática disponibles, el rendimiento puede ser múltiplos de 1 millón de nucleótidos/segundo, lo que corresponde aproximadamente a 1 genoma humano equivalente a 1x de cobertura por hora por instrumento. y 1 genoma humano resecuenciado (aprox. 30x) por día por instrumento (equipado con una sola cámara).

Síntesis de anclaje de sonda combinatoria (cPAS)

Este método es una modificación mejorada de la tecnología de ligadura de anclaje de sonda combinatoria (cPAL) descrita por Complete Genomics, que desde entonces se convirtió en parte de la compañía china de genómica BGI en 2013. Las dos compañías han refinado la tecnología para permitir longitudes de lectura más largas, reducciones de tiempo de reacción y tiempo más rápido para obtener resultados. Además, los datos ahora se generan como lecturas completas contiguas en el formato de archivo FASTQ estándar y se pueden usar tal cual en la mayoría de las canalizaciones de análisis bioinformático basadas en lecturas cortas.

Las dos tecnologías que forman la base de esta tecnología de secuenciación de alto rendimiento son las nanoesferas de ADN (DNB) y las matrices modeladas para la unión de nanoesferas a una superficie sólida.Las nanobolas de ADN se forman simplemente desnaturalizando bibliotecas ligadas con adaptadores de doble cadena y ligando la cadena delantera solo a un oligonucleótido de férula para formar un círculo de ssDNA. Se producen copias fieles de los círculos que contienen el inserto de ADN utilizando la amplificación de círculo rodante que genera aproximadamente 300 a 500 copias. La hebra larga de ssDNA se pliega sobre sí misma para producir una estructura tridimensional de nanobolas de aproximadamente 220 nm de diámetro. La creación de DNB reemplaza la necesidad de generar copias de PCR de la biblioteca en la celda de flujo y, como tal, puede eliminar grandes proporciones de lecturas duplicadas, ligaduras de adaptador a adaptador y errores inducidos por PCR.

La matriz modelada de puntos cargados positivamente se fabrica mediante técnicas de fotolitografía y grabado seguidas de modificación química para generar una celda de flujo de secuenciación. Cada punto de la celda de flujo tiene aproximadamente 250 nm de diámetro, están separados por 700 nm (de centro a centro) y permiten una fácil conexión de un solo DNB con carga negativa a la celda de flujo y, por lo tanto, reducen la acumulación insuficiente o excesiva en la celda de flujo.

Luego, la secuenciación se realiza mediante la adición de una sonda de oligonucleótidos que se une en combinación a sitios específicos dentro del DNB. La sonda actúa como un ancla que luego permite que uno de los cuatro nucleótidos marcados, inactivados reversiblemente, se una después de fluir a través de la celda de flujo. Los nucleótidos no unidos se eliminan antes de la excitación láser de las etiquetas adjuntas, luego emiten fluorescencia y las cámaras capturan la señal que se convierte en una salida digital para la llamada de base. La base unida tiene su terminador y etiqueta escindida químicamente al completarse el ciclo. El ciclo se repite con otro flujo de nucleótidos marcados libres a través de la celda de flujo para permitir que el siguiente nucleótido se una y capture su señal.

Secuenciación SÓLIDA

La tecnología SOLiD de Applied Biosystems (ahora una marca de Life Technologies) emplea la secuenciación por ligación. Aquí, un conjunto de todos los oligonucleótidos posibles de una longitud fija se marca de acuerdo con la posición secuenciada. Los oligonucleótidos se hibridan y ligan; la unión preferencial por la ADN ligasa para emparejar secuencias da como resultado una señal informativa del nucleótido en esa posición. Cada base en la plantilla se secuencia dos veces y los datos resultantes se decodifican de acuerdo con el esquema de codificación de 2 bases utilizado en este método. Antes de la secuenciación, el ADN se amplifica mediante PCR en emulsión. Las perlas resultantes, cada una de las cuales contiene copias individuales de la misma molécula de ADN, se depositan en un portaobjetos de vidrio. El resultado son secuencias de cantidades y longitudes comparables a la secuenciación de Illumina.Se ha informado que este método de secuenciación por ligadura tiene algunos problemas para secuenciar secuencias palindrómicas.

Secuenciación de semiconductores Ion Torrent

Ion Torrent Systems Inc. (ahora propiedad de Life Technologies) desarrolló un sistema basado en el uso de química de secuenciación estándar, pero con un novedoso sistema de detección basado en semiconductores. Este método de secuenciación se basa en la detección de iones de hidrógeno que se liberan durante la polimerización del ADN, a diferencia de los métodos ópticos utilizados en otros sistemas de secuenciación. Un micropocillo que contiene una hebra de ADN molde que se va a secuenciar se inunda con un solo tipo de nucleótido. Si el nucleótido introducido es complementario al nucleótido molde principal, se incorpora a la hebra complementaria en crecimiento. Esto provoca la liberación de un ion de hidrógeno que activa un sensor de iones hipersensible, lo que indica que se ha producido una reacción. Si las repeticiones de homopolímero están presentes en la secuencia de la plantilla, se incorporarán múltiples nucleótidos en un solo ciclo. Esto conduce a un número correspondiente de hidrógenos liberados y una señal electrónica proporcionalmente mayor.

Secuenciación de nanobolas de ADN

La secuenciación de nanobolas de ADN es un tipo de tecnología de secuenciación de alto rendimiento que se utiliza para determinar la secuencia genómica completa de un organismo. La empresa Complete Genomics utiliza esta tecnología para secuenciar muestras enviadas por investigadores independientes. El método utiliza la replicación en círculo rodante para amplificar pequeños fragmentos de ADN genómico en nanobolas de ADN. A continuación, se usa la secuenciación no encadenada por ligación para determinar la secuencia de nucleótidos. Este método de secuenciación de ADN permite secuenciar un gran número de nanoesferas de ADN por ejecución y a un bajo costo de reactivos en comparación con otras plataformas de secuenciación de alto rendimiento. Sin embargo, solo se determinan secuencias cortas de ADN de cada nanobola de ADN, lo que dificulta el mapeo de las lecturas cortas en un genoma de referencia.Esta tecnología se ha utilizado para múltiples proyectos de secuenciación del genoma y está previsto que se utilice en más.

Secuenciación de una sola molécula con helicóptero

La secuenciación de helicóptero es un método de secuenciación de una sola molécula desarrollado por Helicos Biosciences. Utiliza fragmentos de ADN con adaptadores de cola poli-A agregados que se unen a la superficie de la celda de flujo. Los siguientes pasos implican la secuenciación basada en la extensión con lavados cíclicos de la celda de flujo con nucleótidos marcados con fluorescencia (un tipo de nucleótido a la vez, como con el método de Sanger). Las lecturas son realizadas por el secuenciador Heliscope. Las lecturas son cortas, con un promedio de 35 pb. Lo que hizo que esta tecnología fuera especialmente novedosa fue que fue la primera de su clase en secuenciar ADN no amplificado, evitando así cualquier error de lectura asociado con los pasos de amplificación. En 2009 se secuenció un genoma humano utilizando el Heliscopio, sin embargo, en 2012 la empresa quebró.

Sistemas Microfluídicos

Hay dos sistemas microfluídicos principales que se utilizan para secuenciar el ADN; microfluídica basada en gotas y microfluídica digital. Los dispositivos microfluídicos resuelven muchas de las limitaciones actuales de las matrices de secuenciación actuales.

Abate et al. estudió el uso de dispositivos de microfluidos basados ​​en gotas para la secuenciación de ADN. Estos dispositivos tienen la capacidad de formar y procesar gotas del tamaño de un picolitro a una velocidad de miles por segundo. Los dispositivos se crearon a partir de polidimetilsiloxano (PDMS) y utilizaron transferencia de energía de resonancia de Forster, ensayos FRET para leer las secuencias de ADN contenidas en las gotas. Cada posición en la matriz probó una secuencia específica de 15 bases.

Justo et al. utilizó dispositivos microfluídicos digitales para estudiar la pirosecuenciación del ADN. Las ventajas significativas incluyen la portabilidad del dispositivo, el volumen de reactivo, la velocidad de análisis, las capacidades de fabricación en masa y el alto rendimiento. Este estudio proporcionó una prueba de concepto que muestra que los dispositivos digitales se pueden utilizar para la pirosecuenciación; el estudio incluyó el uso de síntesis, que implica la extensión de las enzimas y la adición de nucleótidos marcados.

Boles et al. también estudió la pirosecuenciación en dispositivos microfluídicos digitales. Usaron un dispositivo de electrohumectación para crear, mezclar y dividir gotas. La secuenciación utiliza un protocolo de tres enzimas y plantillas de ADN ancladas con perlas magnéticas. El dispositivo se probó con dos protocolos y dio como resultado una precisión del 100 % según los niveles de pirograma sin procesar. Las ventajas de estos dispositivos microfluídicos digitales incluyen el tamaño, el costo y los niveles alcanzables de integración funcional.

La investigación de secuenciación de ADN, utilizando microfluidos, también tiene la capacidad de aplicarse a la secuenciación de ARN, utilizando técnicas microfluídicas de gotas similares, como el método inDrops. Esto muestra que muchas de estas técnicas de secuenciación de ADN podrán aplicarse más y usarse para comprender más sobre genomas y transcriptomas.

Métodos en desarrollo

Los métodos de secuenciación de ADN actualmente en desarrollo incluyen la lectura de la secuencia a medida que una hebra de ADN transita a través de nanoporos (un método que ahora es comercial, pero las generaciones posteriores, como los nanoporos de estado sólido, aún están en desarrollo) y técnicas basadas en microscopía, como microscopía de fuerza atómica o microscopía electrónica de transmisión que se utilizan para identificar las posiciones de nucleótidos individuales dentro de fragmentos largos de ADN (>5000 pb) mediante el marcado de nucleótidos con elementos más pesados ​​(p. ej., halógenos) para la detección visual y el registro. Las tecnologías de tercera generación tienen como objetivo aumentar el rendimiento y disminuir el tiempo de obtención de resultados y el costo eliminando la necesidad de reactivos excesivos y aprovechando la procesividad de la ADN polimerasa.

Corrientes de túnel Secuenciación de ADN

Otro enfoque utiliza mediciones de las corrientes de efecto túnel eléctrico a través del ADN monocatenario a medida que se mueve a través de un canal. Dependiendo de su estructura electrónica, cada base afecta la corriente de tunelización de manera diferente, lo que permite diferenciar entre diferentes bases.

El uso de corrientes de túnel tiene el potencial de secuenciar órdenes de magnitud más rápido que los métodos de corriente iónica y ya se ha logrado la secuenciación de varios oligómeros de ADN y micro-ARN.

Secuenciación por hibridación

La secuenciación por hibridación es un método no enzimático que utiliza una micromatriz de ADN. Un conjunto único de ADN cuya secuencia se va a determinar se marca con fluorescencia y se hibrida con una matriz que contiene secuencias conocidas. Fuertes señales de hibridación de un punto dado en la matriz identifican su secuencia en el ADN que se está secuenciando.

Este método de secuenciación utiliza las características de unión de una biblioteca de moléculas cortas de ADN monocatenario (oligonucleótidos), también llamadas sondas de ADN, para reconstruir una secuencia de ADN objetivo. Los híbridos no específicos se eliminan mediante lavado y se eluye el ADN diana. Los híbridos se reorganizan de modo que la secuencia de ADN se pueda reconstruir. El beneficio de este tipo de secuenciación es su capacidad para capturar una gran cantidad de objetivos con una cobertura homogénea. Por lo general, se requiere una gran cantidad de productos químicos y ADN de partida. Sin embargo, con el advenimiento de la hibridación basada en soluciones, se necesitan muchos menos equipos y productos químicos.

Secuenciación con espectrometría de masas

La espectrometría de masas se puede utilizar para determinar las secuencias de ADN. La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz, o MALDI-TOF MS, se ha investigado específicamente como un método alternativo a la electroforesis en gel para visualizar fragmentos de ADN. Con este método, los fragmentos de ADN generados por reacciones de secuenciación de terminación de cadena se comparan por masa en lugar de por tamaño. La masa de cada nucleótido es diferente a la de los demás y esta diferencia es detectable por espectrometría de masas. Las mutaciones de un solo nucleótido en un fragmento se pueden detectar más fácilmente con MS que solo con electroforesis en gel. MALDI-TOF MS puede detectar más fácilmente las diferencias entre los fragmentos de ARN, por lo que los investigadores pueden secuenciar indirectamente el ADN con métodos basados ​​en MS convirtiéndolo primero en ARN.

La resolución más alta de los fragmentos de ADN que permiten los métodos basados ​​en MS es de especial interés para los investigadores en ciencia forense, ya que pueden desear encontrar polimorfismos de un solo nucleótido en muestras de ADN humano para identificar individuos. Estas muestras pueden estar muy degradadas, por lo que los investigadores forenses a menudo prefieren el ADN mitocondrial por su mayor estabilidad y aplicaciones para estudios de linaje. Se han utilizado métodos de secuenciación basados ​​en MS para comparar las secuencias de ADN mitocondrial humano de muestras en una base de datos de la Oficina Federal de Investigaciones y de huesos encontrados en fosas comunes de soldados de la Primera Guerra Mundial.

Los primeros métodos de terminación de cadena y TOF MS demostraron longitudes de lectura de hasta 100 pares de bases. Los investigadores no han podido superar este tamaño de lectura promedio; Al igual que la secuenciación de terminación de cadena sola, la secuenciación de ADN basada en MS puede no ser adecuada para grandes proyectos de secuenciación de novo. Aun así, un estudio reciente utilizó lecturas de secuencia corta y espectroscopia de masas para comparar polimorfismos de un solo nucleótido en cepas patógenas de Streptococcus.

Secuenciación microfluídica de Sanger

En la secuenciación microfluídica de Sanger, toda la amplificación por termociclado de los fragmentos de ADN, así como su separación por electroforesis, se realiza en una sola oblea de vidrio (de aproximadamente 10 cm de diámetro), lo que reduce el uso de reactivos y el costo. En algunos casos, los investigadores han demostrado que pueden aumentar el rendimiento de la secuenciación convencional mediante el uso de microchips. Todavía será necesario realizar investigaciones para que este uso de la tecnología sea efectivo.

Técnicas basadas en microscopía

Este enfoque visualiza directamente la secuencia de moléculas de ADN usando microscopía electrónica. La primera identificación de pares de bases de ADN dentro de moléculas de ADN intactas mediante la incorporación enzimática de bases modificadas, que contienen átomos de mayor número atómico, visualización directa e identificación de bases marcadas individualmente dentro de una molécula de ADN sintética de 3272 pares de bases y un genoma viral de 7249 pares de bases ha sido demostrado.

Secuenciación RNAP

Este método se basa en el uso de ARN polimerasa (RNAP), que se une a una perla de poliestireno. Un extremo del ADN que se va a secuenciar se une a otra perla, y ambas perlas se colocan en trampas ópticas. El movimiento RNAP durante la transcripción acerca las perlas y cambia su distancia relativa, lo que luego se puede registrar con una resolución de un solo nucleótido. La secuencia se deduce en base a las cuatro lecturas con concentraciones reducidas de cada uno de los cuatro tipos de nucleótidos, de manera similar al método de Sanger. Se realiza una comparación entre regiones y se deduce la información de la secuencia comparando las regiones de secuencia conocidas con las regiones de secuencia desconocida.

Secuenciación de alto rendimiento de virus in vitro

Se ha desarrollado un método para analizar conjuntos completos de interacciones de proteínas utilizando una combinación de pirosecuenciación 454 y un método de visualización de ARNm de virus in vitro. Específicamente, este método une covalentemente las proteínas de interés con los ARNm que las codifican y luego detecta las piezas de ARNm mediante PCR de transcripción inversa. A continuación, el ARNm puede amplificarse y secuenciarse. El método combinado se tituló IVV-HiTSeq y se puede realizar en condiciones sin células, aunque es posible que sus resultados no sean representativos de las condiciones in vivo.

Preparación de la muestra

El éxito de cualquier protocolo de secuenciación de ADN depende de la extracción y preparación de muestras de ADN o ARN a partir del material biológico de interés.

• Una extracción de ADN exitosa producirá una muestra de ADN con hebras largas no degradadas.
• Una extracción de ARN exitosa producirá una muestra de ARN que se debe convertir en ADN complementario (ADNc) utilizando transcriptasa inversa, una ADN polimerasa que sintetiza un ADN complementario basado en hebras de ARN existentes de manera similar a la PCR. Luego, el ADN complementario se puede procesar de la misma manera que el ADN genómico.

Según la tecnología de secuenciación que se utilice, las muestras resultantes de la extracción de ADN o de ARN requieren una preparación adicional. Para la secuenciación de Sanger, se requieren procedimientos de clonación o PCR antes de la secuenciación. En el caso de los métodos de secuenciación de próxima generación, se requiere la preparación de la biblioteca antes del procesamiento. La evaluación de la calidad y la cantidad de ácidos nucleicos después de la extracción y después de la preparación de la biblioteca identifica muestras degradadas, fragmentadas y de baja pureza y produce datos de secuenciación de alta calidad.

La naturaleza de alto rendimiento de las tecnologías actuales de secuenciación de ADN/ARN ha planteado un desafío para la ampliación del método de preparación de muestras. Se están utilizando varios instrumentos de manipulación de líquidos para la preparación de un mayor número de muestras con un tiempo de manipulación total más bajo:

empresa	Manipuladores de líquidos / Automatización	marca_inferior_USD	marca_superior_USD	landing_url
Opentrones	OpenTrons OT-2	$5,750	$20,000	https://www.opentrons.com/
Gilson	Pipet max Gilson	$20,000	$40,000	https://gb.gilson.com/GBSV/system-pipetmax.html
Neotec	EzMate de Neotec	$25,000	$45,000	http://neotec.co.il/pipetting-device/
Formulatrix	Formulatrix Mantis	$40,000	$60,000	https://formulatrix.com/sistemas-de-manejo-de-liquidos/mantis-liquid-handler/
robótica hudson	Hudson Robótica SOLO	$40,000	$50,000	https://hudsonrobotics.com/products/applications/automated-solutions-next-generation-sequencing-ngs/
hamilton	Microlaboratorio Hamilton NIMBUS	$40,000	$80,000	https://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/platforms/microlab-nimbus#specifications
TTP Labtech	TTP Labtech Mosquito HV Genómica	$45,000	$80,000	https://www.sptlabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hv-genomics/
Beckman Coulter	Biomek 4000	$50,000	$65,000	https://www.mybeckman.uk/liquid-handlers/biomek-4000/b22640
hamilton	STARlet genómico de Hamilton	$50,000	$100,000	https://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/assay-ready-workstations/genomic-starlet
Eppendorf	Eppendorf epMotion 5075t	$95,000	$110,000	https://www.eppendorf.com/epmotion/
Beckman Coulter	Beckman Coulter Biomek i5	$100,000	$150,000	https://www.beckman.com/liquid-handlers/biomek-i5
hamilton	Hamilton NGS ESTRELLA	$100,000	$200,000	http://www.hamiltonrobotics.com/
perkinelmer	Estación de trabajo PerkinElmer Sciclone G3 NGS y NGSx	$150,000	$220,000	https://www.perkinelmer.com/uk/product/sciclone-g3-ngs-workstation-cls145321
agilent	Agilent Bravo NGS	$170,000	$290,000	https://www.agilent.com/en/products/automated-liquid-handling/automated-liquid-handling-applications/bravo-ngs
Beckman Coulter	Beckman Coulter Biomek i7	$200,000	$250,000	https://www.beckman.com/liquid-handlers/biomek-i7
Labcyte eco 525	Beckman Coulter Labcyte Echo 525	$260,000	$300,000	https://www.labcyte.com/products/liquid-handling/echo-525-liquid-handler
Tecano	Tecan NGS	$270,000	$350,000	https://lifesciences.tecan.com/ngs-sample-preparation

Iniciativas de desarrollo

En octubre de 2006, la Fundación X Prize estableció una iniciativa para promover el desarrollo de tecnologías de secuenciación del genoma completo, llamada Archon X Prize, con la intención de otorgar $ 10 millones al "primer equipo que pueda construir un dispositivo y usarlo para secuenciar 100 genomas humanos". dentro de 10 días o menos, con una precisión de no más de un error en cada 100 000 bases secuenciadas, con secuencias que cubran con precisión al menos el 98 % del genoma y a un costo recurrente de no más de $10 000 (US) por genoma".

Cada año, el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano, o NHGRI, promueve subvenciones para nuevas investigaciones y desarrollos en genómica. Las becas de 2010 y los candidatos de 2011 incluyen trabajo continuo en metodologías de secuenciación de microfluidos, polonia y base pesada.

Desafíos computacionales

Las tecnologías de secuenciación descritas aquí producen datos sin procesar que deben ensamblarse en secuencias más largas, como genomas completos (ensamblaje de secuencias). Hay muchos desafíos computacionales para lograr esto, como la evaluación de los datos de secuencia sin procesar que se realiza mediante programas y algoritmos como Phred y Phrap. Otros desafíos tienen que ver con secuencias repetitivas que a menudo impiden ensamblajes completos del genoma porque ocurren en muchos lugares del genoma. Como consecuencia, muchas secuencias pueden no estar asignadas a cromosomas particulares. La producción de datos de secuencia sin procesar es solo el comienzo de su análisis bioinformático detallado. Sin embargo, se desarrollaron nuevos métodos para secuenciar y corregir errores de secuenciación.

Leer recorte

A veces, las lecturas sin procesar producidas por el secuenciador son correctas y precisas solo en una fracción de su longitud. El uso de la lectura completa puede introducir artefactos en los análisis posteriores, como el ensamblaje del genoma, la llamada de SNP o la estimación de la expresión génica. Se han introducido dos clases de programas de recorte, basados ​​en las clases de algoritmos basados ​​en ventanas o de suma en ejecución. Esta es una lista parcial de los algoritmos de recorte actualmente disponibles, especificando la clase de algoritmo a la que pertenecen:

Nombre del algoritmo	Tipo de algoritmo	Enlace
Cuadapt	Suma corriente	Cuadapt
ConDeTri	basado en ventana	ConDeTri
ERNE-FILTRO	Suma corriente	ERNE-FILTRO
Recortadora de calidad FASTX	basado en ventana	Recortadora de calidad FASTX
PRINSEQ	basado en ventana	PRINSEQ
Trimmomatic	basado en ventana	Trimmomatic
SolexaQA	basado en ventana	SolexaQA
SolexaQA-BWA	Suma corriente	SolexaQA-BWA
Hoz	basado en ventana	Hoz

Cuestiones éticas

La genética humana se ha incluido en el campo de la bioética desde principios de la década de 1970 y el aumento en el uso de la secuenciación del ADN (en particular, la secuenciación de alto rendimiento) ha introducido una serie de cuestiones éticas. Una cuestión clave es la propiedad del ADN de un individuo y los datos producidos cuando se secuencia ese ADN. Con respecto a la molécula de ADN en sí, el principal caso legal sobre este tema, Moore v. Regents of the University of California (1990) dictaminó que las personas no tienen derechos de propiedad sobre las células desechadas ni ganancias obtenidas con el uso de estas células (por ejemplo, como producto patentado). línea celular). Sin embargo, las personas tienen derecho al consentimiento informado con respecto a la extracción y el uso de células. En cuanto a los datos producidos a través de la secuenciación del ADN, Mooreno otorga al individuo ningún derecho sobre la información derivada de su ADN.

A medida que la secuenciación del ADN se generaliza, el almacenamiento, la seguridad y el intercambio de datos genómicos también se vuelven más importantes. Por ejemplo, una preocupación es que las aseguradoras pueden usar los datos genómicos de un individuo para modificar su cotización, dependiendo de la salud futura percibida del individuo en función de su ADN. En mayo de 2008, se firmó en los Estados Unidos la Ley de No Discriminación por Información Genética (GINA), que prohíbe la discriminación basada en la información genética con respecto al seguro de salud y el empleo.En 2012, la Comisión Presidencial para el Estudio de Asuntos Bioéticos de EE. UU. informó que la legislación de privacidad existente para los datos de secuenciación de ADN como GINA y la Ley de Portabilidad y Responsabilidad de Seguros Médicos eran insuficientes, y señaló que los datos de secuenciación del genoma completo eran particularmente sensibles, ya que podrían utilizarse para identificar no solo a la persona a partir de la cual se crearon los datos, sino también a sus familiares.

In most of the United States, DNA that is "abandoned", such as that found on a licked stamp or envelope, coffee cup, cigarette, chewing gum, household trash, or hair that has fallen on a public sidewalk, may legally be collected and sequenced by anyone, including the police, private investigators, political opponents, or people involved in paternity disputes. As of 2013, eleven states have laws that can be interpreted to prohibit "DNA theft".

Ethical issues have also been raised by the increasing use of genetic variation screening, both in newborns, and in adults by companies such as 23andMe. It has been asserted that screening for genetic variations can be harmful, increasing anxiety in individuals who have been found to have an increased risk of disease. For example, in one case noted in Time, doctors screening an ill baby for genetic variants chose not to inform the parents of an unrelated variant linked to dementia due to the harm it would cause to the parents. However, a 2011 study in The New England Journal of Medicine has shown that individuals undergoing disease risk profiling did not show increased levels of anxiety.